楊　靜，王　萍，石　磊

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古野生蔬菜種質(zhì)資源與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特　010019)

籽用西瓜SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

楊靜，王萍，石磊

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古野生蔬菜種質(zhì)資源與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特010019)

摘要采用L25(56)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SCoT-PCR)的5個(gè)因素(Taq酶用量、Mg2+濃度、模板 DNA 用量、dNTPs 濃度和引物濃度) 進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，建立了籽用西瓜SCoT-PCR反應(yīng)體系：Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、Taq酶 1.5 U、引物 0.5 μmol·L-1、模板DNA 20 ng，總體積20 μL。比較各因素對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，其中以Mg2+濃度的影響最大，Taq酶用量的影響最小。應(yīng)用22個(gè)籽用西瓜品種驗(yàn)證該體系穩(wěn)定可靠，并從 41個(gè) SCoT 引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的22個(gè)引物，并逐一篩選出最適退火溫度。該反應(yīng)體系的建立為今后利用SCoT標(biāo)記技術(shù)對(duì)籽用西瓜種質(zhì)遺傳多樣性評(píng)價(jià)、指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇育種等研究提供了新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞籽用西瓜；SCoT-PCR；體系優(yōu)化；正交設(shè)計(jì)

籽用西瓜(Citrulluslanatusvar.megulasnemusLin et Chao)[1],屬于葫蘆科普通西瓜亞種中的籽瓜變種,俗稱“打瓜”“瓜籽瓜”,主要以種子為食用器官。籽用西瓜在植物學(xué)上有不同分類，依其種子顏色可以分為紅籽瓜和黑籽瓜2種,依其板型則分為大板、中板、小板[2]。籽瓜的分布較廣, 主要分布在甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、寧夏、廣西等10省(區(qū))，呈現(xiàn)南“紅”(紅瓜子)北“黑”(黑瓜子)的種植格局,每年播種面積在10萬(wàn)hm2以上,已成為南方和西北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(Start codon targeted polymorphism， SCoT) 分子標(biāo)記是Collard等[3]在水稻上提出的基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)(Single primer amplification reaction，SPAR) 的新型分子標(biāo)記，是一種新的目的基因分子標(biāo)記。其原理是根據(jù)植物基因中的 ATG 翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記。具有操作簡(jiǎn)單、引物通用性強(qiáng)、成本低、多態(tài)性高、遺傳信息豐富、能有效產(chǎn)生與性狀聯(lián)系標(biāo)記、有利于輔助育種等優(yōu)點(diǎn)。該標(biāo)記兼具RAPD和ISSR的優(yōu)點(diǎn)，除可作為對(duì)ISSR和RAPD的有效補(bǔ)充之外，更能利用該分子標(biāo)記有效跟蹤性狀[4]。該分子標(biāo)記目前已成功應(yīng)用于柑橘[5]、芒果[6]、草莓[7]、葡萄[8]、牡丹[9]、鐵皮石斛[10]、枇杷[11]和番木瓜[12]等多種植物，但在籽用西瓜遺傳多樣性上以及種質(zhì)鑒定等方面未見(jiàn)報(bào)道。由于籽用西瓜是西瓜的變種，本身資源缺乏，育種材料親緣關(guān)系過(guò)分單一，造成籽用西瓜育種工作很難取得突破。籽用西瓜育種要取得突破關(guān)鍵在于優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用，本研究旨在較全面地建立并優(yōu)化籽用西瓜的 SCoT 反應(yīng)體系，篩選出最適SCoT引物，為應(yīng)用 SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步研究籽用西瓜種質(zhì)資源的起源、進(jìn)化及遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。為此，本試驗(yàn)以籽用西瓜為材料，利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化籽用西瓜的 SCoT-PCR 反應(yīng)體系，并篩選適用于籽用西瓜的 SCoT 引物，為其在籽用西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、遺傳資源評(píng)價(jià)分析、圖譜構(gòu)建與種質(zhì)鑒定以及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支撐及理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑

供試材料取自萌發(fā)6 d后的種子(表1)，經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥24 h后充分研磨。其中‘內(nèi)蒙黑中片’‘道縣紅籽瓜’和‘蘭州大板一號(hào)’分別用于SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化、退火溫度的篩選及引物的篩選，所列22個(gè)試材均用于優(yōu)化體系的驗(yàn)證。

SCoT 引物序列來(lái)自于 Collard 等[3]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DL2000 Marker、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、10×Buffer 等均購(gòu)自全式金生物工程有限公司。

表1　供試材料信息

注：6～22號(hào)籽用西瓜品種均由國(guó)家西瓜與甜瓜中期庫(kù)提供。

Note:All of 6-22 seed-used watermelon were provided by watermelon and melon middle library of countries.

1.2基因組DNA的提取與檢測(cè)

籽用西瓜基因組DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)[13]，所得DNA用紫外分光光度法和10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其質(zhì)量及完整性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將DNA稀釋至所需濃度后，-20 ℃保存待用。

1.3SCoT-PCR擴(kuò)增程序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BYQ6031E-505型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。初始擴(kuò)增程序參考 Collard 等[3]和韓國(guó)輝等[14]的方法，具體反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，47.7 ℃復(fù)性退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán) 35次，最后72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃下保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入2 μL 6×loading buffer，取4～6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在10 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液為0.5×TBE，經(jīng)Gelview核酸染料染色后，電壓120 V電泳1 h，最后紫外燈下照相保存。

1.4SCoT-PCR體系的正交優(yōu)化設(shè)計(jì)

采用 L25(56)正交表設(shè)計(jì)，對(duì)反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板5種影響因素設(shè)置5個(gè)水平(表2)共25個(gè)組合。試驗(yàn)以‘內(nèi)蒙黑中片’基因組DNA為模板，S19為擴(kuò)增引物，每個(gè)處理重復(fù)2次。各處理的PCR擴(kuò)增體系為20 μL，每個(gè)處理10× Buffer用量均為2.0 μL，不足部分用ddH2O補(bǔ)足。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行人工評(píng)分后，利用正交設(shè)計(jì)助手 3.1軟件進(jìn)行直觀分析。

表2　L25(56)正交試驗(yàn)的因素及水平

1.5SCoT引物和退火溫度的篩選

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇‘蘭州大板一號(hào)’和‘道縣紅籽瓜’，運(yùn)用最佳反應(yīng)體系進(jìn)行引物篩選和退火溫度的確定試驗(yàn)(表3)。

表3　籽用西瓜SCoT引物篩選及最適退火溫度

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

參照何正文等[15]和姜小鳳等[16]的方法對(duì)電泳結(jié)果打分，主要依據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳條帶的多少、清晰度、雜帶的多少以及背景顏色對(duì)正交試驗(yàn)各個(gè)處理依次打分:1～25(最差的擴(kuò)增結(jié)果記“1”分; 條帶多態(tài)性最高、清晰度最好、分散性強(qiáng)和背景顏色少的最佳擴(kuò)增結(jié)果記“25”分)。根據(jù)打分結(jié)果進(jìn)行直觀分析，在假設(shè)不存在交互作用情況下，試驗(yàn)每一因素下各水平的平均值能夠反映影響因素各水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，因此本試驗(yàn)首先根據(jù)電泳平均得分求出每一因素下各水平的均值Ki用以反映因素各水平的影響大小; 最后求出同一因素不同水平間平均值的極差R，用最大平均值減去最小平均值即為同因素不同水平間的極差R，R大小反應(yīng)該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的程度，R越大說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響越大。

1.7反應(yīng)體系穩(wěn)定性的驗(yàn)證

根據(jù)所確定的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系，選用多個(gè)引物對(duì)22個(gè)籽用西瓜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證該SCoT-PCR最適反應(yīng)體系的可靠性及穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1籽用西瓜DNA濃度的檢測(cè)

對(duì)提取的籽瓜DNA純度進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示所得的DNA條帶清晰完整，無(wú)拖尾現(xiàn)象。用Biophotometre型核酸蛋白儀檢測(cè)DNA濃度，OD260/OD280為1.9～2.0，說(shuō)明所提取的籽瓜DNA較純凈，無(wú)雜質(zhì)污染，可用于試驗(yàn)研究進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2籽用西瓜SCoT反應(yīng)體系的正交優(yōu)化分析結(jié)果

正交試驗(yàn)采用‘內(nèi)蒙黑中片’基因組DNA為模板，S19為擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(圖1)。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的處理組合，由于Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物和模板DNA用量搭配組合的不同，擴(kuò)增結(jié)果存在著明顯的差異。其中，處理1、2、3無(wú)擴(kuò)增結(jié)果，處理4、6、9、10、20、21、25條帶弱，處理5、7、8、11、12、13、14、15、16、22、23、24條帶亮但不清晰，擴(kuò)增效果以組合17、18、19為最好，條帶亮且清晰。依據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳條帶的多少、清晰度、雜帶的多少以及背景顏色對(duì)正交試驗(yàn)各個(gè)處理依次打分，最好的記為25分，最差的記為1分，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析(表4)。

根據(jù)直觀分析結(jié)果，各因素極差R大小依次為 Mg2+>模板DNA>引物>dNTPs>Taq酶，表明各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響程度大小亦以此排序。根據(jù)直觀分析中各因素水平下的得分?jǐn)?shù)據(jù)平均值Ki可以確定各個(gè)因素的最適濃度(得分最高)，由表4中的Ki值可以初步確定各因素單一最佳水平分別為：Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、Taq酶 1.5 U、引物 0.7 μmol·L-1、模板DNA 60 ng。但相應(yīng)組合在正交設(shè)計(jì)表中并未出現(xiàn)，該體系與組合17最為接近，只是引物與模板DNA含量有所不同，根據(jù)組合 17 的擴(kuò)增效果并結(jié)合經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇0.5 μmol·L-1、20 ng 作為引物與模板DNA最佳用量，所以確定最佳組合為 17。因此，籽用西瓜SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系為總體積20 μL中含Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、Taq酶 1.5 U、引物 0.5 μ mol·L-1、模板DNA 20 ng。Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。在17、18、19組合中Mg2+的濃度相對(duì)較高，均為2.5 mmol·L-1，是最佳水平，而1～5組合Mg2+濃度最低，表明籽用西瓜在SCoT-PCR擴(kuò)增上需要較高濃度的Mg2+，并且Mg2+的影響最大。而其他組合在Mg2+濃度適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)均有條帶，說(shuō)明其他因素對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的影響較小。

M.DL2000 marker；1～25.處理編號(hào),同表4 　Code is the same as table 4

處理組合TreatmentNo.Mg2+/(mmol·L-1)dNTPs/(mmol·L-1)Taq/U引物/(μmol·L-1)PrimerDNA/ng評(píng)分Score11.000.050.500.3020121.000.150.750.4030131.000.251.000.5040141.000.351.250.6050251.000.451.500.70601861.500.050.750.50501671.500.151.000.60602081.500.251.250.70202291.500.351.500.303014101.500.450.500.404012112.000.051.000.703020122.000.151.250.304021132.000.251.500.405019142.000.350.500.506021152.000.450.750.602023162.500.051.250.406022172.500.151.500.502025182.500.250.500.603024192.500.350.750.704023202.500.451.000.305020213.000.051.500.604010223.000.150.500.705022233.000.250.750.306019243.000.351.000.402021253.000.451.250.503012K14.613.816.015.018.4K216.817.816.415.014.2K320.817.016.415.013.4K422.816.215.815.815.8K516.817.017.221.020.0R18.24.01.46.06.6

2.3引物篩選

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定的籽用西瓜SCoT-PCR 最佳反應(yīng)體系，以‘蘭州大板一號(hào)’基因組 DNA為模板，對(duì)41個(gè)引物進(jìn)行篩選，篩選出條帶清晰、種間差異明顯、多態(tài)性好的 22個(gè)引物用于后續(xù)籽用西瓜的SCoT分析。22個(gè)引物擴(kuò)增效果如圖2。

2.4最適退火溫度的篩選

利用優(yōu)化的 SCoT 體系對(duì)篩選出的每一個(gè)引物逐一進(jìn)行退火溫度的篩選，根據(jù)(50±5) ℃的溫度設(shè)定范圍，PCR儀自動(dòng)生成10個(gè)溫度梯度，分別為45.0 ℃、45.7 ℃、46.6 ℃、47.7 ℃、49.0 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、53.0 ℃、54.1 ℃、55.0 ℃。退火溫度的高低直接影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合，當(dāng)退火溫度過(guò)低時(shí)，非特異性擴(kuò)增條帶的數(shù)目增加，當(dāng)退火溫度過(guò)高時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合能力差，電泳條帶弱從而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，而不同的引物退火溫度可能不同。根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，選擇擴(kuò)增條帶數(shù)量多、條帶清晰的作為最適退火溫度，擴(kuò)增效果相同的情況下選擇溫度高的作為最適退火溫度，以確保 PCR產(chǎn)物的特異性。其中引物S8和S26的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。由S8擴(kuò)增結(jié)果可以看出，當(dāng)退火溫度低于 47.7 ℃時(shí)，非特異性條帶較多，溫度為 47.7 ℃時(shí)條帶多且清晰，此后隨著退火溫度的升高特異性增強(qiáng)，條帶減少，由于 SCoT 的引物較短，溫度過(guò)高可能會(huì)影響其擴(kuò)增效果，所以確定引物 S8 的最適退火溫度為47.7 ℃。由S26擴(kuò)增結(jié)果可以看出，當(dāng)退火溫度低于 49.0 ℃時(shí)，條帶弱且少，溫度為 49.0 ℃時(shí)條帶多且清晰，大于49.0 ℃時(shí)條帶減少，所以引物 S26 的最適退火溫度為49.0 ℃。各引物最適退火溫度見(jiàn)表3。

M.DL2000 marker；S3～S62.引物同表3　SCoT primers as table 3

M.DL2000 marker；1～10：退火溫度　Annealing temperatures 45.0, 45.7, 46.6, 47.7, 49.0, 50.4, 51.8, 53.0, 54.1,55.0 ℃

2.5籽用西瓜SCoT-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

選用S8、S19、S21等多個(gè)引物及其最適退火溫度，對(duì)已優(yōu)化的籽用西瓜SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行多次重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果表明，所用引物均能在供試材料中擴(kuò)增出清晰度高、分散性好、多態(tài)性高、亮度適中、重復(fù)性好的條帶。如引物S8在22份供試材料中能擴(kuò)增出清晰可見(jiàn)、分散性好、重復(fù)性高的條帶(圖4)。由此可見(jiàn)，優(yōu)化的反應(yīng)體系穩(wěn)定性好、多態(tài)性好、重復(fù)性高、擴(kuò)增效果良好，適用于籽用西瓜的多方面研究，能滿足諸如遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等方面的需要，為SCoT標(biāo)記在籽用西瓜中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

M.DL2000 marker；1～22.處理編號(hào),同表1　Code is the same as table 1

3討論與結(jié)論

隨著功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，目的基因分子標(biāo)記越來(lái)越受到研究者重視，因其本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密連鎖，這樣通過(guò)對(duì)某個(gè)分子標(biāo)記篩選即能對(duì)性狀進(jìn)行篩選，從而加速育種進(jìn)程。為此，建立一種簡(jiǎn)單、有效和實(shí)用的目的基因分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)籽用西瓜遺傳育種研究等方面有著重要意義。SCoT 標(biāo)記作為一種基于 PCR 技術(shù)的新型分子標(biāo)記具有諸多優(yōu)點(diǎn)，能更好地反應(yīng)物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

SCoT 標(biāo)記作為一種新型的目的基因分子標(biāo)記，雖然在多種植物上證明具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、引物通用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于不同材料所適用的反應(yīng)體系仍有很大不同，因此，采用 SCoT 分子標(biāo)記時(shí)應(yīng)首先對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)方法，對(duì)籽用西瓜SCoT-PCR 反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物及模板 DNA 等主要因素的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響程度大小為 Mg2+>模板DNA>引物>dNTPs>Taq酶，且各因素下不同水平間及各因素間差異均未達(dá)顯著水平，而且經(jīng)過(guò)比較此標(biāo)記下不同的試驗(yàn)材料均有較為明顯的差異。侯小改等[9]、龍治堅(jiān)等[17]、王玉等[18]和姜小風(fēng)等[16]對(duì)牡丹、芥菜、玫瑰和葡萄的研究中，均認(rèn)為Mg2+是影響SCoT-PCR反應(yīng)體系最主要的因素，這與本研究結(jié)果相一致。研究認(rèn)為Mg2+濃度對(duì)TaqDNA聚合酶的活性起決定作用，當(dāng)其濃度過(guò)低時(shí)，酶活力明顯降低，濃度過(guò)高則催化非特異片段的擴(kuò)增[19]。本試驗(yàn)結(jié)果與該結(jié)論相符，并表明籽用西瓜在SCoT-PCR擴(kuò)增上需要較高濃度的Mg2+。

目前，SCoT分子標(biāo)記在瓜類上的應(yīng)用僅局限于絲瓜，在有關(guān)籽用西瓜SCoT-PCR反應(yīng)優(yōu)化體系建立上還未見(jiàn)報(bào)道。蔣雅琴等[20]建立的絲瓜SCoT-PCR的反應(yīng)體系為總體積20 μL中含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.5 mmol·L-1、引物 0.5 μmol·L-1、模板DNA 50 ng、Taq酶 1.0 U。本體系的成分含量與其相比，引物濃度相同，Mg2+、Taq酶濃度略高，dNTPs和模板DNA濃度是其含量的近1/3，說(shuō)明在籽用西瓜SCoT-PCR體系中，用較低濃度的dNTPs和模板DNA就能起到相同的效果。由此可知，本試驗(yàn)得出的反應(yīng)體系從經(jīng)濟(jì)角度和實(shí)驗(yàn)操作等方面均達(dá)到了最優(yōu)效果，從而降低試驗(yàn)成本并且證實(shí)了本試驗(yàn)的成功。

SCoT分子標(biāo)記的引物在不同植物中具有一定的通用性。侯小改等[9]、趙瑞強(qiáng)等[10]、楊祥燕等[12]及陳虎等[13]已驗(yàn)證Collard等[3]開(kāi)發(fā)的SCoT-PCR引物在牡丹、石斛、番木瓜及龍眼中的通用性。本試驗(yàn)利用 ‘蘭州大板一號(hào)’基因組DNA為模板，從Collard等[3]報(bào)道的一部分SCoT引物中篩選 22 個(gè)適于籽用西瓜 SCoT 分析的引物，驗(yàn)證了SCoT分子標(biāo)記的引物具有一定的通用性。本試驗(yàn)對(duì)篩選出的引物逐一進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同的引物最適退火溫度不同，范圍從 46.6 ℃ 到 55.0 ℃，而不同于其他植物的引物均采用單一退火溫度。

綜上所述，該試驗(yàn)建立并優(yōu)化了籽用西瓜SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系為總體積20 μL中含Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、Taq酶 1.5 U、引物 0.5 μ mol·L-1、模板DNA 20 ng。從41條引物中初步篩選出22條符合多態(tài)性要求的SCoT引物，并利用不同的籽用西瓜品種和引物對(duì)優(yōu)化出的籽用西瓜SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系進(jìn)行了驗(yàn)證，得到多態(tài)性高、重復(fù)性好的條帶，大小為250～2 500 bp，驗(yàn)證了其穩(wěn)定性及可靠性。為后期籽用西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析、遺傳資源評(píng)價(jià)分析、圖譜構(gòu)建與種質(zhì)鑒定以及分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)支撐及理論依據(jù)，也為此標(biāo)記應(yīng)用于其他植物的研究提供了借鑒。

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Received 2015-09-29Returned2015-10-09

First authorYANG Jing,female,master student.Research area: germplasm resources and germplasm innovation.E-mail:964054378@qq.com

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsible editor:PAN Xueyan)

Optimization for SCoT-PCR System and Primer Selection of Seed-used Watermelon

YANG Jing, WANG Ping and SHI Lei

(Key Laboratory of Wild Vegetable Germplasm Resources and Innovation,College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot010019,China)

AbstractAn orthogonal design L25(56) was used to optimize SCoT-PCR (start codon targeted polymorphism) amplification system of seed-used watermelon in five factors such as Taq DNA polymerase, Mg2+, DNA template, dNTPs and primer concentrations).The results showed that the optimized system was 2.5 mmol·L-1Mg2+, 0.15 mmol·L-1dNTPs, 1.5 U Taq polymerase, 0.5 μmol·L-1primer, 20 ng DNA template in 20 μL mixture.Each factor had different effect on the results.The concentration of Mg2+was the key factor affecting the SCoT-PCR system.The optimized SCoT-PCR system was tested on 22 seed-used watermelons，and the result was stable and reliable.From the 41 primer combinations tested, 22 were selected with clear band patterns and abundant polymorphism.The most suitable annealing temperature of primers was selected.The optional reaction system provide a new technology for evaluation of genetic diversity, construction of fingerprinting, germplasm identification and molecular marker assisted breeding on seed-used watermelon.

Key wordsSeed-used watermelon; SCoT-PCR; Reaction optimization; Orthogonal design

收稿日期：2015-09-29修回日期：2016-10-09

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2016MS0356)；內(nèi)蒙古科技計(jì)劃項(xiàng)目(20090707,2010704,20110711,20120212);內(nèi)蒙古高寒地區(qū)高產(chǎn)安全蔬菜生產(chǎn)的研究與創(chuàng)新項(xiàng)目(NDPYTD2013-3)。

通信作者：王萍，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail: wangping@imau.edu.cn

中圖分類號(hào)S651

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0889-08

Foundation itemInner Mongolia Natural Science(No.2016MS0356);Science and Technology Plan Projects in Inner Mongolia(No.20090707,2010704,20110711,20120212)；Alpine Region of Inner Mongolia High Security Research and Innovation of Vegetable Production(No.NDPYTD2013-3). WANG Ping, female, associate professor,master’s supervisor.Research area:germplasm resources and germplasm innovation.E-mail: wangping@imau.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0919.030.html

第一作者：楊靜，女，碩士研究生，從事蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail:964054378@qq.com