王佳賀 王超

[摘要] 目的 探討自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和自噬激動劑雷帕霉素（RAPA）對巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的人白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞凋亡的影響。 方法 采用Western blot分析檢測不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B作用不同時間后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬調(diào)節(jié)因子Beclin-1等的表達(dá)；將HL-60細(xì)胞分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。采用AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測人白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞的凋亡情況；檢測Caspase-3蛋白酶的活性。 結(jié)果 巖大戟內(nèi)酯B能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60自噬，增加LC3-Ⅱ和自噬調(diào)節(jié)因子Beclin-1的表達(dá)（P < 0.05）；3-MA可降低巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡和Caspase-3的活性（P < 0.05），而RAPA則提高了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡率及Caspase-3的活性（P < 0.05）。 結(jié)論 巖大戟內(nèi)酯B可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬，細(xì)胞自噬在巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡中起到了非常重要的作用。

[關(guān)鍵詞] 巖大戟內(nèi)酯B；白血??；HL-60細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；自噬

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（a）-0013-04

Effect of cell autophagy on apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B

WANG Jiahe WANG Chao

Department of Geriatrics， Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110004， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of apoptosis of the autophagy-specific inhibitor 3-methyladenine （3-MA） and autophagy agonist rapamycin （RAPA） on the human leukemia cell line HL-60 cells induced by Jolkinolide B. Methods The expressions of autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand autophagy regulator Beclin-1 induced by different doses of Jolkinolide B at different time points were detected by Western blot method. The HL-60 cells were divided into blank control group， Jolkinolide B group， Jolkinolide B combined with 5 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 mmol/L 3-MA group， Jolkinolide B combined with 10 nmol/L RAPA group and Jolkinolide B combined with 20 nmol/L RAPA group. Apoptosis of human leukemia cell line HL-60 cells was detected by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry. Moreover， the activity of Caspase-3 was detected. Results Jolkinolide B could induce autophagy in leukemia cell line HL-60， increase the expression of LC3-Ⅱ and autophagy regulator Beclin-1 （P < 0.05）. 3-MA could lower the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 activity induced by Jolkinolide B （P < 0.05）， while RAPA increased the apoptosis rate of HL-60 cells and the activity of Caspase-3 induced by Jolkinolide B （P < 0.05）. Conclusion Jolkinolide B can induce autophagy in HL-60 cells， and autophagy plays an important role in the apoptosis of HL-60 cells induced by Jolkinolide B.

[Key words] Jolkinolide B； Leukemia； HL-60 cell； Apoptosis； Autophagy

白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病[1]。目前認(rèn)為細(xì)胞自噬廣泛參與了白血病的發(fā)生[2-3]。中藥具有價格低廉、來源豐富等特點，且在干預(yù)腫瘤細(xì)胞的自噬過程中發(fā)揮著重要的作用[4-6]。研究表明[7-9]，從中藥狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）根部分離的二萜類化合物巖大戟內(nèi)酯B能夠抑制多種白血病細(xì)胞增殖，促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。然而，巖大戟內(nèi)酯B能否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬以及自噬與凋亡關(guān)系的研究目前鮮有報道。

因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過體外實驗探討巖大戟內(nèi)酯B是否能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬、自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）及自噬激動劑雷帕霉素（RAPA）是否能夠影響巖大戟內(nèi)酯B所致的白血病細(xì)胞的凋亡。初步探討巖大戟內(nèi)酯B能否誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬并觀察調(diào)控自噬對巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；3-MA和RAPA購自Sigma公司；自噬相關(guān)抗體LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、β-actin及其他試劑均為武漢博士德生物工程公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國Backman公司產(chǎn)品；離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blot檢測白血病細(xì)胞HL-60自噬調(diào)節(jié)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達(dá)

采用巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細(xì)胞24、48、72 h或采用濃度分別為0、20、40、80 μg/mL巖大戟內(nèi)酯B處理HL-60細(xì)胞48 h后，常規(guī)消化并收集各組細(xì)胞，按照總蛋白抽提試劑盒的操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白的濃度。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）電泳。在恒定電流下電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h。加入1∶1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次；加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15 min。用抗β-actin抗體標(biāo)記。按試劑盒說明，采用發(fā)光試劑浸潤PVDF膜，膠片在感光屏內(nèi)曝光成像后，結(jié)果在凝膠成相儀上照相。本實驗重復(fù)3次。

1.4 巖大戟內(nèi)酯B作用于HL-60細(xì)胞分組

將HL-60細(xì)胞分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組，分別培養(yǎng)24 h。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測HL-60細(xì)胞的凋亡率

取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，分為空白對照組、巖大戟內(nèi)酯B組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。巖大戟內(nèi)酯B、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的3-MA和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的RAPA分別處理24 h后收集HL-60細(xì)胞，將細(xì)胞懸于300 μL的Binding Buffer，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶（PI），輕輕混勻，避光，室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測各組HL-60細(xì)胞的凋亡率。

1.6 Caspase-3活性測定

巖大戟內(nèi)酯B、巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的3-MA和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合不同濃度的RAPA分別處理HL-60細(xì)胞24 h后，比色法檢測Caspase-3的活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巖大戟內(nèi)酯B對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細(xì)胞24、48、72 h后或不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B分別處理HL-60細(xì)胞48 h后，細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大，Beclin-1蛋白表達(dá)亦逐漸增加。Beclin-1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 流式細(xì)胞儀分析HL-60細(xì)胞的凋亡率

巖大戟內(nèi)酯B組HL-60細(xì)胞的凋亡率與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組及巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組的HL-60細(xì)胞凋亡率均下降，而巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組的HL-60細(xì)胞凋亡率均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

1：空白對照組；2：巖大戟內(nèi)酯B組；3：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組；4：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組；5：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組；6：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。與空白對照組比較，#P < 0.05；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，*P < 0.05

圖2 不同處理組白血病細(xì)胞HL-60的凋亡率

2.3 Caspase-3活性

巖大戟內(nèi)酯B組的HL-60細(xì)胞Caspase-3活性與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組的HL-60細(xì)胞Caspase-3活性均下降，巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組和巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組的HL-60細(xì)胞Caspase-3活性均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

1：空白對照組；2：巖大戟內(nèi)酯B組；3：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合5 mmol/L 3-MA組；4：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 mmol/L 3-MA組；5：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合10 nmol/L RAPA組；6：巖大戟內(nèi)酯B聯(lián)合20 nmol/L RAPA組。與空白對照組比較，#P < 0.05；與巖大戟內(nèi)酯B組比較，*P < 0.05

圖3 不同處理組白血病細(xì)胞HL-60的Caspase-3活性

3 討論

大量研究表明[10-11]，抗腫瘤藥物的作用機(jī)制之一是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生。自噬是一種細(xì)胞程序性死亡方式。不同種類藥物作用于白血病患者的效果會因自噬效應(yīng)的不同而有所差別。LC3是重要的自噬標(biāo)記分子[12]。LC3主要包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在形式。LC3前體形成后，首先被加工成LC3-Ⅰ，其為胞質(zhì)可溶性形式，被Atg7活化；后者再經(jīng)過修飾生成LC3-Ⅱ，其為膜結(jié)合形式，并且定位于自噬前體和自噬體，最后被水解酶水解。LC3-Ⅱ含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在一定程度上與自噬體數(shù)量成正比，并反映了自噬活性[13]。Beclin-1亦是參與自噬調(diào)控的重要基因，是哺乳動物與酵母自噬相關(guān)基因Atg6/Vps30同源的基因，其表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用巖大戟內(nèi)酯B處理HL-60細(xì)胞，細(xì)胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)隨著大戟內(nèi)酯B濃度的增加及作用時間的延長均增強(qiáng)，進(jìn)一步說明LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白參與了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60的自噬性細(xì)胞死亡。因此，靶向調(diào)控自噬性細(xì)胞死亡途徑可能成為治療白血病的新方法之一。

此外，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，即某些情況下能夠抑制細(xì)胞凋亡，而在某些情況下又能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17-18]。為了探討巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，本研究分別聯(lián)用自噬抑制劑3-MA和自噬激動劑RAPA，觀察自噬對巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡的影響。本結(jié)果顯示，HL-60細(xì)胞經(jīng)3-MA預(yù)處理后，巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡率降低；HL-60細(xì)胞經(jīng)自噬激動劑RAPA預(yù)處理后，巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞凋亡率增加。提示抑制巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的自噬能夠抑制HL-60細(xì)胞凋亡，巖大戟內(nèi)酯B與自噬激動劑RAPA的聯(lián)合應(yīng)用可能為白血病的臨床治療提供新策略。

細(xì)胞自噬和凋亡的信號通路中存在著眾多的交叉，白血病細(xì)胞自噬和凋亡的具體關(guān)系仍不十分清楚[19-20]。促進(jìn)或抑制細(xì)胞自噬，進(jìn)而提高白血病的化療效果，可能成為未來白血病治療的策略之一。繼續(xù)深入探討巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系以及各相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞自噬和凋亡過程中的作用，以便為通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生治療白血病提供一定的理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] He PC，Liu YF，Qi J，et al. Prohibitin promotes apoptosis of promyelocytic leukemia induced by arsenic sulfide [J]. Int J Oncol，2015，47（6）：2286-2295.

[2] Song P，Ye L，F(xiàn)an J，et al. Asparaginase induces apoptosis and cytoprotective autophagy in chronic myeloid leukemia cells [J]. Oncotarget，2015，6（6）：3861-3873.

[3] Cao BY，Li J，Zhou XM，et al. Clioquinol induces pro-death autophagy in leukemia and myeloma cells by disrupting the mTOR signaling pathway [J]. Sci Rep，2014，4：5749.

[4] Seo JA，Kim B，Dhanasekaran DN，et al. Curcumin induces apoptosis by inhibiting sarco/endoplasmic reticulum Ca（2+） ATPase activity in ovarian cancer cells [J]. Cancer Lett，2016，371（1）：30-37.

[5] Park MR，Kim SG，Choa IA，et al. Licochalcone-A induces intrinsic and extrinsic apoptosis via ERK1/2 and p38 phosphorylation-mediated TRAIL expression in head and neck squamous carcinoma FaDu cells [J]. Food Chem Toxicol，2015，77：34-43.

[6] Kühnl J，Roggenkamp D，Gehrke SA，et al. Licochalcone A activates Nrf2 in vitro and contributes to licorice extract-induced lowered cutaneous oxidative stress in vivo [J]. Exp Dermatol，2015，24（1）：42-47.

[7] Wang JH，Zhang K，Niu HY，et al. Jolkinolide B from Euphorbia fischeriana Steud induces in human leukemic cells apoptosis via JAK2/STAT3 pathways [J]. Int J Clin Pharmacol Ther，2013，51（3）：170-178.

[8] Wang JH，Zhou YJ，Bai X，et al. Jolkinolide B from Euphorbia fischeriana Steud induces apoptosis in human leukemic U937 cells through PI3K/Akt and XIAP pathways [J]. Mol Cells，2011，32（5）：451-457.

[9] Ma XJ，Liu YP，Zhang Y，et al. Jolkinolide B inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by suppressing the activation NF-κB and MAPK signaling pathways [J]. Biochem Biophys Res Commun，2014，445（2）：282-288.

[10] Zeng X，Zhao H，Li YB，et al. Targeting hedgehog signaling pathway and autophagy overcomes drug resistance of BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia [J]. Autophagy，2015，11（2）：355-372.

[11] Zeng CW，Chen ZH，Zhang XJ，et al. MIR125B1 represses the degradation of the PML-RARA oncoprotein by an autophagy-lysosomal pathway in acute promyelocytic leukemia [J]. Autophagy，2014，10（10）：1726-1737.

[12] Elkhoury V，Pierson S，Szwarcbart E，et al. Disruption of autophagy by the histone deacetylase inhibitor MGCD0103 and its therapeutic implication in B-cell chronic lymphocytic leukemia [J]. Leukemia，2014，28（8）：1636-1646.

[13] Ge J，Liu Y，Li Q，et al. Resveratrol induces apoptosis and autophagy in T-cell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38-MAPK [J]. Biomed Environ Sci，2013，26（11）：902-911.

[14] Orfali N，McKenna SL，Cahill MR，et al. Retinoid receptor signaling and autophagy in acute promyelocytic leukemia [J]. Exp Cell Res，2014，324（1）：1-12.

[15] Qi Y，Zhang M，Li H，et al. Autophagy inhibition by sustained overproduction ofil6 contributes to arsenic carcinogenesis [J]. Cancer Res，2014，74（14）：3740-3752.

[16] Sun J，Zhang C，Bao YL，et al. Parthenolide-induced apoptosis，autophagy and suppression of proliferation in HepG2 cells [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（12）：4897-4902.

[17] 劉煉，張麗，方志南，等.柴胡皂苷誘導(dǎo)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，14（2）：25-28.

[18] 朱星枚，吳琳，張媛，等.細(xì)胞自噬與人卵巢癌細(xì)胞對順鉑耐藥的關(guān)系[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（25）：12-16.

[19] Yuan N，Song L，Zhang SP，et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia [J]. Haematologica，2015，100（3）：345-356.

[20] Shao S，Li S，Qin YW，et al. Spautin-1，a novel autophagy inhibitor，enhances imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia [J]. Int J Oncol，2014，44（5）：1661-1668.

（收稿日期：2017-11-07 本文編輯：任 念）