蒙古沙冬青伴生植物AM真菌多樣性

曹翠蘭，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事植物學(xué)研究。E-mail:466213016@qq.com

胡從從1，郭清華1，賀學(xué)禮1，趙麗莉1，李英鵬1，曹翠蘭2

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要為探究蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)伴生植物叢枝菌根(AM)真菌遺傳多樣性特征，于2013年7月隨機(jī)取樣采集內(nèi)蒙古烏海、磴口和烏拉特后旗3個(gè)樣地霸王(Zygophyllum xanthoxylum)和白刺(Nitraria tangutorum)根圍土壤，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)分布及與土壤因子的相關(guān)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：(1)共分離鑒定球囊霉屬(Glomus)、管柄囊霉屬(Funneliformis)和根內(nèi)球囊霉屬(Rhizophagus)3屬AM真菌，其中，Glomus為所有樣地和土層共有優(yōu)勢(shì)屬，G.coronatum(AJ276086.2)和G. sp.(KC558550.1)為霸王根圍優(yōu)勢(shì)菌種，Uncultured Funneliformis(HG004455.1)和Uncultured Rhizophagus(KC797139.1)為白刺根圍優(yōu)勢(shì)菌種；G.coronatum(FR773145.1)是烏海特有菌種，G.sp.(AJ315521.1)，Uncultured Rhizophagus(KF386282.1)和Uncultured Glomus(HG972422.1)為磴口特有菌種。(2)不同宿主、樣地、土層AM真菌具有不同的DGGE圖譜特征，豐度和多樣性指數(shù)呈現(xiàn)蒙古沙冬青>霸王>白刺；同一樣地，0～30 cm土層高于30～50 cm土層；同一土層，烏海、磴口均高于烏拉特后旗樣地，其中烏海20～30 cm土層AM真菌豐度和多樣性指數(shù)最高，分別為16和2.06。(3)土壤速效磷與AM真菌多樣性顯著正相關(guān)，堿解氮、堿性磷酸酶與AM真菌群落多樣性顯著負(fù)相關(guān)。可見(jiàn)，AM真菌能與宿主植物形成良好共生關(guān)系，具有豐富的遺傳多樣性；宿主植物、環(huán)境因子對(duì)AM真菌群落多樣性有重要影響。

關(guān)鍵詞蒙古沙冬青；伴生植物；AM真菌；PCR-DGGE；遺傳多樣性

中國(guó)西北荒漠帶氣候條件惡劣，使得該地區(qū)植被稀疏，植物種類(lèi)組成與群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)作為西北荒漠地區(qū)獨(dú)有的旱生常綠豆科闊葉灌木，是礫質(zhì)及沙礫質(zhì)荒漠化草原的建群種，也是第三紀(jì)孑遺物種，具有古老的生長(zhǎng)史和發(fā)展史[1]。霸王(Zygophyllumxanthoxylum)和白刺(Nitrariatangutorum)與蒙古沙冬青相伴而生，既有競(jìng)爭(zhēng)抑制，又有協(xié)同進(jìn)化，其根系發(fā)達(dá)，具有抗寒、抗旱、耐瘠薄等特點(diǎn)，是防風(fēng)固沙的理想樹(shù)種。

從枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)真菌屬于真菌界球囊霉門(mén)(Glomeromycota)，目前包括3綱、5目、14科、26屬[2]，是一類(lèi)能與高等植物根系形成共生體的土壤有益微生物。AM真菌作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，在生物量生產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)關(guān)系、物質(zhì)循環(huán)、改善土壤理化性質(zhì)、穩(wěn)定和修復(fù)生態(tài)系統(tǒng)、提高植物生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力等方面起著重要作用，其種群演替對(duì)植物種間競(jìng)爭(zhēng)、群落結(jié)構(gòu)、植物多樣性等有重要意義。

AM真菌資源和多樣性研究主要通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和分類(lèi)，然而這種方法并不能客觀反映AM真菌群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)分布的實(shí)際狀況。近年來(lái)，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)獲得遺傳信息，可用于認(rèn)定新種，分析各種屬之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，確定某種真菌的分類(lèi)地位，對(duì)形態(tài)學(xué)分類(lèi)進(jìn)行補(bǔ)充和完善[3]。變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)在分析微生物區(qū)系遺傳多樣性方面發(fā)揮著重要作用，能夠直接檢測(cè)AM真菌群落結(jié)構(gòu)變化和多樣性的豐度[4]。目前，已有很多關(guān)于荒漠地區(qū)AM真菌在群落結(jié)構(gòu)[5]、生態(tài)功能[6]及其與環(huán)境因子關(guān)系[7]等方面的研究。然而，利用現(xiàn)代分子手段對(duì)荒漠土壤AM真菌資源和多樣性研究還很薄弱。

本試驗(yàn)利用PCR-DGGE及DNA克隆等技術(shù)，對(duì)荒漠植物根圍土壤AM真菌分子特征進(jìn)行研究，探討AM真菌遺傳多樣性在宿主植物、樣地和土層之間的變化規(guī)律，為進(jìn)一步明確AM真菌群落組成和生態(tài)分布，以及與荒漠植物共生關(guān)系提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1研究樣地概況

本試驗(yàn)選取內(nèi)蒙古烏海、磴口、烏拉特后旗3個(gè)樣地，具體情況如表1所示。

表1　樣地概況

1.2樣品采集

在烏海、磴口、烏拉特后旗分別選取3個(gè)小樣地，每個(gè)小樣地選取長(zhǎng)勢(shì)良好的霸王、白刺各3株，在距植株主干0～30 cm內(nèi)挖土壤剖面，分別采集0～10、10～20、20～30、30～40、40～50 cm土層土樣。將土壤樣品裝入隔熱袋中保存，風(fēng)干后篩除土中的根與砂石，用于土壤理化性質(zhì)分析，再將每個(gè)樣地5個(gè)土層土樣分別混勻，用于提取土壤總DNA。

1.3土壤DNA提取

提取方法采用已修改的Bead-Beating法[8]。

1.4巢式PCR與瓊脂糖凝膠電泳

第1輪擴(kuò)增采用引物對(duì)GeoA2 (5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′) 和Geo11 (5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′)擴(kuò)增真菌18S rDNA序列；第2輪擴(kuò)增以第1次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行，AM真菌特異性引物AM1(5′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′) 和NS31(5′-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′)；第3輪以第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，真菌 18S rDNA NS31/Glo1 區(qū)通用引物對(duì)NS31-GC(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC- ACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′) ，Glo1 (5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′)。

利用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，90 V恒壓電泳30 min，EB染色15 min。

1.5DGGE變性梯度凝膠電泳

1.5.1DGGE條件丙烯酰胺凝膠溶液體積分?jǐn)?shù)為8%(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺=37.5∶1)，變性劑范圍為30%～70%(100%變性劑為40%甲酰胺，7 mol/L尿素)，電泳緩沖液為1×TAE，130 V、60 ℃電泳，時(shí)間8 h，銀染法染色，用Bio-1D凝膠定量分析軟件進(jìn)行DGGE分析。

1.5.2DGGE圖譜分析利用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜的優(yōu)勢(shì)度、豐度(S)、均勻度(EH)和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，公式計(jì)算：

H=-∑Si=1(Pi)(lnPi)

EH=H/Hmax=H/lnS

式中，S表示每個(gè)樣品條帶數(shù)，Pi表示第i條條帶優(yōu)勢(shì)度。

1.5.3DGGE膠回收與測(cè)序分析切割粗亮清晰、具有代表性的條帶，加入30 μL ddH2O，4℃過(guò)夜，以上清液為模板，NS31/Glo1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收試劑盒回收純化。將純化產(chǎn)物連接到pGM-T載體上，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆，檢測(cè)后將菌液送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，并用MEGA6建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)依據(jù)魯如坤[9]方法測(cè)定，土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定，速效磷用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀用火焰光度法測(cè)定，堿解氮用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，磷酸酶采用改進(jìn)的Taba-tabai和Brimner方法[10]測(cè)定，球囊霉素依據(jù)Wright等[11]方法測(cè)定。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003整理后，利用SPSS 19.0生物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Canoco 4.5軟件進(jìn)行PCA和RDA分析。

2結(jié)果與分析

2.1土壤總DNA提取與巢式PCR檢測(cè)

共提取20個(gè)土壤樣品DNA，經(jīng)3輪PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。前2輪擴(kuò)增后，由于DNA拷貝數(shù)低，在瓊脂糖凝膠上無(wú)法觀察到目標(biāo)條帶，第3輪PCR擴(kuò)增(圖1)能得到大量目標(biāo)產(chǎn)物(270 bp)，可用于DGGE電泳分析。

2.2DGGE圖譜分析

對(duì)DGGE圖譜分析可知，不同樣品DGGE指紋圖譜和灰度存在差異，泳道結(jié)構(gòu)和條帶數(shù)量有所不同。由圖2-A可知，從霸王根圍土壤共分離出20個(gè)條帶，其中與第3泳道結(jié)構(gòu)相似度較高的是第1、4泳道，相似度分別為64.4%和51.0%。條帶2、4、5和20是所有樣品的共有條帶，條帶10是烏海特有條帶，15條帶是烏拉特后旗40～50 cm土層的特有條帶。從圖2-B可知，在白刺根圍土壤中共分離出21個(gè)條帶，其中與第2泳道結(jié)構(gòu)相似度較高的是第4、1、7泳道，分別為63.3%、62.2%和61.6%，條帶2、3、16、21是10個(gè)樣品的共有條帶，條帶7、8和12是磴口特有條帶，條帶10和19為磴口30～40 cm土層特有條帶(圖2-B)。

圖1　第3輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

圖內(nèi)數(shù)字表示分離的條帶編號(hào)Figures showed that the separation of stripe number in picture；圖2-A為霸王根圍土壤樣品電泳圖Showed the electrophoresis figure of rhizosphere soil sample inZ.xanthoxylum，下面數(shù)字中1～5依次為烏海0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wuhai，6～10是烏拉特后旗0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wulate；圖2-B為白刺根圍土壤樣品電泳圖Showed the electrophoresis figure of rhizosphere soil sample inN.tangutorum，1～5依次為磴口0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Dengkou，6～10是烏拉特后旗0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wulate

圖2伴生植物根圍土壤樣品AM真菌DGGE泳道比較

Fig.2DGGE profile amplified from AM fungi of different soil samples under associated plants

2.3AM真菌群落結(jié)構(gòu)相似性比較

利用Quantity One軟件處理DGGE電泳圖譜，得到各樣品間AM真菌群落結(jié)構(gòu)相似性圖譜。由圖3-A可知，相似性最高的是樣品1和3，相似性指數(shù)為9.57；樣品2和5，樣品6和7的相似性指數(shù)分別為3.38和0.75；樣品4和樣品8相似性較低，指數(shù)為0.12。由圖3-B可知，樣品2和樣品4、樣品9和樣品10、樣品6和樣品7相似性較高，相似性指數(shù)分別為14.58、7.57和3.96。通過(guò)分析圖3，表明不同樣地不同土層AM真菌群落組成具有一定的相似性。

圖3-A為霸王根圍土壤AM真菌群落相似性圖譜Figure 3-A showed the community similarity profiles of AM fungi inZ.xanthoxylum，數(shù)字1～5依次為烏海0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wuhai，6～10是烏拉特后旗0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wulate；圖3-B為白刺根圍土壤AM真菌群落相似性圖譜Showed the community similarity profiles of AM fungi inN.tangutorum，1～5依次為磴口0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Dengkou，6～10是烏拉特后旗0～50 cm 5個(gè)土層樣品0-50 cm soil layers in Wulate

圖3伴生植物根圍土壤AM真菌群落相似性圖譜

Fig.3Community similarity profiles of AM fungi under associated plants

2.4DGGE圖譜豐度、多樣性指數(shù)和均勻度

DGGE圖譜中條帶數(shù)量的多少能反映樣品中微生物組成的差異[12]。由表2可知，烏海樣地豐度隨土層加深先增后降，最大值在20～30 cm土層；烏拉特后旗1豐度先減后升，在40～50 cm土層有最大豐度。磴口樣地豐度變化呈“M”型，最大值在10～20 cm土層；烏拉特后旗2的豐度變化與烏海樣地一致。多樣性變化與豐度變化趨勢(shì)保持一致，多樣性指數(shù)基本維持為1.5～2.0；樣地間和土層間均勻度無(wú)明顯差異，均勻度指數(shù)基本保持為0.7～0.9。

2.5DGGE圖譜優(yōu)勢(shì)度分析

DGGE圖譜中條帶的粗亮程度反映樣品中微生物的含量，條帶清晰粗亮，擴(kuò)增后條帶灰度值高，說(shuō)明菌種在樣品中含量豐富，是樣品中的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)種[12]。由DGGE圖譜分析可知，同一條帶在不同樣品中的優(yōu)勢(shì)度各有差異。由圖4可見(jiàn)，條帶2、4、5、20是烏海和烏拉特后旗樣地共有優(yōu)勢(shì)條帶。條帶12是烏海樣地優(yōu)勢(shì)帶，優(yōu)勢(shì)度在10%以上；條帶18、19是烏拉特后旗優(yōu)勢(shì)帶，優(yōu)勢(shì)度在10%以上。圖5表明，條帶2、3、16、21是磴口和烏拉特后旗樣地共有優(yōu)勢(shì)條帶；條帶4、6是磴口優(yōu)勢(shì)帶，優(yōu)勢(shì)度在15%以上；烏拉特后旗的優(yōu)勢(shì)帶還有條帶18，優(yōu)勢(shì)度相對(duì)較高。

2.6條帶測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析

由表3可知，在霸王根圍土壤樣品中選取15個(gè)條帶進(jìn)行測(cè)序，初步鑒定為3個(gè)屬,包括球囊霉屬(Glomus)、管柄囊霉屬(Funneliformis)和根內(nèi)球囊霉屬(Rhizophagus)。在獲得序列中有12條為Glomus，其中條帶4、5、20為樣品共有優(yōu)勢(shì)帶；條帶2也是共有優(yōu)勢(shì)帶，屬于Funneliformis，條帶14和18屬于Rhizophagus，這一結(jié)果表明Glomus是霸王AM真菌優(yōu)勢(shì)菌群，F(xiàn)unneliformis和Rhizophagus是常見(jiàn)屬。其中，G.coronatum(AJ276086.2)和G. sp.(KC558550.1)為霸王根圍優(yōu)勢(shì)菌種，G.coronatum(FR773145.1)是烏海特有菌種。系統(tǒng)發(fā)育顯示(圖6)，條帶4和條帶15與G.coronatum(AJ276086.2)的相似度都在95%以上，親緣關(guān)系較近，可以確定為一個(gè)菌種，這說(shuō)明同一菌種在DGGE中會(huì)有不同遷移率。

表2　不同樣品DGGE條帶豐度和多樣性指數(shù)

圖4　霸王根圍土壤樣品DGGE條帶優(yōu)勢(shì)度

圖5　白刺根圍土壤樣品DGGE條帶優(yōu)勢(shì)度

克隆編號(hào)Clonenumber條帶BandNCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中最相似菌種登錄號(hào)ThestrainswhichhavethehighestidentityfromNCBI(Accession)相似性/%SimilarityE值E-value12UnculturedFunneliformis(HG004455.1)974×10-9023UnculturedGlomus(HE614947.1)991×10-8934Glomuscoronatum(AJ276086.2)978×10-8745UnculturedGlomus(HF568595.1)972×10-8757Glomuscoronatum(AJ276086.2)943×10-46610Glomuscoronatum(FR773145.1)992×10-103711Glomussp.(FR715050.1)982×10-99812Glomusclarum(AJ505619.1)915×10-29913UnculturedGlomus(JF719636.1)982×10-991014UnculturedRhizophagus(KF386278.1)929×10-321115Glomuscoronatum(AJ276086.2)954×10-801216UnculturedGlomus(JN153048.1)954×10-151318UnculturedRhizophagus(KF386278.1)942×10-781419UnculturedGlomus(HF567355.1)933×10-311520Glomussp.(KC558550.1)921×10-34

采用Neighbour-joining方法繪制DGGE條帶序列與近緣種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分支處的數(shù)值為支持強(qiáng)度值，1 000次重復(fù)，顯示支持強(qiáng)度大于50%的分支強(qiáng)度值，圖7同

Neighbour-joining tree showing the phylogenetic positions of the 23 sequences and representatives of some other related taxa,based on 18S rDNA NS31/Glo1 domain sequences.Numbers above nodes indicate the bootstrap values for analysis of 1 000 replicates,bootstrap values greater than 50% are shown,the same as Fig.7

圖6霸王DGGE序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.6Phylogenetic tree of separated sequences of DGGE ofZygophyllumxanthoxylon

由表4可知，在白刺根圍土壤樣品中分離鑒定出Glomus、Funneliformis和Rhizophagus3個(gè)屬。其中，有9條歸為Glomus，3條屬于Funneliformis，3條為Rhizophagus，分析表明Glomus是白刺AM真菌的優(yōu)勢(shì)屬，F(xiàn)unneliformis和Rhizophagus是常見(jiàn)屬。其中，UnculturedFunneliformis(HG004455.1)和UnculturedRhizophagus(KC797139.1)是白刺根圍優(yōu)勢(shì)菌種，G.sp.(AJ315521.1)，UnculturedRhizophagus(KF386282.1)和UnculturedGlomus(HG972422.1)為磴口特有菌種。系統(tǒng)發(fā)育顯示(圖7)，條帶9和條帶21與UnculturedRhizophagus(KC797139.1)相似度最高，親緣關(guān)系非常接近，確定為一個(gè)菌種；條帶18和條帶19的親緣關(guān)系非常接近，與UnculturedGlomus(KJ209983.1)相似性大，歸為同一個(gè)種。

2.7土壤理化性質(zhì)測(cè)定

2.7.1土壤因子空間分布由表5可知，霸王根圍土壤因子變化呈現(xiàn)一定規(guī)律性。同一土層，烏海樣地有機(jī)質(zhì)高于烏拉特后旗；烏拉特后旗速效鉀、速效磷、球囊霉素與磷酸酶高于烏海。烏海和烏拉特后旗0～30 cm土層速效鉀均高于30～50 cm土層；烏海0～20 cm土層堿解氮顯著高于其他土層；烏拉特后旗速效磷和EEG在0～30 cm土層顯著高于30～50 cm土層。

白刺根圍土壤因子變化也呈現(xiàn)出一定規(guī)律性。除0～10 cm土層外，磴口樣地有機(jī)質(zhì)高于烏拉特后旗；同一土層，烏拉特后旗速效鉀、總球囊霉素(TEG)、磷酸酶、堿解氮均高于磴口樣地。磴口酸性磷酸酶在0～20 cm土層顯著高于其他土層，0～10 cm土層堿性磷酸酶顯著高于其他土層；烏拉特后旗2種磷酸酶均在20～30 cm土層有最大值。

綜合分析表明，霸王和白刺0～30 cm土層各項(xiàng)土壤因子均高于30～50 cm土層，其中土壤有機(jī)質(zhì)、速效鉀、速效磷、酸性磷酸酶等在霸王根圍土壤更高，而球囊霉素、堿性磷酸酶在白刺根圍土壤中較高。

表4　白刺根圍土壤DGGE條帶序列Blast結(jié)果

2.7.2土壤因子主成分分析(PCA法)在PCA排序圖中，每個(gè)樣方點(diǎn)投影到某一土壤因子箭頭的點(diǎn)，其相對(duì)位置代表該土壤因子在這些樣方中的排序情況，樣方點(diǎn)之間的距離越近表示它們之間關(guān)系越密切。由圖8可知，速效磷是烏海樣地的主要影響因子，堿解氮、磷酸酶是烏拉特后旗樣地的重要影響因子。前兩軸累積解釋信息量達(dá)87.9%，其中第1軸解釋信息量為76.3%，第2軸排序軸為11.6%。分析可知，土壤速效磷、堿解氮、磷酸酶是3個(gè)樣地的主要影響因子，反映環(huán)境的土壤肥力情況。

圖7　白刺DGGE序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

樣地Samplesite土層/cmSoillayer有機(jī)質(zhì)/(mg/g)Organicmatter速效鉀/(μg/g)AvailableK速效磷/(μg/g)AvailableP易球囊霉素/(mg/g)EEG總球囊霉素/(mg/g)TEG酸性磷酸酶/[μg/(g·h)]ACP堿性磷酸酶/[μg/(g·h)]ALP堿解氮/(μg/g)AvailableN烏海Wuhai0～1012.22a7.80a0.22a1.26a1.77a12.58a12.58a12.83a10～2014.44a7.62a0.21a1.20a1.62a8.74a8.74b10.50ab20～3013.33a7.10ab0.24a0.98a1.75a12.70a12.70a9.33b30～4012.22a5.80b0.20a0.77a1.18a11.56a11.56ab10.11b40～5013.33a6.15b0.17a1.12a1.44a10.64a10.64b9.33b烏拉特后旗10～1012.22ab8.40a0.21a1.62a2.02a33.91a31.52a8.94aWulate110～2010.00b7.73ab0.22a1.35ab1.88a29.80b23.39ab12.44a20～3011.11ab7.14ab0.16ab1.14b2.09a20.36c16.19b11.28a30～4012.22ab6.03c0.11b0.87b1.52a14.62d25.47ab7.39a40～5014.44a6.18bc0.11b1.35ab1.75a19.33c29.58ab9.72a磴口Dengkou0～1010.00b9.26a0.19a1.70a1.82a16.79a19.90a10.50ab10～2012.22ab6.53b0.21a1.41a1.75a10.57ab9.08b7.00bc20～3014.44a3.64c0.18a1.34a1.76a6.97b7.11b5.83c30～4014.44a6.06b0.16a1.49a1.96a7.19b4.96b4.67c40～5012.22ab3.80c0.15a1.12a1.81a6.68b15.84ab12.83a烏拉特后旗20～1013.33a9.50a0.15b1.50a2.09a17.29c20.73b14.17abWulate210～2011.11ab7.67ab0.30a1.49a1.85a17.87b23.59a11.00c20～3011.11ab5.62b0.17ab1.42a1.84a23.54a24.64a15.83a30～4011.11ab6.84ab0.14b1.36a1.89a20.83ab23.05ab13.11bc40～5010.00b7.17ab0.19ab1.50a2.30a23.01a22.32ab15.78a

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示同一樣地不同土層在0.05水平上差異顯著。

Note:Data with different superscripts in the diferent soil depth of same site indicate significant difference at 0.05 level.

圖中各形狀代表樣地Shape shows sampling site；1～5、6～10、11～15、16～20分別表示烏海、烏拉特后旗1、磴口、烏拉特后旗2樣地0～50 cm 5個(gè)土層0-50 cm soil layers in Wuhai，Wulate 1，Dengkou，Wulate 2；圖9同The same as Fig.9

圖8土壤因子PCA排序圖

Fig.8Results of PCA analysis of soil factors

2.8AM真菌多樣性與土壤因子的冗余分析

在RDA排序圖內(nèi)，土壤因子與物種的箭頭方向和夾角表示它們之間的相關(guān)性。同向箭頭表示正相關(guān)，反向表示負(fù)相關(guān)；夾角越小則相關(guān)性越高，夾角越接近直角則相關(guān)性越小。由圖9可見(jiàn)，前兩軸累積解釋信息量達(dá)100%，其中第1軸排序軸達(dá)96.1%，第2軸排序軸為3.9%。土壤速效磷與AM真菌豐度和Shannon-Weiner指數(shù)關(guān)系顯著正相關(guān)；堿解氮、堿性磷酸酶與AM真菌群落多樣性顯著負(fù)相關(guān)。

圖9　AM真菌多樣性與土壤因子的RDA分析

3討 論

3.1AM真菌遺傳多樣性特征

研究結(jié)果顯示，霸王和白刺根圍土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)分布具有很高相似度。試驗(yàn)共分離鑒定球囊霉屬(Glomus)、管柄囊霉屬(Funneliformis)和根內(nèi)球囊霉屬(Rhizophagus)3個(gè)屬，球囊霉屬為3樣地共有優(yōu)勢(shì)屬，在5個(gè)土層均有分布，說(shuō)明Glomus在內(nèi)蒙古荒漠地區(qū)占據(jù)重要生態(tài)位并廣泛分布。由于受GenBank中序列信息不完整的限制，在所測(cè)得的30條序列中，只有10個(gè)鑒定到種，包括G.coronatum、G. sp.和G.clarum。

未分離出形態(tài)學(xué)所鑒定的無(wú)梗囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和內(nèi)養(yǎng)囊霉屬，這與所選引物特異性有很大關(guān)系。AM1/NS31引物對(duì)球囊霉屬有明顯偏擴(kuò)效應(yīng)，一些種屬AM真菌不能被擴(kuò)增出來(lái)[13-14]；NS31/Glo1引物對(duì)可以擴(kuò)增出一些非AM真菌的微生物[15]。也有研究表明，DGGE法只能對(duì)微生物群落中數(shù)量大于1%的優(yōu)勢(shì)種群進(jìn)行分析[16]。在DGGE中，雖然遷移率不同，但幾個(gè)條帶可能代表同一菌種，一個(gè)條帶也可能包含幾個(gè)種的信息，因此不能確定AM真菌的數(shù)量和種類(lèi)等。這些因素都會(huì)影響AM真菌種類(lèi)分離鑒定和對(duì)其種群組成分布的研究。

3.2宿主植物與AM真菌遺傳多樣性的關(guān)系

AM真菌屬于專(zhuān)性共生真菌，宿主植物能提供AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的碳水化合物，對(duì)AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響[17]。試驗(yàn)結(jié)果與蒙古沙冬青AM真菌多樣性對(duì)比發(fā)現(xiàn)，霸王、白刺和蒙古沙冬青根圍土壤AM菌群的優(yōu)勢(shì)屬均為球囊霉屬，這與荒漠地區(qū)AM真菌多樣性研究結(jié)果一致[18-19]。3種植物AM真菌群落結(jié)構(gòu)具有很高的相似度，但在豐度和多樣性指數(shù)上，蒙古沙冬青>霸王>白刺。這可能是蒙古沙冬青較伴生植物更早的生活在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中，與大多數(shù)AM真菌長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化和相互選擇的結(jié)果。對(duì)植物根系進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，沙冬青和霸王的根系比白刺根系更發(fā)達(dá)粗壯、入土更深，這可能也是造成多樣性差異的一個(gè)因素。有研究證實(shí)，宿主類(lèi)型和根系特性是影響AM真菌發(fā)生和分布的重要因子[20]，不同植物根系形態(tài)與生理代謝的差異能夠影響AM真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、侵染和繁殖等[21]。

3.3土壤因子與AM真菌遺傳多樣性的關(guān)系

土壤因子對(duì)AM真菌的群落組成、生態(tài)分布等有重要影響。本研究中烏海和磴口樣地AM真菌豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)均高于烏拉特后旗，說(shuō)明AM真菌多樣性與樣地土壤環(huán)境和土壤肥力有著密切關(guān)系。冗余分析結(jié)果顯示，速效磷是主要土壤因子，對(duì)AM真菌的豐度、多樣性指數(shù)有最大影響；堿解氮、堿性磷酸酶與AM真菌種類(lèi)呈負(fù)相關(guān)。Smith等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在礦質(zhì)養(yǎng)分中，土壤磷素密切影響著AM真菌的豐度，速效磷過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育。

有研究表明，土壤深度是AM真菌多樣性的驅(qū)動(dòng)力[23]，對(duì)AM真菌群落結(jié)構(gòu)具有一定影響。本試驗(yàn)中，0～30 cm土層AM真菌豐度和多樣性指數(shù)高于30～50 cm土層，可能是因?yàn)楸韺油寥赖臐穸群屯笟庑院?，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，為好氣性AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供適宜條件[24]，這與蒙古沙冬青AM真菌遺傳多樣性研究結(jié)果[25]相同。

綜合表明，霸王和白刺根圍土壤AM真菌遺傳多樣性較蒙古沙冬青低，說(shuō)明蒙古沙冬青與AM真菌適應(yīng)性更強(qiáng)，更能適應(yīng)極端荒漠環(huán)境。AM真菌能與荒漠植物形成良好的共生關(guān)系，增強(qiáng)植物抗逆性，這對(duì)荒漠植物生長(zhǎng)和生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)具有重要意義。

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Received 2015-06-27Returned2015-10-15

First authorHU Congcong,female,master.Research area:mycorrhizal biology.E-mail:hcc3004@163.com

CAO Cuilan,female,senior experimentalist.Research area:botany.E-mail:466213016@qq.com

(責(zé)任編輯：成敏Responsible editor:CHENG Min)

Diversity of Arbuscular Mycorrhiza Fungi near to the Associated Plants ofAmmopiptanthusmongolicus

HU Congcong1,GUO Qinghua1,HE Xueli1,ZHAO Lili1,LI Yingpeng1and CAO Cuilan2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding Hebei 071002,China;2.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractAmmopiptanthus mongolicus is an excellent sand-fixation and endangered desert ecosystem of leguminous plants.Zygophyllum xanthoxylum and Nitraria tangutorum are associated plants of A.mongolicus that can not only adapt to the desert environment but also repair the ecological system.In order to explore the community composition and genetic diversity of AM fungi in the rhizosphere soil of Z.xanthoxylum and N.tangutorum by PCR-DGGE,in July 2013,the soil samples were collected from three different sites in Wuhai,Dengkou and Wulate of Inner Mongolia,China.Results showed that:(1) AM fungi have abundant genetic diversity.Three genera,including Glomus,Funneliformis and Rhizophagus,were isolated and identified in the rhizosphere soil of Z.xanthoxylum and N.tangutorum.Glomus was dominant genus of all the sample area and soil layer.The superiority strains of Z.xanthoxylum were G.coronatum(AJ276086.2)and G. sp.(KC558550.1).Uncultured Funneliformis(HG004455.1)and Uncultured Rhizophagus(KC797139.1)were the dominant species of N.tangutorum.G.coronatum(FR773145.1)was a special species in Wuhai.G.sp.(AJ315521.1).Uncultured Rhizophagus(KF386282.1)and Uncultured Glomus(HG972422.1)were unique species in Dengkou.(2) The fingerprint characteristics of DGGE,richness,diversity index and dominance of AM fungi varied with host plants,sampling sites and soil depth.Richness and diversity index of AM fungi were higher under A.mongolicus than under the associated plants and in 0-30 cm soil layer than that in 30-50 cm soil layer.For the same soil layer,the richness and diversity index of AM fungi were sequenced in a descending order in Wuhai,Dengkou,and Wulate.The highest richness and diversity index at 20-30 cm soil layer in Wuhai,reaching 16 and 2.06,respectively.(3) Soil available phosphorus had a positive correlation with AM fungi diversity.Available nitrogen,alkaline phosphatase had significantly negative correlation with AM fungi community diversity.The results reflected AM fungi can form good symbiosis with the host plant and have abundant genetic diversity.The host plants and environmental factors significantly influenced the community composition and ecological distribution of AM fungi.

Key wordsAmmopiptanthus mongolicus; Associated plants; AM fungi; PCR- DGGE; Genetic diversity

收稿日期：2015-06-27修回日期：2015-10-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31170488)。

通信作者：賀學(xué)禮，男，教授，主要從事植物多樣性和菌根生物學(xué)研究。E-mail:xuelh1256@aliyun.com

中圖分類(lèi)號(hào)Q933

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0921-12

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China (No.31170488). HE Xueli,male,professor.Research area:plants diversity and mycorrhizal biology.E-mail:xuelh1256@aliyun.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0919.038.html

第一作者：胡從從，女，碩士研究生，從事菌根生物學(xué)研究。E-mail:hcc3004@163.com