郭 玲,蔣杰賢,楊 安,季香云,張 浩,萬年峰?

(1上海市農(nóng)業(yè)科學院生態(tài)環(huán)境保護研究所,上海201403;2上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海201306)

圍食膜為一層包裹著食物的非細胞長管狀的薄膜結(jié)構(gòu),由昆蟲中腸上皮細胞分泌,能抵御有毒有害物質(zhì)的侵害。據(jù)報道,圍食膜是一種功能性的抗氧化劑,保護中腸上皮細胞免受嚴重的氧化性損傷[1-2]。桿狀病毒是鱗翅目昆蟲的重要病原微生物,通過與昆蟲圍食膜上的特異位點結(jié)合破壞圍食膜結(jié)構(gòu),進而提高病毒對昆蟲的致病力。桿狀病毒作用于昆蟲圍食膜后,后者的結(jié)構(gòu)、功能與生理特征會發(fā)生變化。鑒于此,本文對圍食膜的功能、桿狀病毒對圍食膜的影響以及影響桿狀病毒感染性的干擾因子進行簡要歸納,以期為桿狀病毒與昆蟲圍食膜的互作研究提供參考。

1 圍食膜的結(jié)構(gòu)與類型

1.1 圍食膜組成與結(jié)構(gòu)

圍食膜主要由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和多糖組成。圍食膜上的蛋白質(zhì)主要以糖蛋白的形式存在,能增強圍食膜的半滲透性和致密性,其含量在所有組分中最高(占20%—55%)。根據(jù)蛋白質(zhì)提取的難易程度,將其分為4類：1)在高或低濃度的鹽溶液中易移除的蛋白[3];2)能夠被溫和去垢劑去除的蛋白[3];3)以非共價鍵結(jié)合,需要強變性劑才能將其洗脫的蛋白;4)以共價鍵的形式結(jié)合在圍食膜上的蛋白。其中,第4類蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好,在前3種蛋白質(zhì)的提取條件下,不能被移除[4]。

幾丁質(zhì)在圍食膜中的含量也比較高(占4%—20%)。經(jīng)幾丁質(zhì)合成酶的作用,該物質(zhì)由N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)借助β-(1,4)糖苷鍵形成[5],可分為α、β和γ 3種形式。此外,圍食膜中還含有少量的多糖。多糖往往決定圍食膜的致密性,其含量因昆蟲種類不同而有所差異。如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)圍食膜中糖含量分別占2.05%[6]和8.91%[7]。

電鏡觀察視野下發(fā)現(xiàn)：10根(或大于10根)同向排列的幾丁質(zhì)微纖絲耦合成微管微纖絲束,多個微管微纖絲束又進一步耦合形成圍食膜[8-9];一般情況下,幾丁質(zhì)微纖絲以60°或90°交叉形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但有時也以其他形式交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中塞滿著蛋白質(zhì)和糖類[10]。

1.2 圍食膜類型

根據(jù)合成位點的差異,可將圍食膜分為Ⅰ型和Ⅱ型[2]。鱗翅目和一些直翅目幼蟲的圍食膜大多屬于Ⅰ型,該類型的結(jié)構(gòu)為多層重疊管狀,由中腸上皮細胞經(jīng)腸腔分泌而成。Ⅱ型圍食膜多存在于雙翅目、革翅目、等翅目以及一些鱗翅目幼蟲中,由昆蟲的前腸和中腸連接處的特殊結(jié)構(gòu)——賁門環(huán)狀細胞分泌形成。觀察發(fā)現(xiàn),Ⅱ型圍食膜比Ⅰ型更加規(guī)則有序[11]。

昆蟲取食不同食物后,其圍食膜形成與類型往往也會發(fā)生變化,尤其有毒有害的液體食物(即對昆蟲生長發(fā)育不利)對昆蟲圍食膜影響較為明顯。研究發(fā)現(xiàn),取食血液等無菌或者少菌液體食物的昆蟲,一般不會形成圍食膜,而攝取污染程度高的食物(如糞便、腐爛水果)的昆蟲,則會保留圍食膜[12]。此外,有些圍食膜的類型與其發(fā)育階段有關,如蚊幼蟲期的圍食膜為Ⅱ型,而雌性成蟲卻為Ⅰ型。有的昆蟲圍食膜類型與其發(fā)育階段無關,如紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)幼蟲期的圍食膜類型與成蟲期的相同[13]。有研究表明,圍食膜的厚薄程度與昆蟲取食的食物種類有關,并且圍食膜的厚度決定著昆蟲防御病原物入侵的能力,如取食葉片的鱗翅目幼蟲圍食膜比取食飼料的厚,且前者具有較低的病毒感染率和死亡率[14]。

2 圍食膜的功能

2.1 機械保護

雖然圍食膜是外界病原菌侵入的重要位點,但同時它也具有防止微生物入侵的功能。圍食膜上存在類凝膠功能的物質(zhì),具有潤滑作用,該類物質(zhì)能夠使食物順利通過中腸,避免昆蟲因食用大顆粒物質(zhì)而引起中腸漲裂[15]。研究發(fā)現(xiàn),圍食膜的糖位點可與病原微生物發(fā)生吸附作用,進而阻止病原物破壞中腸上皮細胞[16]。如家蠶(Bombyx mori)幼蟲的圍食膜對桿狀病毒具有一定的抵御能力,在一定程度上保護了中腸上皮細胞免受病毒破壞;當家蠶幼蟲圍食膜被降解后,桿狀病毒對其中腸細胞破壞嚴重[17]。此外,圍食膜機械保護作用還受其他一些化學物質(zhì)影響。如剛果紅可與蛋白質(zhì)競爭性結(jié)合幾丁質(zhì),致使圍食膜功能發(fā)生暫時性紊亂。

2.2 化學保護

圍食膜不僅能阻止中腸細胞對金屬離子的吸收,而且能將其排出體外。如Abedi等[18]用殺蟲劑DDT處理埃及伊蚊(Aedes aegypti)幼蟲后,發(fā)現(xiàn)大量的圍食膜被排出體外,這可能是圍食膜與有毒物質(zhì)結(jié)合,產(chǎn)生螯合作用的結(jié)果。研究證實,昆蟲圍食膜的黏蛋白可以消除重金屬離子的危害,但某些幼蟲對重金屬離子反應敏感,如岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)圍食膜受銅和鎘影響強烈[19]。此外,昆蟲圍食膜對植物釋放的有毒有害物質(zhì)也具有抵御作用。

2.3 選擇透性

圍食膜是一種具有選擇透性的薄膜,其選擇透性與其孔膜結(jié)構(gòu)、食物通過圍食膜速度等有關。研究表明,鱗翅目和直翅目昆蟲圍食膜的孔徑分別為21—29 nm和24—36 nm,食物通過圍食膜的流量分別為32—159 ng∕h和98—2 821 ng∕h[20]。圍食膜能夠從中腸上皮細胞中分離大部分的單寧酸和其他異種化感物質(zhì),但卻允許其他小分子(酚類物質(zhì)、營養(yǎng)物和消化酶)進入。有研究發(fā)現(xiàn),幾丁質(zhì)酶能夠破壞圍食膜結(jié)構(gòu),幾丁質(zhì)酶作用時間越長,圍食膜損害就越大,選擇透過性也越低[21]。圍食膜的通透性與蛋白多糖的抗擊壓性能和幾丁質(zhì)纖維絲彈性有關,也與中腸的位置有關[22]。據(jù)報道,低溫使圍食膜產(chǎn)生孔洞和縫隙,進而使其通透性發(fā)生變化[9]。某些昆蟲的圍食膜組分存在性二型現(xiàn)象,如雄性刺舌蠅(Glossina morsitans)圍食膜的通透性較雌性的高[23]。外源凝集素分子能干擾圍食膜的通透性,這些物質(zhì)與圍食膜蛋白、幾丁質(zhì)或昆蟲中腸上皮細胞表面的糖基化位點結(jié)合,從而使圍食膜通透性降低。

2.4 區(qū)室化作用

位于昆蟲中腸內(nèi)部的圍食膜,將腸腔分為內(nèi)外兩個空間——圍食膜內(nèi)空間和外空間。圍食膜相當于一個分子篩,可使一些消化酶(如分子量較小的淀粉酶)和已被消化完全的營養(yǎng)物質(zhì)透過,而將一些物質(zhì)(如分子量較大的氨肽酶和羧肽酶)阻擋在外間隙內(nèi)。經(jīng)圍食膜消化產(chǎn)生的小分子物質(zhì)(如寡糖和多肽等),可與消化酶再次發(fā)生作用而進行二次消化。據(jù)報道,腸腔的區(qū)室化加快了營養(yǎng)物質(zhì)在其內(nèi)外的流動,可使營養(yǎng)物質(zhì)容易被消化分離,從而提高中腸吸收營養(yǎng)的效率。在食物流向圍食膜后方的過程中,食物流的方向與圍食膜外側(cè)液的流向相反,該流動方式可以提高消化酶利用率和食物消化率,有利于保存營養(yǎng)物質(zhì)[12]。

2.5 其他功能

圍食膜還具其他兩個功能：一是抗氧化作用,如保護昆蟲中腸上皮細胞免受氧化劑的損傷[1];二是促使繭的形成,如在結(jié)繭前,裸蛛甲(Gibbium psylloides)幼蟲的圍食膜是解離的,結(jié)繭后,從肛門排出絲狀物[24]。

3 桿狀病毒對圍食膜的影響

3.1 改變物理結(jié)構(gòu)

圍食膜具有多孔性,允許水、鹽等小分子通過,卻將一些較大的入侵物(細菌、病毒顆粒體等)拒之門外。核型多角體病毒感染斜紋夜蛾(Spodoptera litura)幼蟲的研究表明[25],桿狀病毒能破壞昆蟲圍食膜結(jié)構(gòu),致使圍食膜孔徑增大、膜破裂。此外,桿狀病毒與增效蛋白的聯(lián)合作用對昆蟲圍食膜結(jié)構(gòu)的破壞更加明顯。如劉琴等[26]研究發(fā)現(xiàn),甜菜夜蛾幼蟲經(jīng)黏蟲顆粒體病毒(PuGv-Ps)和增效蛋白(Enhancin)共同處理后,圍食膜由原來的表面光滑逐漸表現(xiàn)為粗糙凸起,以致破損降解。蟲媒病毒感染白紋伊蚊(Aedes albopictus)的研究表明[27-28],昆蟲圍食膜也能抵御病毒的侵害,可以將病毒顆粒體緊緊包裹,減少病毒與中腸接觸的空間,進而降低病毒感染的幾率。

3.2 影響化學成分

桿狀病毒感染昆蟲后,對圍食膜結(jié)構(gòu)蛋白影響最大,如感染桿狀病毒后,黏蟲(Mythimna separata)圍食膜蛋白丟失,進而引起圍食膜滲透性發(fā)生變化[17]。此外,病毒增效蛋白能助推桿狀病毒對圍食膜蛋白的破壞,降解圍食膜中一種分子量較大的糖蛋白。如棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)的增效蛋白能將棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)圍食膜蛋白HaIIM86降解為70 ku和90 ku兩個多肽[22]。但Shi等[29]研究表明,蓓帶夜蛾桿狀病毒(MacoMNPV)增效蛋白對蓓帶夜蛾(Mamestra configurata)圍食膜蛋白McMUC4無影響。桿狀病毒對昆蟲圍食膜蛋白的影響已受關注,但桿狀病毒如何調(diào)控圍食膜上的幾丁質(zhì)和多糖還有待進一步探討。

3.3 調(diào)控蛋白基因

迄今,桿狀病毒對昆蟲圍食膜蛋白基因的影響研究主要集中于幾丁質(zhì)蛋白基因。如Levy等[30]研究發(fā)現(xiàn),梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)感染核型多角體病毒(AgMNPV)后,抗AgMNPV品系的幾丁質(zhì)蛋白含量較敏感品系的高;Jakubowska等[31]報道,棉鈴蟲感染棉鈴蟲多角體病毒(HearNPV)后,中腸幾丁質(zhì)去乙?；窰aCDA5a表達量下降。蛋白基因維系著昆蟲圍食膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,若這種穩(wěn)定性被破壞,圍食膜的結(jié)構(gòu)與功能也將會受到嚴重影響。研究顯示,家蠶(Bombyx mori)被核型多角體病毒(BmNPV)感染后,其絲氨酸蛋白酶基因的表達量在感染后早期顯著上調(diào)[32],究其原因,該基因與絲氨酸蛋白酶2(簡稱“BmSP-2”,一種具有強大抗BmNPV活性的蛋白基因)具有高度相似性。多糖也是圍食膜的重要組成部分,合成多糖的酶系基因如何響應桿狀病毒的感染有待進一步研究。

4 影響桿狀病毒對圍食膜感染性的干擾因子

4.1 病毒增效蛋白

昆蟲病毒增效蛋白是一種富含酸性氨基酸的金屬蛋白酶,主要存在于病毒顆粒中。雖然增效蛋白含糖量不高,但具有較多與圍食膜蛋白因子結(jié)合的糖基化位點,該位點使病毒粒子易穿過圍食膜,造成圍食膜降解。昆蟲病毒增效蛋白能夠促進病毒對昆蟲的感染,其作用機理主要有：1)病毒增效蛋白破壞圍食膜蛋白上的糖基化位點和蛋白之間的二硫鍵,以及破壞幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物,進而使圍食膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;2)增效蛋白金屬蛋白酶能降解圍食膜的腸黏蛋白,有利于病毒粒子進入中腸,并且避免病毒被腸液消化或排出體外;3)增效蛋白金屬蛋白酶有利于病毒核衣殼與細胞膜的吸附融合,加速病毒感染昆蟲進程[33]。研究發(fā)現(xiàn),病毒增效蛋白能明顯增加病毒致病力,如TnGV與增效蛋白聯(lián)合作用于粉紋夜蛾[Plusia ni(Hubner)]幼蟲后,幼蟲病亡率隨增效蛋白劑量的增加而增加[34]。

4.2 熒光增白劑

熒光增白劑能夠吸收紫外線,發(fā)射415—466 nm波長的熒光[35]。該物質(zhì)能增強病毒致病力,加快昆蟲病亡。健康昆蟲圍食膜表面光滑、有彈性、無孔洞縫隙,由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)以共價鍵的形式組成。當熒光增白劑作用于圍食膜后,其與蛋白質(zhì)發(fā)生競爭結(jié)合,破壞共價鍵,破解圍食膜結(jié)構(gòu),進而便于病毒感染。熒光增白劑的作用時間和作用劑量影響圍食膜結(jié)構(gòu)[36],如甜菜夜蛾取食混有1%熒光增白劑的食物后4 h,圍食膜形態(tài)無變化,而6 h后,圍食膜彈性逐漸下降;當甜菜夜蛾的食物源替換為0.1%熒光增白劑時,其圍食膜結(jié)構(gòu)的變化較1%熒光增白劑處理的小,并且在每個處理后時間點都表現(xiàn)這種趨勢。

4.3 幾丁質(zhì)酶及幾丁質(zhì)合成抑制劑

幾丁質(zhì)酶是一種催化幾丁質(zhì)水解生成N-乙酰葡糖胺反應的酶,由N-催化域、中部富含Ser∕Thr區(qū)和C-端富含Cys的幾丁質(zhì)結(jié)合域組成[37],能夠提高桿狀病毒對昆蟲的致病力,其作用機理為：通過降解圍食膜幾丁質(zhì),致使圍食膜結(jié)構(gòu)破壞、形成孔洞縫隙,進而使病毒顆粒體更易穿過圍食膜,侵入中腸上皮細胞,加速幼蟲病亡。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)幾丁質(zhì)酶處理的圍食膜,其結(jié)構(gòu)出現(xiàn)孔洞縫隙,圍食膜結(jié)構(gòu)的損壞程度隨處理后時間的延長而加重,并且對圍食膜蛋白質(zhì)和糖含量也有一定影響。如黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)幼蟲的圍食膜在灰色鏈酶菌(Streptomyces griseus)幾丁質(zhì)酶的作用下,結(jié)構(gòu)變松散,并且出現(xiàn)了孔洞和縫隙[38]。幾丁質(zhì)合成抑制劑能提高桿狀病毒對昆蟲的致病力,這類物質(zhì)主要包括?；孱惡袜玎和?該類物質(zhì)不僅能阻止幾丁質(zhì)合成,還減弱了膜蛋白O-糖苷鍵對圍食膜腸黏蛋白的保護作用[39]。通過改變幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)合成抑制劑與桿狀病毒對昆蟲圍食膜的聯(lián)合作用效果,有助于研發(fā)新型殺蟲劑[40]。

4.4 其他因子

影響桿狀病毒對圍食膜感染性的干擾因子還與昆蟲消化道酸堿度、食性、種類等有關。桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因參與降解中腸圍食膜幾丁質(zhì)[41],若昆蟲腸道pH值過高或過低,幾丁質(zhì)酶活性均會受到抑制,進而降低病毒對昆蟲的致病力[42-43]。與取食卷心萵苣和人工飼料的感毒煙芽夜蛾(Heliothis virescens)幼蟲相比,取食棉花葉片的幼蟲對核型多角體病毒(AcMNPV)的易感性較弱[44]。昆蟲圍食膜上的腸黏蛋白具有保護中腸上皮細胞免受外源病原物侵害的能力,其含量因昆蟲種類不同而不同。有研究表明,棉鈴蟲腸黏蛋白含量較甜菜夜蛾的高,使得病毒對前者的致病力較后者弱[45-46]。

5 展望

綜上,圍食膜與桿狀病毒互作研究已成為科學家們普遍關注的焦點。然而,筆者認為,該方面的理論研究還有待深入挖掘,如探討昆蟲被桿狀病毒感染后,圍食膜功能基因、細胞凋亡caspase基因、抗菌肽gloverin基因表達量和圍食膜結(jié)構(gòu)特征的差異。此外,從應用角度出發(fā),鑒于腸黏蛋白和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在昆蟲免疫中的功能,可以研發(fā)以圍食膜蛋白等生物大分子為靶標的新型殺蟲劑,開創(chuàng)一個通過控制昆蟲中腸來解決蟲害的新方法。

迄今,昆蟲圍食膜與桿狀病毒的互作關系,主要是基于昆蟲-病毒兩營養(yǎng)級水平,若從“植物-昆蟲-病毒”三營養(yǎng)級關系探討它們之間的關系[47],將有助于拓寬該方面的研究內(nèi)容。據(jù)報道,植物中的幾丁質(zhì)酶、植物凝集素等化學物質(zhì)會干擾昆蟲圍食膜的結(jié)構(gòu)及其生理功能[48],為此,研究該類化學物質(zhì)調(diào)控昆蟲圍食膜對桿狀病毒的響應效果,具有重要意義。最近,筆者所在團隊研究發(fā)現(xiàn),取食不同寄主植物后,昆蟲(甜菜夜蛾幼蟲)圍食膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化,這些變化如何與桿狀病毒的感染產(chǎn)生聯(lián)系,有待進一步探討。