汪英英，胡兆農(nóng)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌　712100；2.陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點實驗室，陜西楊凌　712100)

杠柳新苷P和E對粘蟲和小地老虎中腸3種解毒酶的影響

汪英英1,2，胡兆農(nóng)1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院 農(nóng)藥研究所，陜西楊凌712100；2.陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點實驗室，陜西楊凌712100)

摘要為進一步探討杠柳新苷類化合物在昆蟲體內(nèi)的代謝機制。比較研究高活性杠柳新苷P(Periploca sepium P，PSP)和無殺蟲活性的杠柳新苷E(Periploca sepium E，PSE)對6齡粘蟲幼蟲(Mythimna separata)與小地老虎幼蟲(Agrotis ypsilon)中腸3種代謝酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、細胞色素P450-O-脫甲基酶]活性的影響。結(jié)果表明：藥后8 h，PSP和PSE使粘蟲幼蟲GST活性增加，但PSP上升趨勢比PSE更高。而2種化合物對試蟲CarE活性均無明顯影響。藥后12 h，PSP和PSE使粘蟲中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶酶比活力顯著下降，而小地老虎中該酶活性無明顯變化。因此，可推測GST可能參與昆蟲對杠柳毒素的解毒作用，而細胞色素P450-O-脫甲基酶活性被杠柳毒素抑制可能是造成粘蟲中毒的機制之一。關(guān)鍵詞杠柳新苷；粘蟲；小地老虎；中腸；解毒酶

杠柳作為中國民間流傳的一種土農(nóng)藥，其根皮提取物已被研究證實可作為控制一些鱗翅目害蟲的殺蟲劑，包括小菜蛾、菜粉蝶、粘蟲等[1-3]。近期，西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥研究所報道杠柳根皮中一些具有殺蟲活性的孕糖苷骨架化合物，如杠柳新苷P(PSP)、杠柳新苷T、杠柳新苷NW等[4-7]。通過對這一系列化合物的生物決定，結(jié)果表明，PSP對3齡粘蟲幼蟲48 h的半數(shù)致死濃度(LC50)為110 mg/L，但對小地老虎無活性。杠柳新苷E(PSE)是除1個取代基不同外與PSP具相同分子結(jié)構(gòu)的化合物(圖1)[8]，對粘蟲和小地老虎均無作用。而昆蟲中腸作為分泌消化酶和其他酶類的主要部位，起著消化食物和吸收養(yǎng)分的重要作用，也是病原微生物、農(nóng)藥和各種毒素的作用靶標(biāo)。同時昆蟲中腸也是其體內(nèi)主要的解毒部位，其中酯酶、細胞色素P450和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)作為昆蟲參與各種內(nèi)源和外源化合物代謝的重要解毒酶，與植物外源化合物的降解和清除有關(guān)，尤其是昆蟲體內(nèi)的農(nóng)藥代謝，這些解毒酶發(fā)揮著極其重要的作用[9-11]。

外源性化學(xué)物質(zhì)引起昆蟲解毒酶活性變化可能會造成昆蟲代謝紊亂，并影響其正常的生理生化過程[12]。目前，關(guān)于杠柳新苷類化合物對昆蟲代謝酶系的影響報道較少，為進一步探討杠柳新苷類化合物在昆蟲體內(nèi)的代謝機制，本試驗通過對比研究具有殺蟲活性的化合物PSP和不具有殺蟲活性的化合物PSE對粘蟲和小地老虎幼蟲中腸羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和細胞色素P450-O-脫甲基酶3種解毒酶活性的影響，以期初步明確杠柳新苷類化合物在昆蟲體內(nèi)的代謝機制，為進一步研究其作用機制奠定基礎(chǔ)。

杠柳新苷P Periplocoside P: R= H

1材料與方法

1.1供試昆蟲

粘蟲(Mythimnaseparate)和小地老虎(Agrotisypsilon) 6齡幼蟲，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥研究所提供。常規(guī)方法飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲室內(nèi)溫度為22～25 ℃、相對濕度為70%～80%，分別以小麥、甘藍葉飼喂粘蟲和小地老虎幼蟲。試驗時挑取整齊一致的6齡試蟲。

1.2主要儀器及試劑

TGL-16G-A型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DY89-Ⅰ型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，MK3型酶標(biāo)儀(美國熱電上海儀器有限公司)，756MC型紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，420A型電熱恒溫水箱(北京科偉永鑫實驗儀器設(shè)備廠)，杠柳新苷P和E(純度>95%)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥研究所自行制備提供。

毒扁豆堿、1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)、谷胱甘肽(GSH)、NADPH、對硝基茴香醚(p-NA)均購自SIGMA公司。

EDTA、苯甲基硫酰氟(PMSF)、丙基硫氧嘧啶(PTU)、α-醋酸萘酯、α-萘酚、十二烷基磺酸鈉(SDS)、堅牢藍B、蛋白質(zhì)定量試劑盒均為國產(chǎn)生化試劑。

1.3試蟲處理

采用載毒葉片飼喂法，挑選生長發(fā)育一致的6齡粘蟲和小地老虎于24孔板中，每孔放置1頭，饑餓24 h，分處理藥劑組和溶劑對照組。處理組分別點涂1 μL含2 g/L PSP或2 g/L PSE丙酮溶液于小麥和甘藍葉片(約0.5 cm × 0.5 cm)上，小麥葉片飼喂粘蟲，甘藍葉片飼喂小地老虎，待丙酮揮發(fā)后，將小麥葉片放入24孔板中，每頭試蟲1張葉片。對照組試蟲，飼喂點涂1 μL丙酮的葉片。分別取取食后2、4、8、12、24和48 h的藥劑處理試蟲及對照試蟲各10頭，用于酶液制備。每處理重復(fù)3 次。

1.4酶液制備

各供試試蟲在冰袋上迅速解剖，用預(yù)冷的0.15 mol/L NaCl溶液沖去體液，截取中腸，去除胃食膜供試。GST活性測定酶液制備：將供試的中腸組織于預(yù)冷的玻璃勻漿器中，加入少量預(yù)冷的0.1 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液(含有φ=15%甘油，2 mmol/L EDTA)，冰上勻漿，10 000×g，4 ℃冷凍離心20 min。CarE活性測定酶液制備：將供試的中腸組織在0.04 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)冰上勻漿，12 000×g，4 ℃冷凍離心15 min。細胞色素P450-O-脫甲基酶活性測定酶液制備：將供試的中腸于0.1 mol/L pH 7.5磷酸鈉緩沖液(φ=10% 甘油，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L PTU，1 mmol/L EDTA)冰上勻漿，10 000 ×g，4 ℃冷凍離心20 min。所有上清液置于離心管中，立即用作相關(guān)檢測。

1.5酶活性測定

參照Booth等[13]的方法測定GST活性。CDNB為底物，反應(yīng)體系包括：酶液、CDNB和GSH，室溫下測定340 nm時反應(yīng)5 min 內(nèi)變化。消光系數(shù)為9.5 L/(mmol·cm)。

參照Asperen[14]的方法測定CarE活性。該反應(yīng)體系包括：酶液、α-醋酸萘酯(含0.3 mmol/L毒扁豆堿)和顯色液，顯色30 min后，于595 nm比色。根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，以每分鐘水解生成的α-萘酚的量nmol/(mg·min)作為CarE酶比活力。

參照Hansen等[15]的方法測定細胞色素P450-O-脫甲基酶活性。反應(yīng)體系包括：酶液、對硝基苯甲醚、NADPH及磷酸鈉緩沖液。振搖30 min后，加鹽酸終止反應(yīng)，然后用CHCl3萃取產(chǎn)物硝基苯酚，3 000 ×g離心15 min。用NaOH反萃取氯仿餾分，405 nm下測定NaOH餾分的吸光度。

1.6蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定

蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定參照Bradford[16]的方法，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 17.0(SPSS Inc., Chicago, IL)對試驗數(shù)據(jù)進行分析。獨立樣本t-test法進行顯著性差異分析，P<0.05水平為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1杠柳新苷P和E對粘蟲幼蟲中腸和小地老虎幼蟲中腸GST活性的影響

圖2為杠柳新苷P(PSP)和E(PSE)對6齡粘蟲幼蟲和6齡小地老虎幼蟲中腸GST酶比活性的影響。粘蟲取食杠柳新苷P和E處理葉片8 h 后，中腸GST酶比活力開始逐漸增加。在PSP處理粘蟲幼蟲12、24和48 h后，中腸GST酶比活力處理組與對照組差異顯著，處理組比對照組增加17.95%，29.19%和36.90%。PSE處理粘蟲幼蟲24和48 h后，中腸GST酶比活力處理組與對照組差異顯著，處理組比對照組增加14.24%和20.61%(圖2-A)。由圖2-B可知，PSP和PSE對小地老虎中腸GST酶比活力均無顯著影響。PSP處理小地老虎幼蟲中腸GST酶比活力僅在2 h增加7.96%，隨后各時間點處理組與對照組酶比活力無顯著差異。由此可知PSP對粘蟲中腸GST酶比活力的影響比PSE影響較大，進一步說明粘蟲幼蟲對PSP表現(xiàn)的更為敏感。

2.2杠柳新苷P和E對粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲中腸CarE活性的影響

由圖3可知，杠柳新苷P和E處理6齡粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲后，與對照相比，僅處理48 h后，粘蟲幼蟲中腸CarE酶比活力相應(yīng)增加12.16% 和9.55%，與對照組存在顯著差異 (圖3-A)。由圖3-B可知，2種化合物處理小地老虎幼蟲后，中腸CarE酶比活力與對照組無顯著差異。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同

Different lowercase letters show significant difference(P<0.05),different uppercase letters show extremely significant difference(P<0.01).The same as below

圖2杠柳新苷P和E處理6齡粘蟲幼蟲(A)和小地老虎幼蟲(B)在不同時間點其中腸GST酶比活力

Fig.2GST specific activity of 6th instar larvae ofM.separata(A) andA.ypsilon(B) after treatment with PSP and PSE for different times

圖3　杠柳新苷P和E處理6齡粘蟲幼蟲(A)和小地老虎幼蟲(B)在不同時間點其中腸CarE酶比活力

2.3杠柳新苷P和E對粘蟲幼蟲和小地老虎幼蟲中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶活性的影響

由圖4可知，杠柳新苷P處理粘蟲幼蟲8 h后，中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶酶比活力表現(xiàn)出抑制作用。在12、24和48 h的抑制率相應(yīng)為28.41%，40.51%和34.57%。杠柳新苷E在2～8 h 對粘蟲中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶酶比活力的影響無顯著差異，但在12、24和48 h處理組與對照組之間的抑制率存在顯著差異，相應(yīng)為13.90%，31.04%和24.45%。活性化合物PSP相比PSE表現(xiàn)出對粘蟲中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶更強的抑制作用(圖4-A)。然而，2種化合物對小地老虎中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶均無顯著影響(圖4-B)。

圖4　杠柳新苷P和E處理6齡粘蟲(A)和小地老虎(B)幼蟲不同時間點其

3討 論

昆蟲中腸的解毒系統(tǒng)主要包含色素P450、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、酯酶等，當(dāng)有害物質(zhì)進入昆蟲消化系統(tǒng)后，解毒酶會將其進行降解或清除，這必定會引起解毒酶活性的增加或降低[17]。粘蟲攝取杠柳新苷類化合物后，GST酶比活力在8 h后，尤其是24 h和48 h后顯著增加，但是小地老虎中腸GST酶比活力無明顯變化。GSTs是內(nèi)源和異生物質(zhì)解毒中心部位，包括對藥物、除草劑、殺蟲劑等[18]。杠柳新苷類化合物作為異生物質(zhì)進入粘蟲體內(nèi)，引起GST酶比活力增加，可能引起昆蟲的應(yīng)激反應(yīng)，通過增加酶活性來進一步降解有害物質(zhì)。在麥長管蚜(Sitobionavenae)中也發(fā)現(xiàn)，吲哚生物堿能引起GSTs活性增加，推測GSTs參與對植物次生代謝物的解毒[19]。另外，GSTs活性增加也可作為昆蟲解毒代謝的敏感指示[20]。杠柳新苷類化合物處理粘蟲8 h后，細胞色素P450-O-脫甲基酶的酶比活力受到明顯抑制，這可能與化合物的殺蟲活性有關(guān)。細胞色素P450s參與解毒或有害物的活化，是藥物或殺蟲劑代謝、抗性、選擇性和適應(yīng)性的決定因素[21-23]，酶比活力受到抑制，導(dǎo)致昆蟲代謝受阻，抑制昆蟲的正常生理生化反應(yīng)，因此加速對昆蟲的毒性。小地老虎中腸細胞色素P450-O-脫甲基酶對化合物不敏感，沒有引起酶比活力的變化。杠柳新苷類化合物對粘蟲和小地老虎CarE活性均無明顯作用，CarE能水解大部分的羧酸酯類，可將化學(xué)合成殺蟲劑降解為低毒化合物[24-26],說明化合物對羧酸酯酶的水解作用無影響。這可能與杠柳新苷化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，即不含有酯基結(jié)構(gòu)。Khan等[27]研究表明斑蝥素對CarE活性也無明顯作用。

通過對昆蟲3種解毒酶活性的測定，推測中腸細胞色素P450活性的抑制可能與杠柳新苷P的中毒機制有關(guān)，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶參與對杠柳化合物的解毒機制。杠柳新苷P和E化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，只有1個取代基不同，這可能影響到化合物與靶標(biāo)位點結(jié)合的緊密性。但杠柳新苷P如何影響昆蟲的生理生化過程還不清楚。

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Received 2015-04-25Returned2015-05-11

First authorWANG Yingying, female, master student.Research area: pesticide toxicology.E-mail: wang553135575@163.com

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Effects of Periplocoside P and E fromPeriplocasepiumon Activities of Three Detoxification Enzymes in Midgut ofMythimnaseparatandAgrotisypsilon(Lepidoptera：Noctuidae)

WANG Yingying1,2and HU Zhaonong1,2

(1.Institute of Pesticide Science,College of Plant Protection,Northwest A & F University, Yangling Shaanxi712100, China;2.Key Laboratory of Botanical Pesticide R & D of Shaanxi Province, Yangling Shaanxi712100, China)

AbstractPeriplocosides on detoxification enzymes in midgut of larvar has not been reported.In order to reveal the insecticidal activity and the effect of periplocosides on activities of detoxification enzymes in midgut of larvar.We investigated the effects of strong insecticidal periplocoside P (PSP) and periplocoside E (PSE) which had no insecticidal activity on the activities of three metabolism enzymes in midgut of 6th instar larvae of Mythimna separata and Agrotis ypsilon, including carboxylesterase (CarE), glutathione S-transferase (GST) and O-demethylase of cytochrome P450.GST activity could be increased by PSP and PSE when M.separata larvae were administrated orally with both compounds after 8 h, but PSP showed higher rise trend of GST than PSE.Both compounds showed no obvious effect on CarE activity of the tested insects.The activity of O-demethylase of cytochrome P450 on M.separata was significantly declined by PSP and PSE after 12 h, whereas had no obvious changes on A.ypsilon.The cytochrome P450 in the midgut may be relevant to the intoxication mechanism of PSP against M.separata, whereas GST may be involved in detoxification of periplocosides in insects.

Key wordsPeriploca sepium；Mythimna separata； Agrotis ypsilon；Midgut; Detoxicifition enzymes

收稿日期：2015-04-25修回日期：2015-05-11

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31171868)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(QN2011058)。

通信作者：胡兆農(nóng)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。 E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號S481+.1

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0939-06

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China(No.31171868); Special Funds of Scientific Research Expenses for Universities under the Chinese Central Government(No.QN2011058). HU Zhaonong, male, Ph.D,professor, doctoral supervisor.Research area: pesticide toxicology.E-mail: huzhaonong@nwsuaf.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0920.042.html

第一作者：汪英英，女，碩士研究生，從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail: wang553135575@163.com