孟 彬，孫敬鋒，呂愛軍

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

中草藥作為我國(guó)傳統(tǒng)瑰寶，經(jīng)過幾千年的傳承，其藥用價(jià)值在每個(gè)社會(huì)時(shí)期都曾得到廣泛認(rèn)可[1-2]。古代沒有化學(xué)藥物和抗生素，中草藥是唯一可選擇的藥物，對(duì)于當(dāng)時(shí)的疾病防治起著至關(guān)重要的作用[3]。時(shí)過境遷，即使在醫(yī)學(xué)水平相對(duì)發(fā)達(dá)的當(dāng)代，某些疾病的治療也會(huì)選擇中草藥作為輔助治療藥物，且有事半功倍的效果。

19世紀(jì)中葉，國(guó)外許多科學(xué)家開始對(duì)魚類的寄生蟲病進(jìn)行相關(guān)的描述記載，并且逐漸開始研究魚病的預(yù)防治療方法[4]。直到20世紀(jì)，世界范圍內(nèi)才開始針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物疾病進(jìn)行相關(guān)系統(tǒng)研究，其中包括病原生物的鑒別、分類、致病性、防治等方面，并且在這個(gè)過程中逐漸積累了豐富的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。在我國(guó)，相關(guān)研究在20世紀(jì)50年代后逐步開展，并且在魚類的細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲病、病毒性疾病等方面取得了一定的成果，在一定程度上解決了生產(chǎn)過程中魚類疾病的問題[5]。隨著近年來經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國(guó)已經(jīng)從傳統(tǒng)的粗放型養(yǎng)殖開始逐漸向集約化養(yǎng)殖模式過渡。但目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治過程中，對(duì)抗生素的依賴程度依然很大?？股氐氖褂貌坏共≡⑸锂a(chǎn)生了耐藥性，也會(huì)導(dǎo)致殘留藥物在動(dòng)物體內(nèi)和水體中蓄積，嚴(yán)重降低了水產(chǎn)品品質(zhì)，污染了養(yǎng)殖環(huán)境。

2006年歐盟頒發(fā)了相關(guān)的禁令，禁止整個(gè)歐盟區(qū)在畜牧及水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用抗生素，同時(shí)加強(qiáng)了對(duì)進(jìn)口水產(chǎn)品抗生素殘留的篩查力度，并且還抵制其他國(guó)家添加抗生素的產(chǎn)品向歐盟輸送。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也曾經(jīng)頒發(fā)《水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理規(guī)定》[6]，其中要求進(jìn)行無公害綠色養(yǎng)殖，并且鼓勵(lì)開發(fā)新的抗菌藥物對(duì)原有化學(xué)藥物和抗生素進(jìn)行替代。中草藥在我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治過程中的研究有廣泛的記載[7-11]。中草藥大部分都來源于自然環(huán)境，具有藥用價(jià)值高、功能顯著、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。但是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法提取中草藥有效成分，往往會(huì)破壞其活性成分，造成有效成分的活性大大降低，限制了中草藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的突飛猛進(jìn)，結(jié)合生物技術(shù)，尤其是酶工程、發(fā)酵工程等，將有益微生物和傳統(tǒng)中草藥相結(jié)合，不僅可以發(fā)揮中草藥的作用，還可以發(fā)揮微生物的作用，二者作用相輔相成，在疾病防治、環(huán)境保護(hù)、環(huán)境修復(fù)過程中均可以發(fā)揮一定的作用。

1 生物技術(shù)在發(fā)酵中草藥中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，傳統(tǒng)中草藥炮制工藝的弊端逐漸暴露出來，如中草藥活性成分提取不徹底，導(dǎo)致藥物起效時(shí)間較長(zhǎng)，藥用價(jià)值發(fā)揮不完全。某些中草藥具有一定的毒性，嚴(yán)重限制了部分中草藥的使用，或者使用后產(chǎn)生一些毒副作用。如用麻黃治療呼吸道疾病時(shí)，麻黃中的麻黃堿會(huì)導(dǎo)致人體心臟機(jī)能亢進(jìn)。雷公藤具有清熱涼血、活血化瘀的功效，但是這種草本植物有毒性，長(zhǎng)期均作為殺蟲劑使用，無法將其藥用價(jià)值完全利用[14]。這些因素至今是中草藥發(fā)展過程中無法突破的瓶頸。

現(xiàn)代發(fā)酵方法可以分為液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種,液體深層發(fā)酵不僅可以分離到菌絲體，而且生產(chǎn)量大、周期短、設(shè)備占地少; 固體發(fā)酵所需要的設(shè)備簡(jiǎn)單，發(fā)酵條件易控制，培養(yǎng)物中所有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和保健成分都可以被利用[15]。20世紀(jì)80年代，莊毅[16]創(chuàng)立了中藥的雙向發(fā)酵法，將具有活性成分的中藥作為藥性基質(zhì)，被藥用真菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物稱為藥用菌質(zhì)，整個(gè)發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)和生化反應(yīng)，產(chǎn)生新的活性成分和新的功能。中藥不僅能提供真菌所需營(yíng)養(yǎng)大量產(chǎn)生菌體，同時(shí)又能因真菌的酶而改變中藥的原有結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化為具有活性更強(qiáng)、毒性更低或生物利用度更高的新的化學(xué)成分，這就是新型的雙向性固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，無需將藥用真菌與次級(jí)代謝產(chǎn)物分離，二者共同使用，協(xié)同發(fā)揮藥效。發(fā)酵中草藥的目的是為了使有效成分最大程度地被釋放出來，并且增強(qiáng)其原有的性能，促進(jìn)藥物活性成分被更好吸收利用[17]。微生物的分解轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)大，并且其次級(jí)代謝產(chǎn)物也十分豐富[18-19]。利用微生物的生長(zhǎng)代謝與其生命活動(dòng)來轉(zhuǎn)化中草藥，與傳統(tǒng)中草藥炮制學(xué)的化學(xué)方法和物理方法相比有以下優(yōu)點(diǎn)：提高某些難以被直接利用成分的利用率，改變藥物活性，縮短藥物產(chǎn)生作用的必要時(shí)間，提高藥效，降低毒副作用，擴(kuò)大藥物的適應(yīng)癥等[20]。微生物發(fā)酵的條件通常都是十分溫和的，因此可以在最大程度上避免中草藥中的活性成分在發(fā)酵過程中被破壞，可以最大程度提取到活性高的有效成分，使得藥物在最大程度上發(fā)揮其藥用價(jià)值。

在我國(guó)，中草藥的生物轉(zhuǎn)化研究起始于20世紀(jì)80年代，并且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)的研究也在不斷深入。我國(guó)學(xué)者利用發(fā)酵工程技術(shù)，提高了靈芝、冬蟲夏草等藥用植物中多糖的含量，最大程度上發(fā)揮了這些珍稀藥用植物的價(jià)值[21]。通過發(fā)酵技術(shù)對(duì)中藥中有效成分的提取工藝進(jìn)行改進(jìn)后，降低了提取難度。有研究報(bào)道，利用自制復(fù)合酶對(duì)三七總皂苷、三七莖葉總皂苷等系列中藥有效成分進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，復(fù)合物酶能高效的將藥材中部分皂苷成分轉(zhuǎn)化為低極性皂苷[22]。此外，戴燊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，中草藥經(jīng)過發(fā)酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分含量都有了不同程度的提高。王身艷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，雙向發(fā)酵后，白芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷含量顯著下降，產(chǎn)生了新的物質(zhì)。

2 發(fā)酵中草藥的優(yōu)勢(shì)

2.1 減毒增效

中草藥的種類分為植物型、動(dòng)物型、真菌型等。近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中主要以植物型中草藥作為添加劑居多。中草藥中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。微生物在生長(zhǎng)繁殖過程中主要消耗動(dòng)植物的一些蛋白、糖類等物質(zhì)。中草藥經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后，使得原有的一些不易被吸收的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，極大程度提升了吸收利用率。這些小分子物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)代謝速率快，使得藥物的分解過程更為徹底，并且機(jī)體可以充分吸收這些物質(zhì)，有利于增強(qiáng)藥效，大大提升中草藥的利用率。同時(shí)，發(fā)酵可以減少原料中草藥的用量，有效地節(jié)約了成本[25]。陳永強(qiáng)等[26]的甘草微生物發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示，微生物發(fā)酵可有效破壞分解甘草細(xì)胞壁，促進(jìn)甘草中有效成分釋放，發(fā)酵次生產(chǎn)物甘草次酸，可被腸道直接吸收，迅速作用于靶部位，對(duì)急性抗炎鎮(zhèn)痛效果顯著。

另外，發(fā)酵技術(shù)可以利用微生物對(duì)某些藥物中的有毒物質(zhì)進(jìn)行分解，有效擴(kuò)大了這些藥物的藥用價(jià)值，豐富了疾病防治過程中可選擇的藥物種類。張普照等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，利用藥用真菌發(fā)酵雷公藤后，明顯降低了其自身的毒性，但對(duì)藥物活性的影響很小。董玫等[28]將肝癌細(xì)胞H22移植到健康小鼠體內(nèi)，分別喂食傳統(tǒng)煎制的六味地黃液和發(fā)酵六味地黃液。結(jié)果喂食發(fā)酵六味地黃液的患癌小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，但喂食傳統(tǒng)煎制六味地黃液對(duì)受試小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞并沒有明顯抑制作用。馬錢子在治療跌打損傷、骨痛、癱瘓時(shí)有一定的功效，但是這種藥材毒性也較強(qiáng)，臨床上的治療劑量接近中毒劑量，安全范圍較小[29]。潘揚(yáng)等[30]利用“雙向發(fā)酵”技術(shù)發(fā)酵馬錢子，結(jié)果顯示，馬錢子中毒性最強(qiáng)的成分馬錢子堿和士的寧的含量均有明顯降低，但是發(fā)酵并沒有影響馬錢子原有的抗炎、鎮(zhèn)痛功效，推測(cè)發(fā)酵技術(shù)在減小有毒中草藥毒性的過程中不會(huì)改變?cè)械乃幱没钚猿煞帧?/p>

2.2 產(chǎn)生新的物質(zhì)

中草藥經(jīng)過益生菌發(fā)酵后可以產(chǎn)生生物堿、有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體腸道中可以有效抑制有害致病菌的繁殖生長(zhǎng)。同時(shí)，中草藥中所含有的黃酮、皂苷、核苷酸、葉酸、多糖等活性成分本身也是益生菌生長(zhǎng)所需要的活性成分，二者相輔相成構(gòu)成了一個(gè)有機(jī)整體[31]。而且，部分中草藥在發(fā)酵過程中，微生物代謝所產(chǎn)生的酶類與特定的底物相結(jié)合可以產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，在原有藥材的固有藥物價(jià)值基礎(chǔ)上附加了一些新的藥用價(jià)值，有效擴(kuò)大了藥物的使用范圍及途徑。王玉紅等[32]向靈芝發(fā)酵液中加入黃芪，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中多糖成分發(fā)生了變化，提示可能有新物質(zhì)產(chǎn)生。李國(guó)紅等[33]用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)發(fā)酵三七根須，結(jié)果顯示產(chǎn)生了5種新物質(zhì)。張敏等[34]發(fā)酵大豆制作中藥淡豆豉，結(jié)果顯示，發(fā)酵后的淡豆豉中苷元成分增高，糖苷成分降低，表明發(fā)酵后的原料大豆的糖苷配基發(fā)生了解離，可以得到游離的苷元，并且產(chǎn)生了一種新的纖溶性較好的纖溶酶，提升了淡豆豉的藥用價(jià)值。金玲等[35]對(duì)決明子進(jìn)行發(fā)酵，觀察發(fā)酵前后5種蒽醌類成分的變化，發(fā)酵后大黃酚和大黃素甲醚增加至發(fā)酵前的2.15倍和1.34倍，蘆薈大黃素、大黃酸的含量也有一定程度的增加，多數(shù)游離型蒽醌含量呈上升趨勢(shì)，推斷發(fā)酵有利于增加決明子中蒽醌苷元的含量。張棟健等[36]對(duì)傳統(tǒng)中藥枳殼進(jìn)行發(fā)酵，比較同一批次的枳殼以及其炮制產(chǎn)物的超高效液相色譜，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的枳殼圖譜中出現(xiàn)了兩個(gè)新的色譜峰，提示有新物質(zhì)產(chǎn)生。杜晨暉等[37]按照一定比例將葛根黃連湯制成培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌，觀察發(fā)現(xiàn)，葛根黃連湯中酵母菌可以正常生長(zhǎng)并且培養(yǎng)基干質(zhì)量有所下降，表明酵母菌發(fā)酵過程中很可能利用了葛根黃連湯中的蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后的葛根黃連湯中的總黃酮和總生物堿含量均有一定程度的增加，推測(cè)很可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中酵母菌所產(chǎn)生的的纖維素酶、果膠素酶、糖苷素酶等降低了細(xì)胞壁對(duì)藥物有效成分溶出的阻礙，進(jìn)而增加了葛根黃連湯的有效成分。中藥發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過程，微生物經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生許多酶類，如單寧酶、果膠酶、淀粉酶等，在酶類物質(zhì)作用下，某些藥用成分發(fā)生分解轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生新的藥用成分。另外，中藥影響微生物的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而改變微生物的代謝途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，最終使中藥各組分成分的含量發(fā)生變化[38]。

2.3 協(xié)同發(fā)揮作用

發(fā)酵中草藥所選取的微生物大多是一些益生菌。益生菌可以促進(jìn)中草藥在腸道中的消化吸收率，中草藥中的藥用活性成分可以促進(jìn)腸道益生菌的增殖[39]。一些中草藥中有機(jī)酸含量很高，這些有機(jī)酸被人類或其他動(dòng)物攝食后進(jìn)入腸道，有利于保持腸道弱酸性的微環(huán)境。這種弱酸環(huán)境在抑制有害微生物繁殖的同時(shí)促進(jìn)了有益微生物的繁殖，腸道菌群處于穩(wěn)定狀態(tài)，使得中草藥中活性成分更容易被充分吸收。另外，微生物具有一種“破壁作用”，使得中草藥中的營(yíng)養(yǎng)成分更容易被充分利用，促進(jìn)了中草藥中有效成分在機(jī)體中的代謝和運(yùn)輸，在提高藥效的同時(shí)減少了藥物的使用量[40]。中草藥往往都含有一類活性物質(zhì)稱為生物堿。生物堿是一種廣泛存在于中草藥中的含氮有機(jī)化合物，是中草藥中的一類很重要的化學(xué)成分，對(duì)于疾病的防治起著重要的作用[41]。但是，生物堿類物質(zhì)的存在導(dǎo)致傳統(tǒng)煎制和提取出的中藥液有很強(qiáng)烈的苦味，在一定程度上限制了中藥液的利用。利用微生物發(fā)酵中草藥，某些可以產(chǎn)酸的益生菌所產(chǎn)生的酸可以中和生物堿，降低了中藥液中的苦味，改善了口感，增加了中草藥的利用率。但是藥效是否會(huì)發(fā)生改變，還需要根據(jù)不同類型的中藥以及益生菌設(shè)計(jì)不同的藥理模型，并且對(duì)成分提取后進(jìn)行相關(guān)的研究來證明[42]。

3 發(fā)酵中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果

3.1 提高誘食率，促進(jìn)生長(zhǎng)

3.2 增強(qiáng)機(jī)體抗病力

中草藥含有種類豐富的藥用活性物質(zhì)，如多糖、有機(jī)酸、生物堿、皂苷、揮發(fā)性油等，在這些物質(zhì)的作用下，中草藥即使單獨(dú)作為水產(chǎn)動(dòng)物免疫制劑使用也有很好的效果[48-50]。但是，中草藥中有些大分子活性物質(zhì)不易被機(jī)體吸收，通過微生物降解成小分子物質(zhì)，有利于水產(chǎn)動(dòng)物的吸收利用，可以最大程度提高利用率，并且可以去除一些大分子雜質(zhì)，有效增強(qiáng)藥效[51-52]。通過發(fā)酵技術(shù)加工處理后的中草藥制劑可以保留原有的藥物活性、增加其含量，增強(qiáng)中草藥藥理作用。具發(fā)酵作用的益生菌可以分泌抑菌物質(zhì)，也可以通過爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)或附著位點(diǎn)來抑制病原微生物的生長(zhǎng)。此外，這些益生菌具有甲基化、羥基化、氧化等強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化能力，中草藥經(jīng)過發(fā)酵后，其有效成分得到更加充分的分離、提取，增強(qiáng)了藥物的活性。同時(shí)，在大量活性酶的協(xié)助下，有利于發(fā)酵中草藥制劑被機(jī)體快速吸收，在疾病防治、免疫調(diào)節(jié)等方面充分發(fā)揮天然藥物和益生菌獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),這都是在益生菌協(xié)同下完成的[53]。趙倩等[54]用嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對(duì)鯉魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察一周后發(fā)現(xiàn)，死亡率為基礎(chǔ)飼料組>中草藥組>酵母菌發(fā)酵中草藥組>枯草芽孢桿菌發(fā)酵中草藥組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與喂食基礎(chǔ)飼料的對(duì)照組相比，喂食發(fā)酵中草藥制劑后，魚體溶菌酶活力上升，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐的含量均有所下降，說明添加發(fā)酵中草藥制劑可以提高鯉魚的免疫保護(hù)率和溶菌酶活力，進(jìn)而達(dá)到提高魚體免疫力的作用。Muona等[55]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中溶菌酶活性變化在一定程度上與循環(huán)系統(tǒng)白細(xì)胞數(shù)目變化呈正相關(guān)。湯菊芬等[56]在研究吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)免疫保護(hù)率時(shí)，設(shè)置了5個(gè)試驗(yàn)組。其中對(duì)照組僅添加了基礎(chǔ)飼料，其余組在基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上又添加了中草藥、益生菌制劑、復(fù)合益生菌制劑、發(fā)酵中草藥制劑。結(jié)果表明，中草藥和益生菌在單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)羅非魚的免疫保護(hù)率均有所提高。但是添加發(fā)酵中草藥制劑試驗(yàn)組明顯優(yōu)于其余4組，結(jié)果表明，無論是中草藥還是益生菌制劑對(duì)于提高羅非魚抗病能力均有顯著作用。發(fā)酵不僅將益生菌和中草藥進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，同時(shí)最大程度上發(fā)揮了它們?cè)谠鰪?qiáng)免疫力方面的積極作用。謝炎福[57]在研究鯽魚出血病的過程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)病魚分別投喂發(fā)酵中草藥制劑和單獨(dú)的復(fù)方中草藥制劑進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，添加發(fā)酵中草藥制劑組中鯽魚(Carassiusauratus)的成活率要優(yōu)于單獨(dú)添加復(fù)方中草藥制劑的對(duì)照組，表明發(fā)酵中草藥對(duì)于鯽魚出血病的治療有顯著作用。進(jìn)一步分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，達(dá)到相同治療效果時(shí)，試驗(yàn)組中發(fā)酵中草藥的添加量小于對(duì)照組中未發(fā)酵中草藥的添加量，說明發(fā)酵技術(shù)可以提高藥物利用率，節(jié)約成本。

3.3 凈化水質(zhì)，改善水產(chǎn)品品質(zhì)

4 展 望

目前，發(fā)酵中草藥制劑的研究尚處于起步階段，對(duì)于發(fā)酵條件、菌種選擇、培養(yǎng)基的選擇都亟待進(jìn)行相關(guān)研究。在開發(fā)發(fā)酵中草藥制劑的過程中要充分考慮以下因素：首先，水產(chǎn)動(dòng)物適應(yīng)的鹽度不同而分為淡水水產(chǎn)動(dòng)物和海水水產(chǎn)動(dòng)物，在開發(fā)過程中應(yīng)當(dāng)根據(jù)鹽度的差異選擇不同的益生菌和中草藥復(fù)方制劑，最大程度發(fā)揮有益效果。其次，根據(jù)水產(chǎn)動(dòng)物的種類及需求不同，選擇不同配比的發(fā)酵中草藥制劑。最后，提取發(fā)酵后的中草藥活性物質(zhì)后應(yīng)做相應(yīng)的分析。雖然目前沒有發(fā)酵中草藥會(huì)產(chǎn)生毒性物質(zhì)的報(bào)道，但是應(yīng)不斷研究，對(duì)可能含有毒性或功能不確定的活性成分加以分析、論證，真正創(chuàng)造出新型安全、綠色的添加劑。

發(fā)酵中草藥制劑為新型制劑，含有中草藥、益生菌的特點(diǎn)，使用后無殘留。不僅能改善藥用活性，發(fā)揮功效，其中的益生菌在進(jìn)入腸道后可以發(fā)揮自身特點(diǎn)促進(jìn)制劑的吸收。應(yīng)用這種制劑可以降低養(yǎng)殖過程中抗生素的使用，推進(jìn)無公害養(yǎng)殖的發(fā)展。

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