邱宗林 王秋虹 孫豐卉 王澤 林蘭

[摘要] 目的 研究清潤方對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠肝臟內(nèi)沉默調(diào)節(jié)蛋白（SIRT）/核因子κB（NF-κB）信號通路的影響。 方法 選取90只12周齡的Wistar雄性大鼠作為研究對象，其中15只作為正常組，其余75只采用脂肪乳灌胃30 d和腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立2型糖尿病胰島素抵抗模型。將造模成功的60只糖尿病大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分成模型組、二甲雙胍組[250 mg/（kg·d）]、清潤方大劑量組[11.2 g/（kg·d）]、清潤方中劑量組[5.6 g/（kg·d）]和清潤方小劑量組[2.8 g/（kg·d）]，每組12只。各組均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)8周。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測各組肝組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量，qRT-PCR法和Western blot法檢測肝組織中SIRT1、NF-κB和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與模型組比較，清潤方大劑量組TNF-α水平降低（P < 0.05），清潤方大、中劑量組IL-6水平降低（P < 0.05），清潤方各劑量組SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P < 0.05），清潤方大、中劑量組GLUT4的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高（P < 0.05），清潤方大、中劑量組NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05）。 結(jié)論 清潤方可能通過促進(jìn)糖尿病大鼠肝臟中SIRT1的表達(dá)，從而下調(diào)NF-κB的表達(dá)水平來改善胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 清潤方；2型糖尿??；胰島素抵抗；沉默調(diào)節(jié)蛋白/核因子κB信號通路

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（a）-0004-05

Effecf of Qingrun Formula on SIRT/NF-κB signal pathway in liver of diabetic rats

QIU Zonglin WANG Qiuhong SUN Fenghui WANG Ze LIN Lan▲

Department of Endocrinology， Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

[Abstract] Objective To study the effect of Qingrun Formula on sirtuin （SIRT）/nuclear factor-κB （NF-κB） signal pathway in livers of rats with diabetes mellitus and insulin resistance. Methods Ninety 12-week old Wistar male rats were selected as objects， 15 rats were as normal group， the other 75 rats were induced by intraperitoneal injection of Streptozotocin （STZ） and gavage with fat milk for 30 days. After successful modeling， 60 rats with diabetes were randomly divided into model group， Metformin group [250 mg/（kg·d）]， high dosage of Qingrun Formula group [11.2 g/（kg·d）]， middle dosage of Qingrun Formula group [5.6 g/（kg·d）] and low dosage of Qingrun Formula group [2.8 g/（kg·d）]， with 12 rats in each group. Each group was given medicine by gavage， once a day， lasting for 8 weeks. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in liver tissues of each group were tested by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mRNA and protein expression levels of SIRT1， NF-κB and glucose transporter 4 （GLUT4） in liver tissues of each group were tested by qRT-PCR and Western blot. Results Compared with model group， the level of TNF-α decreased in high dosage of Qingrun Formula group （P < 0.05）， the level of IL-6 decreased in high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of SIRT1 increased in each dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of GLUT4 increased in high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）， the mRNA and protein expression levels of NF-κB decreased in the high and middle dosage of Qingrun Formula groups （P < 0.05）. Conclusion Qingrun Formula may alleviate the insulin resistance by increasing the expression of SIRT1 and thereby decreasing the expression of NF-κB in the liver of diabetic rats.

[Key words] Qingrun Formula； Type 2 diabetes mellitus； Insulin resistance； Sirtuin/nuclear factor-κB signal pathway

2型糖尿病作為一種慢性多發(fā)性非傳染性疾病，嚴(yán)重威脅著全世界人們的健康，中國的糖尿病患者數(shù)已經(jīng)躍居全球第一[1]。2型糖尿病是一種涉及全身的復(fù)雜的代謝性疾病，眾多的基因、分子和蛋白質(zhì)參與其發(fā)生和發(fā)展的過程，其發(fā)生和發(fā)展的機制研究涉及信號通路和能量代謝等基礎(chǔ)生命科學(xué)問題。因此，從分子角度去探索糖尿病的發(fā)病機制意義重大[2]。清潤方（由黃柏、酒大黃和知母等組成）是中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院（以下簡稱“我院”）林蘭教授歷經(jīng)40余年臨床與科研創(chuàng)立的糖尿病中醫(yī)三型辨證中陰虛熱盛型的適用方，治療2型糖尿病陰虛熱盛患者臨床效果顯著[3]。動物實驗結(jié)果提示，清潤方在降低糖尿病大鼠血糖和改善胰島素抵抗方面療效確切[4]。本研究從SIRT/NF-κB信號通路的角度研究清潤方的作用機制?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠90只，體重（180±20）g，12周齡，購自維通利華實驗動物科技有限公司。實驗動物質(zhì)量合格證號：1140070030 4744。

1.1.2 實驗藥物及試劑 清潤方顆粒劑由我院顆粒藥房配制，由知母、黃柏和酒大黃等組成；鹽酸二甲雙胍（格華止）購自中美上海施寶貴有限公司（批號：H20023370）；鏈脲佐菌素（STZ）（批號：B57218）購自美國Sigma公司；白細(xì)胞介素6（IL-6）大鼠酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（批號：30680231）購自聯(lián)科生物；腫瘤壞死因子α（TNF-α）大鼠酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號：238240285）購自聯(lián)科生物；qPCR試劑盒SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×）Universal購自美國KAPA Biosystems公司（貨號：KK4601）；SIRT-1抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab110304）；NF-κB p65抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab16502）；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab33780）；β-actin抗體購自美國Abcam公司（貨號：TA-09）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備和分組 ①飼養(yǎng)條件：所有動物飼養(yǎng)于我院動物房，飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，相對濕度40%～60%。實驗室自然采光，通風(fēng)良好，照明晝夜明暗交替周期為12 h。所有大鼠自由攝食、攝水。②脂肪乳的制備：豬油（20%）、丙硫氧嘧啶（1%）、膽固醇（5%）、谷氨酸鈉（1%）、蔗糖（5%）、果糖（5%）、食用鹽（6%）溶于Tween80（20%）和丙二醇（30%）中。加水定量配制成脂肪乳。③造模方法：隨機選15只大鼠飼以基礎(chǔ)飼料為正常組，余75只造模。造模前先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。明暗周期12/12 h，自由攝食、飲水。造模時將Wistar大鼠灌胃脂肪乳10 d，灌胃量為10 mL/（kg·d）。動物禁食不禁水12 h后腹腔注射STZ 40 mg/（kg·d）（STZ溶于0.1 mol/L新鮮配制的枸櫞酸鈉緩沖液中，pH 4.2），共連續(xù)注射2 d，每次腹腔注射STZ后15 min，給大鼠腹腔注射胰島素0.4 U，2.5 h和5 h后灌胃給予25%葡萄糖10 mL/kg。最后1次注射STZ后72 h監(jiān)測血糖?？崭寡恰?6.7 mmol/L為糖尿病大鼠。繼續(xù)灌胃脂肪乳10 mL/（kg·d），共灌胃30 d。④分組方法：將造模成功的60只實驗動物按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組，二甲雙胍組，清潤方小、中、大劑量組，每組12只。

1.2.2 動物處理 模型組給予生理鹽水1 mL/（kg·d），二甲雙胍組給予二甲雙胍250 mg/（kg·d），清潤方大、中、小劑量組分別給予清潤方顆粒劑11.2、5.6、2.8 g/（kg·d）。每組均灌胃給藥，1次/d，均在每天相同時間灌服，連續(xù)8周。按照體表面積法換算人-大鼠的藥物劑量，清潤方大、中、小劑量組分別按成人劑量的14、7、3.5倍給藥。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 實驗結(jié)束前1 d傍晚開始，每組取10只大鼠禁食不禁水。第2天上午用10%的水合氯醛溶液以腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血。取血后，各組大鼠剝離出完整的肝臟組織，迅速摘取肝組織保存于液氮中。

1.2.4 ELISA法檢測各組肝組織中TNF-α和IL-6含量 按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別檢測各組肝組織樣本中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平，用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和570 nm或630 nm參考波長下的OD值。校準(zhǔn)后的OD值為450 nm的測定值減去570 nm或630 nm的測定值。

1.2.5 qRT-PCR法檢測各組肝組織中SIRT1、NF-κB和GLUT4的mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取各組肝組織樣本中的總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的含量。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。引物序列：SIRT1上游引物5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCA-3′，下游引物5′-CTGCAACCTGCTCCAAGGTA-3′；NF-κB p65上游引物5′-CAGACACCTTTGCACTTGGC-3′，下游引物5′-CTTGAGTAGGACCCCGAGGA-3′；GLUT4上游引物5′-AGCTGGTGTGGTCAATACCG-3′，下游引物5′-GGGCCAGGACCAATCTCAAA-3′；β-actin上游引物5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游引物5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。參照實時熒光定量PCR試劑盒說明完成熒光定量PCR的擴增。PCR擴增體系20 μL，包括SYBR Master Mix（2×）Universal 10 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，cDNA模板3 μL，再加ddH2O至終體積20 μL。在95℃ 10 min后，進(jìn)行40個循環(huán)擴增。每個循環(huán)擴增包括95℃ 10 s、59℃ 60 s。溶解曲線設(shè)為95℃ 15 s、72℃ 15 s、95℃ 15 s，一個循環(huán)。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參對照，每個樣本重復(fù)5次，記錄Ct值，取平均值。采用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。根據(jù)Ct值，計算SIRT1、NF-κB和GLUT4基因的相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot法檢測各組肝組織中SIRT1、GLUT4及NF-κB蛋白表達(dá)水平 將提取的肝組織置于緩沖液（RIPA∶PMSF=500∶1）中，于玻璃勻漿器中制成勻漿，冰上孵育，超聲處理，離心，提取組織蛋白。將樣本定量于20 μL，凝膠電泳90 min，然后轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜后，用5%的低脂蛋白封閉液封閉1 h，用5%BSA-TBST稀釋鼠單克隆抗體SIRT1（1∶1000），4℃水平搖床孵育過夜。次日洗膜，TBST洗3次，每次10 min。用5%BSA-TBST稀釋二抗山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（1：10 000），室溫孵育40 min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min。ECL滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3 min，膠片曝光。圖片掃描后，使用軟件Gel Image system ver. 4.00對圖像進(jìn)行灰度分析。采用β-actin作為內(nèi)參對照，同樣的方法測定NF-κB和GLUT4的蛋白水平。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時用Dunnett′s-t3檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織中TNF-α及IL-6含量比較

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TNF-α及IL-6含量均明顯升高（P < 0.05）。與模型組比較，清潤方大劑量組和二甲雙胍組肝組織中TNF-α含量降低（P < 0.05），清潤方大、中劑量組和二甲雙胍組肝組織中IL-6含量降低（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組肝組織中SIRT1、NF-κB及GLUT4的mRNA表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組的SIRT1及GLUT4的mRNA表達(dá)量降低（P < 0.05），NF-κB的mRNA表達(dá)量升高（P < 0.05）。與模型組比較，清潤方各劑量組和二甲雙胍組SIRT1的mRNA表達(dá)量升高（P < 0.05），清潤方大、中劑量組和二甲雙胍組GLUT4的mRNA表達(dá)量升高（P < 0.05），NF-κB的mRNA表達(dá)量降低（P < 0.05）。見表2。

2.3 各組肝組織中SIRT1、NF-κB及GLUT4的蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較，模型組的SIRT1及GLUT4的蛋白表達(dá)量降低（P < 0.05），NF-κB的蛋白表達(dá)量升高（P < 0.05）。與模型組比較，清潤方各劑量組和二甲雙胍組SIRT1的蛋白表達(dá)量升高（P < 0.05），清潤方大、中劑量組和二甲雙胍組GLUT4的蛋白表達(dá)量升高（P < 0.05），清潤方大、中劑量組NF-κB的蛋白表達(dá)量降低（P < 0.05）。見圖1及表3。

3 討論

2型糖尿病是一種炎癥反應(yīng)性疾病，胰島素抵抗是其發(fā)病機制的一個重要部分，炎性反應(yīng)參與了胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞的損傷[5]。TNF-α和IL-6等多種炎性細(xì)胞因子可以降低機體對胰島素的敏感性[6]。TNF-α是啟動炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡和生存，可以通過TNFR1和TNFR2兩個受體信號誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡[7]。肝臟是人體的重要代謝器官，參與多種物質(zhì)和能量的代謝，肝臟是炎性反應(yīng)的靶器官之一，在人體炎性反應(yīng)中占有重要地位[8]。GLUT4是一種膜蛋白，存在于胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細(xì)胞中，沒有胰島素時主要位于細(xì)胞內(nèi)的囊泡內(nèi)，當(dāng)胰島素與受體結(jié)合后，GLUT4轉(zhuǎn)位至細(xì)胞外膜和葡萄糖結(jié)合將葡萄糖轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)[9]。IL-6是胰島素抵抗相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，它可以抑制胰島素受體的信號傳導(dǎo)，影響GLUT4的合成，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運功能[10]。肝臟可以產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，其中TNF-α和胰島素抵抗關(guān)系密切，是NF-κB信號途徑的激活劑。目前研究表明，NF-κB信號通路在胰島素抵抗中發(fā)揮重要的作用[11]。本研究中，清潤方大劑量組和二甲雙胍組大鼠肝臟中TNF-α和IL-6的含量均降低，提示清潤方可能是通過減少肝臟的炎性反應(yīng)從而改善胰島素抵抗。清潤方大、中劑量組和二甲雙胍組GLUT4的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高，提示清潤方可能通過降低IL-6的表達(dá)水平，從而提高葡萄糖轉(zhuǎn)運功能。

SIRT1是沉默信息調(diào)節(jié)因子，是SIR家族7種去乙?；钢醒芯孔疃嗟囊环N酶，廣泛存在于機體的各種體細(xì)胞及生殖細(xì)胞中，在肝臟中有很高的表達(dá)，對肝臟代謝有重要作用[12]。它通過影響NF-κB等與胰島素敏感性相關(guān)的信號蛋白，調(diào)節(jié)下游信號分子的表達(dá)或活性，調(diào)節(jié)糖脂代謝，抑制炎性反應(yīng)，進(jìn)而對胰島素敏感性起著重要的調(diào)節(jié)作用[13]。研究表明，活化的SIRT1可以提高肝臟、骨骼肌和脂肪組織的胰島素敏感性，并且可以保護(hù)胰島β細(xì)胞[14]。研究表明，SIRT1激活能顯著改善db/db小鼠的血糖，提高血漿胰島素濃度，改善胰島β細(xì)胞質(zhì)量，增加肝細(xì)胞β-細(xì)胞生長因子和β-萎縮蛋白的表達(dá)[15]。在本研究中，與模型組比較，清潤方各劑量組和二甲雙胍組SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)量都升高，提示清潤方可能是通過提高SIRT1在肝臟組織中的表達(dá)來改善胰島素抵抗。

NF-κB是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)節(jié)的靶基因包括免疫相關(guān)受體、細(xì)胞因子、炎性因子和黏附分子等。作為各種基因的主要調(diào)節(jié)因子，其可以通過與一些因子結(jié)合參與凋亡和炎癥的調(diào)節(jié)[16]。有研究表明，通過NF-κB信號通路可以增加TNF-α和IL-12的表達(dá)，促進(jìn)炎性反應(yīng)，加重胰島素抵抗。2型糖尿病患者體內(nèi)單核細(xì)胞NF-κB的表達(dá)升高明顯[17]。Wang等[18]研究表明，核轉(zhuǎn)運蛋白β1（KPNβ1）將NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，可以增加促炎癥基因的表達(dá)。通過正調(diào)節(jié)NF-κB信號通路增強HepG2細(xì)胞中棕櫚酸誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和胰島素抵抗。還有研究表明，用丹參酮治療STZ誘導(dǎo)的大鼠，可以降低血糖水平，升高TNF-α和IL-6的表達(dá)，降低NF-κB的表達(dá)，從而減輕2型糖尿病大鼠胰島素抵抗[19]。SIRT1主要是通過對NF-κB的去乙?；饔脜⑴c炎性反應(yīng)，SIRT1通過對NF-κB的RelA/p65亞基上第310個賴氨酸去乙?；饔?，抑制NF-κB的活性，進(jìn)而影響其與DNA的結(jié)合，影響TNF-α的基因表達(dá)，降低炎性反應(yīng)[20]。在本研究中，與模型組比較，清潤方大、中劑量組NF-κB的蛋白表達(dá)量降低，提示可能是清潤方提高SIRT1在肝臟組織中的表達(dá)后，SIRT1抑制了NF-κB的表達(dá)，從而起到了抗炎的作用。

綜上所述，清潤方作為治療糖尿病胰島素抵抗的一種有效中藥復(fù)方，其可能是通過調(diào)控肝臟SIRT1/NF-κB信號通路，促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，抑制NF-κB的表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而改善炎癥狀態(tài)，具體的信號通路及轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編輯：張瑜杰）