吳　寬，陳　偉，成巨龍，康振生

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌　712100；2.陜西省煙草研究所，西安　710061)

陜西煙田主要病害種類調(diào)查與病毒分子檢測

吳寬1,2，陳偉1,2，成巨龍2，康振生1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌712100；2.陜西省煙草研究所，西安710061)

摘要為明確陜西煙田病害種類，于2013-2015年對陜西煙田病害開展系統(tǒng)調(diào)查，鑒定出9種病害，分別是赤星病、白粉病、黑脛病、灰霉病、青枯病、角斑病、野火病、根結(jié)線蟲病和病毒病，其中，赤星病、白粉病、灰霉病、黑脛病和病毒病發(fā)病普遍，危害嚴(yán)重；野火病、青枯病、角斑病和線蟲病僅在個別煙田發(fā)生。煙草感染病毒的種類包括煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、煙草蝕紋病毒(TEV)和煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)，其中，CMV 、TMV、TEV和PVY檢出率分別為23.6%、34.7%、21.3%和18.4%，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY檢出率分別為27.4%、24.9%和20.9%，煙田病毒復(fù)合感染普遍，造成損失較大。

關(guān)鍵詞煙草；赤星??；白粉?。缓诿劜?；花葉病毒??；多重PCR

近年來，隨著煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展，煙田病害加重，每年因病害發(fā)生造成的產(chǎn)量損失約10%，嚴(yán)重時達(dá)30%以上，已成為制約煙草生產(chǎn)的主要問題。在中國煙田常年發(fā)生的病害有病毒病、赤星病、白粉病、黑脛病、青枯病、線蟲病、角斑病和野火病等。煙草赤星病是由鏈格孢[Alternariaalternata(Fries) Keissler]感染引起[1]。20世紀(jì)80年代以來，赤星病在中國主要煙區(qū)均有發(fā)生，危害日趨嚴(yán)重，對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)影響明顯。據(jù)估測，每年赤星病發(fā)病面積約占中國植煙面積的30%～50%，直接導(dǎo)致煙葉外觀品質(zhì)下降，是目前中國煙草上發(fā)生范圍最廣、危害最重的一種葉部病害。僅1999年和2005年，由于赤星病流行使陜西煙葉品質(zhì)嚴(yán)重受損，煙葉均價下降約1個等級。煙草白粉病、青枯病在中國華南、西南各省發(fā)生較為普遍，時有爆發(fā)流行[2]。煙草黑脛病首次在中國黃淮地區(qū)發(fā)現(xiàn)，由煙草黑脛病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)侵染引起，已連續(xù)多年嚴(yán)重危害煙草生產(chǎn)[3-4]。煙草灰霉病在廣西、陜西等地均有報道，該病由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起[5-6]。根結(jié)線蟲病由南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)侵染引起[7-8]，20 世紀(jì)80 年代前，僅在山東、河南、安徽、四川等省零星發(fā)生，80 年代中后期以來，發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，危害日益嚴(yán)重，目前在云南、河南、山東等13個主要產(chǎn)煙區(qū)均有發(fā)生，局部地區(qū)嚴(yán)重為害，損失較重。煙草角斑病在世界各地均有發(fā)生，在中國黑龍江煙區(qū)有報道，由丁香假單胞桿菌角斑專化型(Pseudomonassyringaepv.angulata)侵染引起[9]。煙草野火病在黑龍江、云南發(fā)生危害，20 世紀(jì)90 年代以來，因大面積種植單一品種等原因使該病害危害加重。煙草野火病是由煙草熒光假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起的細(xì)菌性病害，是煙葉產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害之一[10-11]。近年來，廣州[12]、陜西[13-15]、福建[16-17]、云南[18]、山東[19]、湖南[20]等多個省區(qū)均開展煙葉病毒病的鑒定研究。陳瑞泰等[16]對全國16個主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)研報道，魏寧生等[13]對陜西渭北煙區(qū)煙草蝕紋病毒原進(jìn)行鑒定，成巨龍等[14]開展煙草病毒病的流行規(guī)律與預(yù)測預(yù)報研究。長期以來，國內(nèi)對煙田真菌病害、細(xì)菌病害、線蟲病害研究報道較少。因此，本研究于2013-2015年對陜西煙草病害種類進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查鑒定，并進(jìn)行病毒分子檢測，以期為煙田病害綜合防治提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1病害調(diào)查與樣品采集

于陜南、陜北、渭北煙草產(chǎn)區(qū)調(diào)查田間病害，采用5點調(diào)查法，記載植株發(fā)病癥狀、發(fā)病株率。樣品采集后帶回實驗室分析，病毒病樣品于超低溫冰箱保存，備用。Taq盒為安徽優(yōu)晶生物工程有限公司產(chǎn)品，pMD18-Tsimple vector購自寶生物工程(大連)有限公司，EscherichiacoliJM109 菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)逆境生物學(xué)國家重點實驗室保存。

1.2病毒樣品總RNA提取

稱取0.1 g煙草病葉于研缽，加液氮研磨后迅速轉(zhuǎn)至無RNase的無菌1.5 mL eppendorf管，加1 mL BIOzol Extraction Reagent 混勻，放置15 min，加入0.2 mL氯仿和0.3 mL苯酚溶液上下倒置混勻，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清液轉(zhuǎn)入新eppendof管，加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20 ℃放置30 min。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液。用1 mLφ= 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，自然干燥。加入30 μL DEPC水溶解沉淀。-80℃保存，備用。以健康煙葉總RNA為陰性對照，提取方法同上。

1.3病毒擴(kuò)增引物設(shè)計

根據(jù)已報道的煙草花葉病毒(TMV)云南分離物、黃瓜花葉病毒(CMV)中國株系、煙草蝕紋病毒(TEV)陜西分離物、馬鈴薯Y病毒(PVY)陜西分離物和煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)河南分離物的外殼蛋白(CP)基因序列(GenBank登錄號分別為AJ239099、EF417579、AY787757、EU719650和AM236820)，參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計引物，合成TMV cpF/TMV cpR、CMV cpF/CMV cpR、TEV cpF/TEV cpR、PVY cpF/PVY cpR和TVBMV cpF/TVBMV cpR 5種病毒的特異引物[11]。由于多重RT-PCR要求在相同退火溫度下同時擴(kuò)增多個目的片斷，因此選擇Tm值較一致的各對引物，保證在同一退火溫度下可同時檢測到TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV。5種病毒的特異引物均由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，其中，TMV cpF：5′-TAGACCCGCT- AGTCACAG-3′，TMV cpR：5′-CAGAGGTCCAAACCAAAC-3′；CMV cpF：5′-GTGGGTGACAGTTCGTAAA-3′，CMV cpR：5′-GTGGGA-ATGCGTTGGT-3′；TEV cpF：5′-TGATGGATGGTGAGGAG-3′，TEV cpR：5′-GTGCCGTTC- AGTGTCTT-3′；PVY cpF：5′-CCGAG- AATCAAGGCTATC-3′，PVY cpR： 5′-CGCTAAACCTACATCCC-3′；TVBMV cpF：5′-GAGGTCG- TGAACTTACAGC-3′，TVBMV cpR：5′-GAGGTCGTGAACTTACAGC-3′。

1.4多重RT-PCR檢測方法

多重RT-PCR反應(yīng)體系：取田間樣品分別提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為模板，將各病毒特異性引物同時加入一個反應(yīng)管進(jìn)行PCR反應(yīng)。分別加入0.5 μmol/L引物各1 μL，退火溫度48 ℃。再加入0.9倍PCR緩沖液，0.10 U/μLTaqDNA聚合酶，0.28 mmol/L dNTPs，2.4 mmol/L Mg2+，進(jìn)行常規(guī)RT-PCR、電泳檢測，記錄結(jié)果。

1.5PCR產(chǎn)物的克隆與測序

采用煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草蝕紋病毒(TEV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)和煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)設(shè)計擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為237、273、347、456、547 bp 的5條特異性條帶。多重RT-PCR擴(kuò)增DNA靶片段采用H.Q.&.Q.凝膠回收試劑盒回收純化后，將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple vector 4 ℃連接過夜，采用CaCl2法制備大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，用Amp+和半乳糖苷酶的底物X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。陽性克隆經(jīng)菌落PCR和限制性酶酶切分析進(jìn)一步篩選后，將提取質(zhì)粒送金思特科技(南京)有限公司測序。

2結(jié)果與分析

2.1煙田病害種類調(diào)查

于2013-2015年對陜西煙田病害進(jìn)行調(diào)查，共鑒定出9種煙草病害，分別為赤星病、白粉病、黑脛病、灰霉病、青枯病、角斑病、野火病、根結(jié)線蟲病和病毒病。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，5月中旬，渭北、陜南煙區(qū)個別煙株下部葉片出現(xiàn)角斑病病斑，多出現(xiàn)在地頭，零星發(fā)??；隨后，隨氣溫逐步升高，少數(shù)煙苗葉片開始出現(xiàn)花葉、皰斑病毒病癥狀，5月下旬，發(fā)病株率約為5.12%～8.47%，個別植株矮化，發(fā)病率迅速上升，呈發(fā)病高峰，至6月上旬發(fā)病株率達(dá)到15.41%～25.18%，同時，發(fā)病煙葉葉脈壞死，煙草蝕紋病和煙草脈帶花葉病伴隨發(fā)生。陜西7-8月為高溫高濕季節(jié)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除煙草病毒病快速傳播擴(kuò)散外，煙草白粉病在陜南、渭北煙區(qū)均有發(fā)生，洛南、隴縣煙區(qū)發(fā)生較重，特別是進(jìn)入7月份高溫期后，遇到長時間降雨，或者煙田植株密度大、長勢過旺、透風(fēng)透光性差時發(fā)生較重，很容易暴發(fā)流行。白粉病主要為害葉片，嚴(yán)重時也感染幼莖。發(fā)病初期葉片表面出現(xiàn)白色絨狀霉斑，以后逐步擴(kuò)展至整個葉片，后期在葉片的正反面均可見白色粉狀物。該病通常先由下部葉發(fā)生，自下而上逐漸蔓延，最終擴(kuò)展至頂葉和莖稈，葉片逐漸失綠變黃，組織變薄，葉片壞死干枯，喪失經(jīng)濟(jì)價值。陜西省種植‘秦?zé)?6’‘K326’的煙田均有發(fā)病，發(fā)病株率為3.71%～10.65%，嚴(yán)重時煙葉發(fā)病株率高達(dá)25.72%。同時，煙葉成熟期赤星病發(fā)病增多，田間表現(xiàn)潛育期短、流行速度快等特點。在降雨量較多的8月，煙田赤星病發(fā)病株率為5.29%～8.75%，嚴(yán)重田塊發(fā)病株率高達(dá)32.94%～51.63%。赤星病和白粉病是陜西煙草生產(chǎn)中的主要真菌病害。

在陜南旬陽、南鄭等煙區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草黑脛病菌時有發(fā)生，主要在老煙區(qū)局部發(fā)生，發(fā)病初期在莖基部產(chǎn)生黑斑，病斑向上下擴(kuò)展，延及莖、葉及根部，容易引起倒伏；天氣干燥時，病株干枯呈黑褐色，高溫多雨時，病株腐爛，表面產(chǎn)生白色綿毛狀霉，導(dǎo)致煙株爛死；該病主要為害成株的莖基部和根部，受害后莖稈髓部變黑，嚴(yán)重時莖稈干縮縱裂，水分營養(yǎng)疏導(dǎo)受阻，葉片萎蔫直至變黃，苗期發(fā)病較少。在漢中煙區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙草青枯病零星發(fā)生，發(fā)病初期頂部葉片萎蔫，隨后萎蔫葉片增多，植株生長不良，青干枯死。鎮(zhèn)安、旬陽、白河、西鄉(xiāng)和洋縣煙田中發(fā)生南方根結(jié)線蟲病害?；颐共≡谌焻^(qū)均有發(fā)生，且近年來有流行發(fā)生的趨勢。同時，在這些煙區(qū)，煙草野火病零星發(fā)生，發(fā)生面積較小。陜西煙田病害發(fā)生情況見表1，煙草病害癥狀見圖1。

表1　陜西煙田病害的發(fā)生情況

2.2煙田病毒種類的檢測結(jié)果

采用多重RT-PCR從田間樣品中擴(kuò)增獲得TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV 5種病毒條帶，測序結(jié)果表明，其大小依次是237、273、347、456和547 bp(圖 2)，均為CP基因的部分序列，且保守區(qū)同源率均達(dá)到100%。TMV、CMV、TEV和PVY檢出率分別為23.6%、34.7%、21.3%、18.4%，其中，CMV和PVY是當(dāng)前生產(chǎn)上發(fā)病率較高、造成損失較大的病害，尤其在老煙區(qū)發(fā)生較重；CMV、TEV和TVBMV均是蚜傳病毒，受蚜蟲遷飛時間影響明顯，蚜蟲遷飛時間早，3種病毒病發(fā)病重，TVBMV發(fā)生量較少。另外，檢測結(jié)果還顯示，煙田病毒混合發(fā)生普遍，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY發(fā)生率分別為27.4%、24.9%、20.9%，造成的損失均較大。

A.赤星病Brown spot；B.白粉病Powdery mildew；C.黑脛病Black shank；D.灰霉病Gray mold；E.青枯病Bacterial granville；F.角斑病Angle spot；G.野火病Wildfire；H.根結(jié)線蟲病Nematode root-knot；I.煙草花葉病TMV；J.煙草黃瓜花葉病CMV；K.煙草蝕紋病TEV；L.煙草葉脈壞死病PVY；M.煙草脈帶花葉病TVBMV

圖1田間煙草病害癥狀

Fig.1Symptoms of field tobacco diseases

M.Marker；1.健康煙草Healthy tabacco；2.TMV；3.TMV+CMV；4.TMV+CMV+TEV； 5.TMV+CMV+TEV +PVY；6.TMV+CMV+TEV+PVY+TVBMV

圖2煙草病毒的多重PCR檢測

Fig.2Multiple PCR detection of tobacco viruses

3結(jié)論與討論

陜西煙區(qū)病害發(fā)生普遍，于2013-2015年對陜西煙田病害進(jìn)行調(diào)查采樣，共鑒定出9種煙草病害，分別是赤星病、白粉病、灰霉病、黑脛病、青枯病、角斑病、野火病、線蟲病和病毒病，其中，赤星病、白粉病、灰霉病、黑脛病、青枯病、角斑病和病毒病發(fā)病普遍，危害嚴(yán)重，野火病和線蟲病僅在個別煙田發(fā)生。感染煙草的病毒種類包括TMV、CMV、PVY、TEV和TVBMV，其中，CMV 、TMV、TEV和PVY發(fā)生率分別為23.6%、34.7%、21.3%和18.4%，TMV+CMV、CMV +TEV和CMV +PVY發(fā)生率分別為27.4%、24.9%和20.9%。說明：陜西煙田病毒混合發(fā)生普遍，造成的損失較大[13-15]。

陜西煙田病害種類較多，其中，煙草赤星病、灰霉病、病毒病寄主范圍廣，缺乏抗源，易暴發(fā)流行，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，經(jīng)濟(jì)損失重大。赤星病容易暴發(fā)流行，隨空氣相對濕度的增加發(fā)病速度加快，具有間歇性和爆發(fā)性的特點，目前煙草赤星病已成為繼病毒病之后的第二類大病害。因此，防治煙草赤星病已成為當(dāng)前煙葉生產(chǎn)的重要工作。

白粉病發(fā)生范圍廣，嚴(yán)重時病斑布滿葉片，使煙葉喪失經(jīng)濟(jì)價值。白粉病防治建議主要有：①選用抗病品種，如‘K326’‘云煙87’‘廣黃10號’‘廣黃46 號’‘廣黃55號’‘白肋21’‘白肋52’等；②加強(qiáng)田間栽培管理，適時早栽，控制密度，及時采收，通風(fēng)透光，增施鉀肥、控制氮肥、平衡施肥，做好田間排水；③采用化學(xué)藥劑防治，發(fā)病初期，選用粉銹寧(三唑酮)可濕性粉劑或甲基托布津可濕性粉劑[2]。煙草野火病在所有種煙省(區(qū)) 均有發(fā)生。目前，提高植物抗病性、種植抗病品種是控制該病害較有效的手段[10-11]。以前，煙草青枯病和煙草灰霉病是熱帶、亞熱帶地區(qū)煙草的主要病害之一，中國僅在長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，而此次調(diào)查結(jié)果顯示，灰霉病在陜西煙區(qū)有流行趨勢。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)高度重視，提早預(yù)防，控制病害蔓延。

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Received 2015-10-01Returned2015-01-07

First authorWU Kuan, male，doctoral student.Research area:plant pathology.E-mail:wukuan1988@ nwsuaf.edu.cn

KANG Zhensheng, male, professor.Research area:plant immunology.E-mail:Kangzs@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Investigation of Main Tobacco Diseases and Viruse Molecular Detection in Shaanxi

WU Kuan1,2, CHEN Wei1,2, CHENG Julong2and KANG Zhensheng1

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100, China; 2.Shaanxi Tobacco Research Institute, Xi’an710061, China)

AbstractTo determine the pathogens of tobacco in Shaanxi province.Based on survey of tobacco fields from 2013-2015 in Shaanxi, nine kinds of diseases were identified respectively, such as brown spot, powdery mildew, black shank, gray mold, bacterial granville wilt, angle spot, wildfire, nematode root-knot and viral mosaic, of which brown spot, powdery mildew, gray mold, black shank, bacterial granville wilt, angular leaf spot and viral mosaic disease occured often in most years, and also leaded to serious destructions, reversely, wildfire and nematoda root-knot only happened in individual fields.Virus types of tobacco were made of tobacco mosaic virus (TMV), cucumber mosaic virus (CMV), potato virus Y (PVY), tobacco etch virus (TEV) and tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV), among them the detection rate of CMV, TMV, TEV and PVY were 23.6%, 34.7%, 21.3%, 18.4% respetively, for TMV+CMV, CMV+TEV, CMV+PVY was 27.4%, 24.9%, 20.9% respectively, mixing of virus occured widely, it decreased large losses in Shaanxi.So this study provides important guidance for tobacco disease control in the production.

Key wordsTobacco; Brown spot; Powdery mildew; Black shank; Viral mosaic; Multiple PCR

收稿日期：2015-10-01修回日期：2016-01-07

基金項目：中國煙草總公司科技重點項目(110200902046)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃(B07049)。

通信作者：成巨龍，男，研究員，主要從事煙草病蟲害研究。E-mail：julongc@126.com

中圖分類號S435.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0933-06

Foundation itemNational Tobacco Corporation (No.110200902046); the 111 Project of the Education Ministry of China (No.B07049). CHENG Julong, male, research fellow.Research area:tobacco protection.E-mail: julongc@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0919.040.html

第一作者：吳寬，男，博士研究生，研究方向為植物病理學(xué)。E-mail：wukuan1988@nwsuaf.edu.cn

康振生，男，教授，主要從事植物免疫學(xué)研究。E-mail：Kangzs@nwsuaf.edu.cn