林冬果+林錦瓊+李佩文+楊娜+徐邦牢+劉大漁??

摘要構(gòu)建了一種具有自動形成細胞培養(yǎng)陣列和多步驟靈活操作特點的開放式微流控芯片。此芯片具有3層復(fù)合式結(jié)構(gòu)： 底層為微通道貫穿的細胞培養(yǎng)池陣列，頂層是開放式培養(yǎng)池，二者之間為一層納米孔薄膜。納米孔薄膜具有“透氣阻水”的特性，既起到止流閥作用實現(xiàn)液體自動分配，又允許跨膜擴散，模擬血管內(nèi)皮層擴散屏障結(jié)構(gòu)。結(jié)合移液工作站，開放式微流控芯片可以完成細胞換液、藥物處理和細胞活力測試等一系列分析步驟。本研究以乳腺癌細胞為模型，在芯片上90 s內(nèi)可構(gòu)建包含三維細胞培養(yǎng)和仿真血管內(nèi)皮的10×10腫瘤組織微陣列。形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測證實了芯片腫瘤組織的仿真效果?？鼓[瘤藥物測試結(jié)果表明，這種開放式微流控組織陣列芯片允許在仿真條件下進行包含復(fù)雜操作步驟的細胞實驗，是細胞研究的有利工具。

關(guān)鍵詞開放式微流控芯片； 納米孔薄膜； 三維細胞培養(yǎng)； 組織微陣列； 抗腫瘤藥物測試

1引 言

微流控芯片是細胞生物學(xué)研究的有力工具，除了微流控芯片所共有的特點，如高通量、低試劑消耗和功能集成[1～5]，微流控細胞分析芯片的另一優(yōu)勢是可在微尺度條件下重建細胞微環(huán)境[6]。一方面，微流控芯片便于利用各種形式的微結(jié)構(gòu)實現(xiàn)3D細胞培養(yǎng)，以模擬生物組織結(jié)構(gòu)[7，8]； 另一方面，微流控芯片具有與微血管尺度相似的通道網(wǎng)絡(luò)，便于實現(xiàn)精確的流體控制以仿真血管[9，10]。3D細胞培養(yǎng)與微流控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合，可以在芯片上構(gòu)建仿真組織乃至器官芯片系統(tǒng)。

文獻報道的微流控細胞培養(yǎng)系統(tǒng)多采用灌流培養(yǎng)方式，這些芯片使用微通道網(wǎng)絡(luò)串聯(lián)細胞培養(yǎng)單元[11～14]。灌流通道網(wǎng)絡(luò)有利于實現(xiàn)細胞分布，從而構(gòu)建高密度細胞培養(yǎng)陣列，還可以實現(xiàn)微血管功能，保證及時的物質(zhì)交換[15，16]。然而，灌流培養(yǎng)芯片也面臨著一些挑戰(zhàn)，如難以精確控制和測量微通道內(nèi)特定位置的pH值、氧氣和細胞營養(yǎng)水平； 連續(xù)灌流導(dǎo)致的試劑消耗增加； 應(yīng)對復(fù)雜操作的靈活性限制[17～20]。

為解決現(xiàn)有微流控細胞培養(yǎng)芯片的限制和不足，研究者提出了開放式微流控芯片[21～23]。這類芯片使用開放式細胞培養(yǎng)池，因而可以同時或順序地加入不同的物質(zhì)作用于細胞。與封閉式微流控芯片相比，開放式微流控芯片更有利于實現(xiàn)多種類型的多步驟復(fù)雜操作[24～26]。但是，由于開放式微流控芯片通常沒有微通道網(wǎng)絡(luò)，因而無法通過液體流動分布構(gòu)建高密度細胞陣列。因此，開放式微流控芯片的分析通量大多有限。為解決這個問題，Zhu等[27]發(fā)展了一種結(jié)合了自動移液平臺的半開放式微流控芯片。這種半開放式微流控芯片使用油包水液滴作為細胞培養(yǎng)器，而培養(yǎng)液交換、藥物處理和細胞活性測試等一系列操作可通過安裝在移液平臺上的毛細管在微量注射泵控制下順序完成。該課題組利用這種半開放式微流控芯片系統(tǒng)實現(xiàn)了高密度懸浮細胞培養(yǎng)陣列的程序化操作[28]，顯示出了靈活性和高通量的優(yōu)點。

在上述工作啟發(fā)下，本研究構(gòu)建了一種多層復(fù)合結(jié)構(gòu)的開放式微流控芯片，以實現(xiàn)高度仿真條件下的多步驟復(fù)雜細胞操作。這種微流控芯片包含3層結(jié)構(gòu)： 底層為微通道貫穿的細胞培養(yǎng)池陣列，頂層是開放式培養(yǎng)池，二者之間為一層納米孔薄膜。納米孔薄膜具有“透氣阻水”的特性，既可以起到止流閥作用， 實現(xiàn)液體自動分配，又允許跨膜擴散，模擬血管內(nèi)皮層擴散屏障結(jié)構(gòu)。這種微流控芯片的優(yōu)勢在于： （1）借助自動液體分散構(gòu)建高密度細胞培養(yǎng)陣列，便于實現(xiàn)高通量分析； （2）結(jié)合了3D細胞培養(yǎng)和仿真血管內(nèi)皮層，允許在仿真微環(huán)境下進行細胞實驗； （3）開放式芯片結(jié)構(gòu)提供了液體操作的最大靈活性和微環(huán)境穩(wěn)定性。本研究以乳腺癌細胞為模型，在芯片上構(gòu)建了腫瘤組織微陣列，并評價了其生物仿真性能?？鼓[瘤藥物測試結(jié)果表明，此開放式微流控組織陣列芯片允許在仿真微環(huán)境條件下進行包含復(fù)雜操作步驟的細胞實驗，可成為細胞研究的有利工具。

2實驗部分

21儀器與試劑

IX71倒置熒光顯微鏡、IX81激光共聚焦顯微鏡（日本 Olympus公司）； TS2A微量注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前體及引發(fā)劑（美國Dow Corning公司）； 聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）薄膜（孔徑200 nm，英國Whatman公司）； SU8 3035光刻膠及顯影液（美國MicroChem公司）； PBS、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、025%胰蛋白酶EDTA溶液、細胞核染料DAPI（4'，6diamidino2phenylindole）、 鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）、鈣黃綠素AM /溴化乙錠二聚體1（Calcein AM/EthD1）混合細胞染料（美國Thermo Fisher公司）； 抗vinculin單克隆抗體（美國 Pierce公司）； 抗ECadherin單克隆抗體（美國， BD）， 抗βCatenin單克隆抗體（英國ABCAM公司）； FITC、Cy3熒光標(biāo)記二抗（武漢博士德公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Sigma公司）； 鹽酸阿霉素、紫杉醇（深圳萬樂藥業(yè)公司）； 海藻酸鈉、Triton X100、多聚甲醛（上海生工公司）。所有試劑均為分析純。硅片（直徑4 英寸， 浙江立晶硅材料有限公司）。MCF7乳腺癌細胞株由中山大學(xué)腫瘤中心提供。

22微流控芯片結(jié)構(gòu)與加工

微流控芯片包含3層結(jié)構(gòu)（圖1）： PDMS底層使用標(biāo)準(zhǔn)軟刻蝕工藝[29]加工，包含10×10串聯(lián)細胞培養(yǎng)池，每個串聯(lián)培養(yǎng)池單元有流體入口和出口。PDMS頂層是使用PDMS平板打孔后獲得的具有一系列通孔結(jié)構(gòu)，封接后形成儲液池陣列，與底層的細胞培養(yǎng)池對應(yīng)。兩層PDMS之間封接有PC薄膜。按Aran等 [30]報道的方法將PC膜先后與底層和頂層封接，得到完整芯片。

23細胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF7細胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)基。細胞增殖至70%～80%表面覆蓋度時， 025%胰蛋白酶EDTA溶液消化3 min，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心3 min，棄上清液。細胞重懸于含2%海藻酸鈉的DMEM培養(yǎng)基中備用。endprint

24芯片上的細胞種植與培養(yǎng)

芯片和聚四氟乙烯毛細管在使用前，置于80℃烘箱中烘烤1 h。微量注射器在75%乙醇中浸泡6 h， 用滅菌蒸餾水沖洗3遍。使用前，芯片、毛細管和注射器均置于紫外燈下照射。使用時，在潔凈操作臺上通過毛細管連接芯片與微量注射器。

使用注射泵將細胞懸液（3×106 細胞/mL）從芯片入口處以30 mL/min的流量引入芯片。待細胞懸液填充所有細胞培養(yǎng)室后，將過量的液體從出口排出。頂部培養(yǎng)池加入40 mmol/L CaCl2溶液3 μL，保留15 min后，用等體積DMEM培養(yǎng)基替換。將芯片安裝于一個塑料盒內(nèi)，盒子底面放有生理鹽水（含05% Triton X100）潤濕濾紙。封閉盒蓋后，將芯片連同塑料盒轉(zhuǎn)移到37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。在隨后的3天內(nèi)，每次更換培養(yǎng)液時將塑料盒安放在移液工作站上，并打開盒蓋。移液工作站上的三維步進電機和注射器協(xié)同操作實現(xiàn)芯片上定量定位液體轉(zhuǎn)移。完成移液后，合上蓋子，并將該芯片置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

25細胞成像

細胞培養(yǎng)3天后，用等體積Calcein AM/EthD1染料混合液置換培養(yǎng)基，避光保存20 min后移去熒光染液，然后將芯片置于倒置熒光顯微鏡觀察并成像。平行實驗中，從微流控芯片中取出水凝膠塊，并轉(zhuǎn)移到含EDTANa2的小瓶中。海藻酸鈣凝膠與Ca2+螯合劑EDTA接觸時溶解，釋放的細胞團用冷PBS快速洗滌，并用多聚甲醛溶液（37%，PBS中）固定15 min。將收集的細胞按照文獻[31]的方法包埋在瓊脂糖中，再將瓊脂糖包埋在石蠟塊中，用于制備組織切片。組織切片用于HE染色和免疫熒光成像。

26細胞活力評估

Calcein AM/EthD1染色后，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。細胞存活率p按公式（1）計算：

p=NG/（NG + NR）× 100%（1）

其中， NG 和NR分別是綠色熒光和紅色熒光細胞數(shù)量。

27抗腫瘤藥物測試

芯片培養(yǎng)第3天顯微鏡下確認(rèn)腫瘤微球形成后，將系列濃度阿霉素和紫杉醇作用于芯片培養(yǎng)細胞。芯片上的藥物處理步驟包括： （1）移去舊培養(yǎng)基，將含有藥物的培養(yǎng)液加入到指定的儲液池中，芯片置于培養(yǎng)箱中24 h； （2）移去含有藥物的培養(yǎng)液，用3 μL PBS溶液洗滌2次去除藥物殘留； （3）向儲存池中加入Calcein AM/EthD1染色后，將芯片置于熒光顯微鏡下拍照。

對照2D培養(yǎng)組實驗中，96孔板中每孔加入100 μL密度為106 細胞/mL的細胞懸液（DMEM培養(yǎng)基中），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別加入含有系列濃度的抗腫瘤藥物； 對照常規(guī)3D培養(yǎng)組實驗中，96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液（密度3×106細胞/mL，分散于2%海藻酸鈉DMEM培養(yǎng)基中），之后加入10 μL 40 mmol/L CaCl2溶液，保留15 min后用等體積DMEM培養(yǎng)基替換。隨后3天內(nèi)，每天更換培養(yǎng)液。2D和常規(guī)3D培養(yǎng)組的抗腫瘤藥物處理與芯片培養(yǎng)組相同。

3結(jié)果與討論

31微流控芯片設(shè)計

本研究設(shè)計了一種包含納米孔薄膜的開放式微流控芯片。開放式微流控組織陣列芯片功能的實現(xiàn)有賴于納米孔薄膜的特性。首先，納米孔薄膜具有“透氣阻水”的特性。這是因為納米孔薄膜的濾過表面積極大，流經(jīng)氣體時摩擦力較小，因而可以自由通過，而流經(jīng)液體時，摩擦力極劇增加，因而無法順暢通過。在細胞懸液中添加了高粘度的海藻酸鈉溶液，進一步增加了流動摩擦力。實驗結(jié)果表明，在細胞懸液灌注過程中納米孔薄膜可以保留液體而不發(fā)生泄漏。因此，納米孔薄膜起到止流閥作用，利用這種芯片結(jié)構(gòu)借助于液體的自動分配得以構(gòu)建高密度細胞培養(yǎng)陣列； 其次，納米孔薄膜孔徑接近于內(nèi)皮間隙尺寸，可模擬血管內(nèi)皮層的擴散屏障作用。這種擴散屏障既允許溶液中分子的跨膜擴散，又能避免液體轉(zhuǎn)移時對細胞的擾動。在微流控芯片細胞培養(yǎng)體系中，3D培養(yǎng)細胞模擬實體組織； 水凝膠可以支持、滋養(yǎng)和保護細胞，仿真間質(zhì)； 而納米孔薄膜模擬血管內(nèi)皮層（圖1B）。因此，這種開放式微流控組織陣列芯片允許在仿真微環(huán)境條件下進行各種類型包含復(fù)雜操作步驟的細胞測試。

32微流控芯片上組織陣列的構(gòu)建

在芯片底層進樣通道中，細胞懸液流動方向依據(jù)主通道和分支通道的阻力變化而調(diào)整（圖 2）。初始狀態(tài)下，主通道內(nèi)的流動阻力較大，因而細胞懸液先流入分支通道并填充細胞培養(yǎng)室，同時將培養(yǎng)室內(nèi)的空氣經(jīng)薄膜排出。當(dāng)液體接觸到納米孔薄膜時，流動阻力迅速增加，分支通道的阻力增大，細胞懸液重回到主通道。以此類推，細胞懸液順序填充一系列串聯(lián)的培養(yǎng)池。細胞懸液可在90 s內(nèi)完成所有培養(yǎng)池填充（圖 2B）。由于納米孔薄膜的流動阻力足夠高，細胞懸液未發(fā)生泄漏。完成細胞分散后，將CaCl2溶液加入頂部培養(yǎng)層。Ca2+經(jīng)薄膜擴散至下方培養(yǎng)室，形成海藻酸鈣水凝膠，作為支撐3D細胞培養(yǎng)的支架。

細胞連續(xù)培養(yǎng)3天內(nèi)，熒光染色結(jié)果顯示細胞密度持續(xù)增加。連續(xù)熒光密度分析顯示，每天的細胞增殖率約為70%。至第3天，可見腫瘤球結(jié)構(gòu)形成（圖 3），細胞活性檢測結(jié)果表明，腫瘤球內(nèi)細胞存活率為96%。上述結(jié)果表明，開放式微流控芯片上腫瘤組織陣列已經(jīng)形成。

33芯片腫瘤組織的仿真性

共聚焦激光掃描顯示芯片微室內(nèi)的MCF7細胞在培養(yǎng)第3天形成腫瘤球結(jié)構(gòu)（圖4A）。HE染色的組織切片顯示類腫瘤組織結(jié)構(gòu)的形成，腫瘤細胞形成團狀，局部具有不完全極性的腺管結(jié)構(gòu)（圖4B）。免疫熒光成像觀察MCF7細胞在2D和3D芯片培養(yǎng)條件下， 腫瘤細胞F肌動蛋白（Factin）、粘著蛋白（Vinculin）、E鈣粘蛋白（ECadherin）和β鈣粘蛋白（βCatenin）的表達模式的差別（圖 5）。在2D培養(yǎng)細胞中，MCF7細胞的Factin表達水平較低，并且多分布于細胞膜連接處，而在芯片3D細胞培養(yǎng)中，F(xiàn)actin在細胞質(zhì)中均勻表達； ECadherin是上皮細胞間連接蛋白，其在芯片3D細胞培養(yǎng)的微流控芯片中表達也增高，提示腫瘤細胞上皮分化。βCatenin和Vinculin分別是細胞細胞連接蛋白和細胞間質(zhì)連接蛋白，這兩種蛋白在2D培養(yǎng)細胞中均呈散點狀分布，提示上述蛋白定位不當(dāng)。相比之下，芯片3D培養(yǎng)腫瘤細胞的βCatenin和Vinculin都均勻表達在膜上。上述結(jié)果表明，一系列結(jié)構(gòu)蛋白在芯片3D培養(yǎng)條件下的表達和定位均接近體內(nèi)狀態(tài)。因此，芯片3D培養(yǎng)條件下的腫瘤細胞可以高度仿真實體腫瘤組織。endprint

34抗腫瘤藥物反應(yīng)測試

細胞培養(yǎng)3天后，順序完成以下芯片操作： （1）移去舊培養(yǎng)基； （2）含有不同藥物的培養(yǎng)液加入指定的儲液池中； （3）藥物處理24 h后移去含有藥物的培養(yǎng)液； （4）洗滌去除藥物殘留； （5）向儲存池中加入Calcein AM/EthD1染色； （6）移除染液； （7）儲液池中補充PBS液。上述一系列操作在移液工作站上程序化完成，操作簡便。

在不同的培養(yǎng)環(huán)境中，MCF7細胞對藥物的反應(yīng)不同（圖6）。 根據(jù)實驗結(jié)果計算的IC50值依照2D→普通3D→芯片3D的趨勢遞增，這種趨勢在紫杉醇測試中尤為明顯（見圖6B）。在2D培養(yǎng)中，由于擴散屏障的缺失，藥物可以高效地進入細胞， 因而殺傷作用非常明顯。相比之下，簡單的水凝膠3D培養(yǎng)模式下細胞對藥物的敏感性有所降低。這是由于腫瘤球結(jié)構(gòu)的形成模擬了腫瘤實質(zhì)，而水凝膠模擬了細胞外基質(zhì)，這些擴散屏障削弱了細胞殺傷作用。相比普通3D培養(yǎng)，芯片3D培養(yǎng)細胞對抗腫瘤藥物的敏感性進一步降低。這可能是因為納米孔薄膜仿真了血管內(nèi)皮層結(jié)構(gòu)，進一步限制了藥物向腫瘤細胞的擴散。因此，血管內(nèi)皮層擴散屏障的模擬對于構(gòu)建仿真腫瘤組織至關(guān)重要。本研究發(fā)展的微流控芯片構(gòu)建包括血管內(nèi)皮層、細胞外基質(zhì)和腫瘤實質(zhì)的完整擴散屏障結(jié)構(gòu)，是實現(xiàn)體外抗腫瘤藥物測試的有利的技術(shù)平臺。

4結(jié) 論

本實驗設(shè)計一種開放式組織陣列微流控芯片。此芯片系統(tǒng)具有以下特性： （1） 通過自動液體分配簡易地實現(xiàn)高密度細胞培養(yǎng)陣列； （2） 結(jié)合仿真血管內(nèi)皮層和3D培養(yǎng)細胞構(gòu)建仿生腫瘤組織； （3） 能夠靈活應(yīng)對包含復(fù)雜操作的細胞測試。本研究提出的微流體體系靈活且易于使用，可為仿生微環(huán)境條件下進行復(fù)雜的多步驟細胞分析提供理想的工具。

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