詹文會，張?zhí)K芳，耿紅衛(wèi)，王野影，郭 昆，陳 君

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中國林業(yè)科學(xué)院 森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091)

昆蟲經(jīng)過長期選擇進化，形成高度特化且靈敏的嗅覺感受系統(tǒng)來識別外界環(huán)境中的化學(xué)信息物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化為體內(nèi)電信號，最終指導(dǎo)昆蟲完成寄主搜尋、尋偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等一系列行為。昆蟲的嗅覺識別需要多種蛋白質(zhì)參與，主要有氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(Odorant receptors,ORs)、離子型受體(Ionotropic receptors,IRs)、感覺神經(jīng)膜蛋白(Sensory neuron membrane proteins,SNMPs)、氣味降解酶(Odorant-degrading enzymes,ODEs)等。天牛隸屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲總科(Chrysomeloidea)天?？?Cerambycidae)，是鞘翅目中較大的類群之一，為防護林和經(jīng)濟林的重要蛀干害蟲，全世界約有45 000種，中國已知3 100余種[1]。天牛食性雜，寄主廣，繁殖力強，一旦危害，對園林、果林和防護林有毀滅性危害。在天牛生活史中，幼蟲期所占時間最長，活動隱蔽，防治困難，而成蟲是天牛裸露活動的蟲態(tài)，因此成為防治的最佳階段。目前，基于天牛成蟲與寄主植物之間化學(xué)信息聯(lián)系的化學(xué)生態(tài)研究，已成為天牛防治新途徑的研究熱點。諸多研究表明，天牛的嗅覺在利用寄主植物釋放的揮發(fā)性次生物質(zhì)識別寄主的過程中起非常關(guān)鍵的作用。綜述了近年來天牛嗅覺相關(guān)蛋白研究進展，為基于嗅覺調(diào)控的環(huán)境友好型害蟲防治新技術(shù)的設(shè)計和開發(fā)提供依據(jù)。

1 天牛嗅覺感器

嗅覺感器是昆蟲感知周圍環(huán)境中各種化學(xué)物質(zhì)的重要基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，主要分布在昆蟲觸角上。天牛成蟲觸角為絲狀，共11節(jié)(個別種類12節(jié))，由柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)三部分構(gòu)成，其中鞭節(jié)分為9亞節(jié)。天牛觸角上分布的感器主要包括刺形感器、錐形感器、B?hm氏鬃毛、凹槽丁形感器和鐘形感器[2-5]，其中錐形感器通常壁很薄且表面具孔，因此被推斷為嗅覺感器。錐形感器在天?？品N類間形態(tài)變化較大，這種形態(tài)差異可能是識別不同寄主植物和環(huán)境中的信息化合物所導(dǎo)致。在黃星天牛(Psacotheahilaris)[6]、松褐天牛(Monochamusalternatus)[7]、曲紋花天牛(Lepturaarcuata)、橡黑花天牛(Lepturaaethiops)[8]和咖啡脊虎天牛(Xylotrechusgrayii)[5]等種類中均發(fā)現(xiàn)錐形感器在鞭節(jié)末端是成簇分布的，這種成簇分布的嗅覺感器增強了嗅覺感受功能并有助于長距離嗅覺分子的識別[9]。錐形感器不僅是一種嗅覺受體，在有些種類的天牛中還存在性二型現(xiàn)象，可能與性信息素的識別有關(guān)。如在曲紋花天牛和橡黑花天牛中均發(fā)現(xiàn)雄性個體錐形感器的數(shù)量顯著高于雌性，據(jù)此推斷雄性錐形感器具有感受雌性個體釋放的性信息素的功能[8]。

2 天牛嗅覺相關(guān)蛋白

相對于鱗翅目、膜翅目等類群，鞘翅目類群的嗅覺相關(guān)蛋白研究起步較晚。僅有大猿葉甲[10]、云南切梢小蠹[11]、紅酯大小蠹[12]、黃粉蟲[13]、花絨寄甲[14]、赤擬谷盜[15]、云杉八齒小蠹、中歐山松大小蠹[16]等十幾種鞘翅目昆蟲的嗅覺基因得到發(fā)掘和驗證；而在天?？评ハx中，目前僅對光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)、云斑天牛(Batocerahorsfieldi)和松褐天牛等少數(shù)物種的嗅覺相關(guān)基因進行鑒定。

2.1 氣味結(jié)合蛋白

嗅覺感受神經(jīng)元存在于嗅覺感器內(nèi)親水性的淋巴液中，而昆蟲感受的氣味物質(zhì)多為脂溶性的小分子化合物，因此這些小分子物質(zhì)最先與氣味結(jié)合蛋白結(jié)合，使其穿過親水性的淋巴液到達嗅覺神經(jīng)樹突膜上的氣味受體，最終引起昆蟲一系列行為。氣味結(jié)合蛋白是一類可溶性胞外蛋白[17]，作為脂溶性氣味分子的載體，由120～150個氨基酸組成，分子質(zhì)量為14～17 ku，等電點為4～5，N端有一段20個氨基酸的信號肽。二級結(jié)構(gòu)由6個α螺旋構(gòu)成多維二聚體，有6個保守的半胱氨酸位點，形成3個相互交連的二硫鍵。根據(jù)序列中保守半胱氨酸殘基數(shù)目和位點特征，OBPs分為Classic OBPs、Plus-C OBPs、Minus-C OBPs、非典型的OBPs等[18-19]。其中Classic OBPs又包含PBPs、GOBPs和ABPx。迄今，天?？浦挥袦项i天牛亞科4個種的OBPs被報道。

光肩星天牛是首個被報道OBPs的天牛種類，也是天?？莆ㄒ槐粶y定基因組的物種。王偉[20]利用mRNA差異顯示體系(DDRT-PCR)得到了光肩星天牛2個氣味結(jié)合蛋白AglaOBP1和AglaOBP2的全長序列。李慧恩等[21]通過構(gòu)建光肩星天牛觸角全長 cDNA文庫并結(jié)合表達序列標(biāo)簽(ESTs)分析，得到4條氣味結(jié)合蛋白全長序列。Hu等[22]在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定了42個OBPs基因，其中23個基因的N端編碼一段信號肽，開放閱讀框超過400 bp。根據(jù)OBPs半胱氨酸位置特征，鑒定出16個Minus-C OBPs基因、2個PBPs基因。其中，PBPs在觸角中高表達，尤其是AglaPBP2特異性表達于觸角，表達量是其他組織的200倍，說明觸角是信息素的主要識別位點，AglaPBP2在性信息素識別中起重要作用。McKenna等[23]完成了光肩星天牛的基因組測定，注釋了52個OBPs，包括31個Minus-C OBPs、20個Classic OBPs和1個Plus-C OBPs, 相對于其他已測定基因組序列的物種，光肩星天牛的Minus-C亞家族明顯擴張。

通過構(gòu)建云斑天牛的cDNA文庫和采用EST測序技術(shù)得到3個OBPs(BhorOBP1、BhorOBP2、BhorOBP3)、2個PBPs(BhorPBP1、BhorPBP2)和4個Minus-C OBPs的序列，并克隆了3個OBPs[24]和4個Minus-C OBPs[25]的基因。半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，云斑天牛OBP1—3和Minus-C OBP1—3在頭部(去除觸角和下顎須、下唇須)均不表達,而在觸角、下顎須、下唇須、翅、足和腹部均有表達，Minus-C OBP4在觸角、翅、足、腹部有表達；定量PCR顯示，3個OBPs基因在觸角的表達量最高，無論交配與否OBPs在雄蟲不同組織的表達量高于雌蟲，在羽化后1～5 d以及羽化后30 d左右，OBPs的表達量遠高于中間時期的表達量[24]。Minus-C OBPs在云斑天牛整個生活史中都表達，與OBPs相反，無論交配與否雌蟲的表達量均高于雄蟲[25]。各種氣味結(jié)合蛋白在雌、雄蟲中及不同時期表達量存在差異，表明OBPs在雄蟲尋找配偶和雌蟲尋找補充營養(yǎng)寄主及產(chǎn)卵場所的過程中發(fā)揮著重要的功能。對氣味結(jié)合蛋白BhorOBP2進行原核表達、純化，并利用熒光競爭結(jié)合試驗檢測其與云斑天牛寄主揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)BhorOBP2與反-2-己烯醛、2-丁基丁醛、水楊醛、馬鞭草烯酮、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、β蒎烯、乙酸乙酯等結(jié)合能力強，推測BhorOBP2與鏈?zhǔn)交衔镉休^強的結(jié)合能力，同時結(jié)合能力受化合物碳鏈長度影響[24,26]。BhorOBP2與大多數(shù)的寄主揮發(fā)物有較好的結(jié)合特性，因此，推測BhorOBP2在云斑天牛寄主定位過程中起著關(guān)鍵性的作用。通過分子建模和對接試驗檢測BhorOBPm2和化合物的作用機制，BhorOBPm2因缺少1對二硫鍵而有更大的彈性、更大的結(jié)合腔和更多的配基特異性結(jié)合，因此認為Minus-C OBPs提供了OBPs進化過程中的中間結(jié)構(gòu)[27]。除了克隆、表達后驗證OBPs的功能外，卓志航等[28]從云斑天?？偟鞍字刑峒儾⑦M行葡聚糖凝膠G75層析分離，獲得云斑天牛觸角中的一種蛋白，該蛋白pur-pro.I與熒光探針1-NPN發(fā)生熒光結(jié)合反應(yīng)，證明其為云斑天牛的一種氣味結(jié)合蛋白。

松褐天牛有31個OBPs。高雄等[29-30]通過構(gòu)建松褐天牛cDNA文庫，克隆了4個OBPs基因(MaltOBP2—5)。Wang等[14]通過測定松褐天牛成蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組，得到了25個OBPs基因(MaltOBP5—29)的序列,其中全長基因21個，并克隆了5個OBPs基因。隨后錢凱等[31]克隆了2個OBPs基因即MaltOBP2和MaltOBP6，其中MaltOBP2與高雄[29]克隆的MaltOBP2基因序列相同。李娜[32]克隆了9個MaltOBPs基因全長，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，松褐天牛OBPs基因在不同發(fā)育時間和不同組織間表達量有明顯差異，且其表達量受性別和交尾狀態(tài)的影響，例如MaltOBP7主要表達于松褐天牛成蟲足中且在雌蟲中表達量較雄蟲高；MaltOBP12和MaltOBP15基因在交配后雌蟲中的表達量顯著高于未交配雌蟲，這可能與雌蟲交配后尋找產(chǎn)卵場所有關(guān)。昆蟲嗅覺相關(guān)基因的表達在其生存和繁殖中起著很重要的作用。MaltOBP9和MaltOBP10基因分別在羽化5 d雌蟲和雄蟲的下唇須和下顎須中高表達，可能與下顎須和下唇須密布嗅覺感受器，行使重要的嗅覺感受功能有關(guān)[33]。MaltOBP13和MaltOBP19分別于雄蟲和羽化5 d雌蟲腹末3節(jié)中高表達[32-33]，表明其與昆蟲性成熟有關(guān)，不同發(fā)育時期的表達量和天牛行為相關(guān)，松褐天牛嗅覺相關(guān)蛋白在羽化0 d高表達可能與尋找食物有關(guān)，5 d或13 d高表達可能與尋找配偶、產(chǎn)卵場所等行為有關(guān)。松褐天牛雄蟲中，MaltOBP7、MaltOBP13、MaltOBP14、MaltOBP18、MaltOBP20 基因在羽化0 d有較高的表達量，可能與其取食行為有關(guān)，這種取食行為有利于其達到性成熟[34]。MaltOBP24在1 d雌蟲觸角中的表達量顯著高于其他時期觸角中的表達量，可能與初羽化的寄主定位行為有關(guān)；MaltOBP21在13 d已交配雌蟲觸角中的表達量顯著高于其他時期觸角中的表達量，可能與成蟲的生物學(xué)特性有關(guān)。松褐天牛成蟲在識別寄主揮發(fā)物過程中雌、雄間存在差異，大部分氣味結(jié)合蛋白基因在雄蟲中的表達量高于雌蟲中的表達量，雄蟲比雌蟲更容易識別寄主和尋找配偶等[35]。綜上所述，對松褐天牛OBPs表達量的研究有助于預(yù)測OBPs在天牛行為中的作用。天牛嗅覺蛋白的研究主要集中在成蟲階段，而錢凱等[31]研究了MaltOBP2和MaltOBP6在松褐天牛不同發(fā)育階段的表達量，發(fā)現(xiàn)MaltOBP2 在蛹觸角中的表達量最高，在成蟲觸角中的表達量最低，而MaltOBP6 在幼蟲頭部的表達量最高。通過熒光競爭結(jié)合試驗測定其他8個蛋白與寄主植物揮發(fā)物單體的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)MaltOBP3(Classic)和MaltOBP5(Minus)與檸檬烯氧化物等5種化合物均有較強的結(jié)合能力，其中對(-)-檸檬烯結(jié)合能力最強，另外，MaltOBP3對a-異松油稀等6種化合物、MaltOBP5對R-(-)-檸檬烯和 (+)-a-蒎烯分別有較強的結(jié)合力[29]。王娟[33]測定了Minus-C亞家族的MaltOBP9和MaltOBP21，Classic亞家族的MaltOBP10，Plus-C亞家族MaltOBP19和MaltOBP24在中性和酸性環(huán)境下與18種松樹揮發(fā)物單體的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)它們在中性環(huán)境下與揮發(fā)物的結(jié)合能力普遍高于酸性環(huán)境。在中性條件下，MaltOBP9和MaltBOP21對其中β-石竹烯等4種揮發(fā)物都有較強的結(jié)合能力，而MaltOBP19和MaltOBP24結(jié)合特性方面表現(xiàn)出比較大的差異，其中MaltOBP19對17種揮發(fā)物均表現(xiàn)出強結(jié)合力，而MaltOBP24僅對3-蒈烯等5種揮發(fā)物表現(xiàn)強結(jié)合力。而屬于Classic OBPs的MaltOBP13蛋白在酸性條件下與寄主揮發(fā)物的競爭結(jié)合能力明顯高于中性條件。無論在酸性還是中性條件下，MaltOBP13對丁羥基甲苯均具有較強的結(jié)合特性。在酸性條件下，除與崁酮、莰烯、(+)-長葉環(huán)烯結(jié)合能力相對較弱外，與其他物質(zhì)均具有很強的結(jié)合能力。在中性條件下，與S-(-)-檸檬烯等9種化合物結(jié)合能力很強，其中，與丁羥基甲苯結(jié)合能力最強，與(+)-檸檬烯氧化物等7種化合物結(jié)合能力較弱[36]。不同氣味結(jié)合蛋白對化合物有明顯的特異性識別，說明它們參與寄主識別。

李廣偉等[37]通過測定黃斑星天牛(Anoplophoranobilis)雌蟲觸角的轉(zhuǎn)錄組，共鑒定到16個OBPs基因，包括11個Minus-C OBPs、3個Classic OBPs和2個Plus-C OBPs。半定量PCR研究表明，OBPs基因在各個組織中都有表達。與鱗翅目昆蟲相比，天牛等鞘翅目昆蟲觸角中分布著更多的Minus-C OBPs。許多研究表明，Minus-C OBPs更多存在于較為原始的物種中，推測Minus-C類型是OBPs家族的祖先類型，昆蟲OBPs隨著物種進化，產(chǎn)生更多半胱氨酸殘基形成二硫鍵來穩(wěn)定其高級結(jié)構(gòu)，有利于蛋白質(zhì)與氣味分子的特異性識別[38]。

2.2 化學(xué)感受蛋白

昆蟲嗅覺感器內(nèi)淋巴液中除了氣味結(jié)合蛋白，還有另一類水溶性蛋白化學(xué)感受蛋白，它與氣味結(jié)合蛋白具有類似功能，1994年首次在黑腹果蠅觸角中被發(fā)現(xiàn)[39]。該類蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為10～15 ku，由100～120個氨基酸組成，N端有17～25個氨基酸的信號肽。典型特征是具有4個保守半胱氨酸殘基，且形成2對二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其在昆蟲中同源性很高，表達分布部位為觸角、性腺、下唇須、足等。Wang等[14]通過構(gòu)建松褐天牛轉(zhuǎn)錄組，鑒定12個CSPs轉(zhuǎn)錄本，其中8個為全長轉(zhuǎn)錄本。李慧等[24,40]通過測定云斑天牛觸角得到3個化學(xué)感受蛋白基因，且3個基因在云斑天牛組織中廣泛分布，說明化學(xué)感受蛋白具有多種功能。除下唇須和下顎須外的其他組織中，無論交尾與否雄蟲BhorCSPs的表達量均顯著高于雌蟲。在不同發(fā)育時期，雌蟲的表達量變化較小而雄蟲變化較大，在大部分時期交尾后雄蟲的表達量最高。交尾后雌蟲在羽化后5 d和20～25 d時間段BhorCSPs表達量較高，推測CSPs在云斑天牛尋找寄主補充營養(yǎng)和尋找產(chǎn)卵場所過程中有一定作用。雄蟲BhorCSPs的表達量在翅中變化最大，未交尾雄蟲在羽化10 d或者15 d表達量最高，交尾雄蟲在10 d或者30 d表達量最高。在整個發(fā)育時期BhorCSPs的表達模式非常復(fù)雜，各基因間不同的表達模式說明化學(xué)感受蛋白具有多種功能。王偉[20]利用DDRT-PCR技術(shù)得到了光肩星天牛AglaCSP1基因，并對該蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。Hu等[22]在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定12個CSPs基因，均具有完整的ORF，除CSP4外，其他基因N末端有信號肽。這12個CSPs基因分別在觸角、下唇須、下顎須和足等多種組織中高表達，且包括非感受組織，說明其功能具有多樣性。

2.3 氣味受體

昆蟲的氣味受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族，有7個跨膜結(jié)構(gòu)，且具有與脊椎動物相反的拓撲結(jié)構(gòu)[41]。同時與OBPs和CSPs相比，昆蟲間的ORs高度分化，使得其鑒定難度加大，需要借助基因組的測序工作。直到1999年，在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)了昆蟲的第1個OR[42]，隨后又在多種昆蟲中鑒定出各自的ORs。昆蟲的氣味受體位于嗅覺神經(jīng)元樹突膜上，一般大約由400個氨基酸組成，而且多數(shù)氣味受體神經(jīng)元表達2類不同的受體：一類是共受體OR83b，該類受體數(shù)量少，不直接參與感知氣味分子，具有高度保守的特性，Orco屬于此類受體；另一類是傳統(tǒng)受體ORs，此類受體又稱普通氣味受體，數(shù)量多，且保守性低。

目前，ORs在許多鱗翅目、膜翅目昆蟲中的研究較多，而在鞘翅目昆蟲中的研究較少，第1個被報道ORs的天?？莆锓N是胡桃縊虎天牛(Megacyllenecaryae)。Mitchell等[43]測定了胡桃縊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組，獲得了57個ORs基因序列，其中包括30個全長ORs基因、26個部分序列和1個Orco基因。為檢測ORs基因的功能，將9個ORs基因克隆并轉(zhuǎn)入pGEMHE載體在爪蛙卵母細胞共表達，然后選擇雄性天牛成蟲產(chǎn)生的9種信息素作為供試配體化合物，結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)對ORs基因功能進行驗證，最終確定McaOR3對(S)-2-甲基-1-丁醇敏感，McaOR20對(2S,3R)-2,3-己二醇敏感，McaOR5對2-苯乙醇敏感。并且發(fā)現(xiàn)McaOR3和McaOR20對其他天牛的相似信息素也敏感，說明同源受體也存在于其他天牛物種中。Wang等[14,33]通過構(gòu)建松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組得到8條ORs片段序列和1條全長序列MaltOR1，后者編碼451個氨基酸。在光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組中鑒定37個ORs，其中7個為全長基因，系統(tǒng)發(fā)育樹中大多數(shù)ORs聚在多條分支，這表明該受體蛋白保守性低，保證天牛嗅覺系統(tǒng)的特異性。光肩星天牛AglaOR9與1個家蠶、5個鞘翅目昆蟲和1個西方蜜蜂Orco基因聚在一支，說明Orco基因在不同種屬之間保守性比OR基因高，因此可判定AglaOR9為光肩星天牛的共受體基因[22]。氣味受體作為將外界化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘栕罱K引起昆蟲行為反應(yīng)過程中的關(guān)鍵蛋白，其具體功能有待進一步探討。從光肩星天牛基因組中鑒定132個ORs基因，包括1個Orco基因、120個ORs基因、11個ORs假基因，其中3個ORs基因在雌蟲中高表達，1個ORs基因在雄蟲中高表達，這些受體功能未知，可根據(jù)其他天牛的受體基因進行推測，如將AglaOR29、AglaOR35—36和AglaOR65—68分別與胡桃縊虎天牛的McarOR3、McarOR5和McarOR20[23,44]相比進行推測，后者的功能已被驗證。

2.4 其他嗅覺相關(guān)蛋白

除了上述的3類蛋白質(zhì)外，人們對參與昆蟲嗅覺識別的離子型受體、感覺神經(jīng)膜蛋白、氣味降解酶等蛋白質(zhì)的研究較少。目前有少數(shù)文獻進行了基因鑒定，如Hu等[22]通過對光肩星天牛轉(zhuǎn)錄組研究獲得1條ODE、14條PDEs(Pheromone-degrading enzymes)、4條IRs和2條SNMPs基因序列，通過對光肩星天牛的基因組研究得到72條IRs基因序列；Wang等[14]通過測定分析松褐天牛觸角的轉(zhuǎn)錄組，得到了1條SNMPs基因全長序列。但是這些基因的功能目前在天牛中還未見報道。

3 展望

目前對鞘翅目中嗅覺蛋白的研究只報道了12個種，天牛科中報道了5個種，僅赤擬谷盜和光肩星天牛等個別物種大部分嗅覺蛋白家族有系統(tǒng)報道，多數(shù)物種只研究了1個或幾個蛋白家族甚至只報道了個別基因序列。由于物種和序列的局限性，不能做整個嗅覺蛋白家族的進化分析，無法將OBPs等進一步區(qū)分到型，鞘翅目作為昆蟲綱最大的目，更多物種的嗅覺基因需要鑒定，這對于整個昆蟲綱嗅覺蛋白的進化研究具有重要意義。另外，與鱗翅目等其他昆蟲類群相比，天牛嗅覺基因的功能研究采用的方法單一，僅利用生化指標(biāo)及原核表達純化蛋白等途徑來研究蛋白質(zhì)功能，而通過RNA干擾或基因敲除等手段觀察昆蟲行為來研究基因功能的報道很少，是未來需要進一步拓展的方向之一。

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