冷雪峰 梅建東 劉倫旭

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的首要原因，中國每年新診斷的肺癌患者總數(shù)占全球的三分之一[1,2]，已成為全球最重要的公共健康問題之一。針對驅(qū)動基因表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）已成為一線治療方案[3]。但常在治療后的9個月-12個月，患者不可避免地出現(xiàn)耐藥。這也是導(dǎo)致EGFR突變肺腺癌治療失敗和預(yù)后不良的主要原因。肺腺癌EGFR-TKIs耐藥的發(fā)生是一個極為復(fù)雜的多因素、多途徑、多層次的過程，目前的研究尚未達(dá)成共識。研究表明，約60%EGFR突變肺腺癌發(fā)生T790M二次突變可能是EGFR-TKIs耐藥的主要機(jī)制[4]。另外，c-Met擴(kuò)增、AXL激活、EMT激活以及IGF-1R信號通路的上調(diào)等也與EGFR-TKIs耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[4]。雖然基于分子靶向藥物等多模式的治療極大改善了NSCLC患者的臨床預(yù)后，但長期生存時間仍偏低，且復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高[5]，促使人們開始關(guān)注免疫治療帶來的潛在獲益。程序性死亡受體-1（programmed death receptor 1,PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1,PD-L1）抗體為EGFR突變或EGFR-TKIs耐藥肺腺癌患者帶來了治療的曙光，但是目前在臨床上進(jìn)行免疫干預(yù)的認(rèn)識及選擇還是比較有限。因此，更好地理解EGFR-TKIs治療后調(diào)控免疫應(yīng)答的分子事件成為一個緊迫的主題。為此，本文對不同信號通路參與調(diào)控EGFR突變肺腺癌PD-L1表達(dá)的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 PD-L1

1.1 PD-L1的結(jié)構(gòu)及分布 PD-L1也稱為B7-H1（B7 Homolog 1）或CD274（cluster of differentiation 274），是PD-1的共抑制性配體。PD-L1由PDCDL1基因編碼，位于染色體9p24.1。PD-L1被認(rèn)為是B7蛋白家族的第三個成員，與B7.1和B7.2蛋白有15%-20%的同源性，1999年由Dong等首次將其命名為B7-H1。PD-L1的全長包括7個外顯子編碼區(qū)，對應(yīng)一個含有290個氨基酸40 kDa長度的蛋白質(zhì)。PD-L1是由胞外區(qū)IgV樣和IgC樣結(jié)構(gòu)域，一個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域，以及30個氨基酸構(gòu)成的一個短胞質(zhì)尾區(qū)組成的I型跨膜蛋白，但其信號傳導(dǎo)作用仍不是很清楚[6,7]。PD-L1可表達(dá)于造血細(xì)胞，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DCs）和肥大細(xì)胞中。也可表達(dá)于非造血的健康組織細(xì)胞中，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、胰島細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、角膜上皮和角膜內(nèi)皮細(xì)胞。同時，PD-L1還可在腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)中表達(dá)。

1.2 PD-L1的生物學(xué)功能 PD-L1通過結(jié)合PD-1受體形成的PD-1/PD-L1通路在維持中樞和外周免疫耐受方面起到重要作用[8]。PD-L1在胸腺和樹突狀細(xì)胞中高表達(dá)，相互作用的PD-L1/PD-1會阻止幼稚T細(xì)胞的增殖和分化[9]，PD-L1還和CD80相互作用，從而對激活的T細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用[10]。其次，PD-1/PD-L1還參與免疫耗竭的生理機(jī)制，即在抗原持續(xù)存在的情況下誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，抑制T細(xì)胞復(fù)制和成熟，以防止在慢性感染中出現(xiàn)組織破壞[11]。同時，PD-L1參與抗腫瘤免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中普遍發(fā)現(xiàn)PD-1持續(xù)性上調(diào)，而惡性腫瘤細(xì)胞會利用PD-L1的表達(dá)來逃避免疫系統(tǒng)對其造成破壞[12]。

2 EGFR突變調(diào)控肺腺癌PD-L1表達(dá)的相關(guān)信號通路

現(xiàn)認(rèn)為，約20%-30% NSCLC中PD-L1的腫瘤比例分?jǐn)?shù)（tumor proportion score,TPS）＞50%，其表達(dá)導(dǎo)致腫瘤免疫微環(huán)境改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞更具侵襲性和免疫逃逸[13]。亞洲人群EGFR突變率（47%）較非亞洲人群（13%-15%）更常見，主要為19外顯子缺失（del746_A750）或21外顯子點(diǎn)突變（L858R）[14,15]。目前，EGFR突變與PD-L1表達(dá)調(diào)控尚存在爭議，但是體外實(shí)驗(yàn)及大中心研究均提示EGFR突變導(dǎo)致NSCLC中PD-L1表達(dá)異常升高。2014年，Azuma等[13]在Annals of Oncology發(fā)表研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達(dá)與EGFR突變關(guān)系密切且與影響NSCLC患者生存預(yù)后，且PD-L1 TPS≥50%與EGFR突變的相關(guān)性已在多項(xiàng)研究[16-18]中得以證實(shí)。但近期也有研究[19]顯示PD-L1在EGFR野生型肺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與EGFR突變并無顯著相關(guān)性。從藥物治療造成癌細(xì)胞最初損傷到其最終死亡之間存在著多條信號傳導(dǎo)通路組成的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控體系[20]。因此，EGFR作為NSCLC重要致癌基因和藥物靶點(diǎn)，更好地理解EGFR突變通過不同相關(guān)信號通路直接或間接調(diào)控PD-L1表達(dá)參與腫瘤免疫逃逸尤為重要。

2.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路 NSCLC中EGFR可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，它能增加細(xì)胞增殖、代謝和存活能力，并在肺癌形成過程中起到關(guān)鍵作用。EGFR突變的NSCLC細(xì)胞中，當(dāng)PI3K、AKT和mTOR表達(dá)同時下調(diào)，PD-L1的表達(dá)隨時間出現(xiàn)顯著下降[21,22]。在EGFR突變敏感細(xì)胞中使用EGFR-TKIs也會導(dǎo)致PD-L1表達(dá)下降。EGFR-TKIs不僅使EGFR磷酸化減弱，同時也降低AKT的磷酸化，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)。下調(diào)PI3K表達(dá)后，AKT也出現(xiàn)磷酸化水平降低并最終導(dǎo)致PD-L1表達(dá)下降[17,21,23]。AKT/mTOR信號通路可在EGFR突變的肺腺癌中激活，且mTOR可獨(dú)立調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)[22]。此外，γ-干擾素（interferon-gamma,IFN-γ）不僅起到重要的抗腫瘤作用，同時也可激活PI3K-AKT和JAK2-STAT1通路，抑制PI3K后不僅可下調(diào)PD-L1表達(dá)，同時可增強(qiáng)IFN-γ抗腫瘤增殖的能力，說明PI3K-AKT和JAK2-STAT1通路間存在一定交叉效應(yīng)[24]。說明了PI3K/AKT/mTOR信號通路在EGFR突變NSCLC中對PD-L1的表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用。但也有研究[25]顯示EGFR突變后AKT磷酸化激活，且抑制AKT磷酸化后并未出現(xiàn)PD-L1表達(dá)的變化，但其可能機(jī)制仍不明確。

2.2 MAPK信號通路 MAPK中的MEK/ERK通路通常由腫瘤異常上游信號酪氨酸激酶受體擴(kuò)增或突變而激活。有證據(jù)表明MEK/ERK通過炎癥信號通路交叉調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)[26]。在EGFR突變NSCLC細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)MEK-ERK信號通路對PD-L1表達(dá)起到調(diào)控作用[23,27]，激活ERK1/2通路可顯著上調(diào)PD-L1的表達(dá)[25]。但在一些研究中發(fā)現(xiàn)EGFR突變細(xì)胞中抑制ERK并未出現(xiàn)MAPK信號通路對PD-L1表達(dá)的調(diào)控現(xiàn)象[21]。即使在多個肺癌細(xì)胞系，包括EGF誘導(dǎo)PD-L1過表達(dá)細(xì)胞株中，使用MEK抑制劑也未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)發(fā)生變化[17,22]。說明MAPK信號通路并不是直接調(diào)控EGFR突變NSCLC的直接通路。

2.3 JAK/STAT信號通路 JAK/STAT是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和形成的一個經(jīng)典信號通路。無論在EGFR突變TIKs敏感/耐藥細(xì)胞株中，抑制JAK/STAT3后均出現(xiàn)PD-L1表達(dá)下降[21]。但使用EGFR-TKIs調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)時，只有使STAT3去磷酸化才會出現(xiàn)PD-L1表達(dá)下降，而直接沉默STAT3后并未發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)的變化[23]。在EGF誘導(dǎo)的EGFR和STAT3磷酸化和激活細(xì)胞中，分別抑制和沉默STAT3和JAK2，PD-L1無論在mRNA水平還是蛋白水平均出現(xiàn)了顯著下降，提示JAK/STAT3通路在其中起到了重要作用[17,28]。

2.4 NF-κB信號通路 NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子家族，可在腫瘤突變癌基因和炎癥微環(huán)境產(chǎn)生的細(xì)胞因子下被激活。研究[29]發(fā)現(xiàn)NF-κB的亞基RELA（p65）可以在NSCLC細(xì)胞中結(jié)合PD-L1的啟動子，并以RELA-MUC1-C復(fù)合體的形式直接調(diào)控PD-L1的轉(zhuǎn)錄。NF-κB作為EGFR激活的重要下游通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和化療耐藥。在EGFR突變細(xì)胞系中表達(dá)高于EGFR野生型，且與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)。當(dāng)在EGFR突變細(xì)胞系中沉默NF-κB后，發(fā)現(xiàn)隨著NF-κB的亞基RELA（p65）的沉默，PD-L1的表達(dá)隨之衰減，再次證明EGFR突變NSCLC中PD-L1表達(dá)的升高需要NF-κB的參與[30]。

2.5 其他調(diào)控機(jī)制 Yes相關(guān)蛋白1（Yes associated protein 1,YAP）是Hippo通路上的效應(yīng)因子，是許多癌癥中的致癌基因。作為共轉(zhuǎn)錄因子會和TEAD形成一個復(fù)合物，其具備DNA結(jié)合域并調(diào)節(jié)多個基因在細(xì)胞增殖、凋亡抑制、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和其他方面的功能[31]。雖然YAP可能不會調(diào)節(jié)PD-L1的上游通路，但研究表明YAP可直接結(jié)合在PD-L1啟動子上從而調(diào)節(jié)其表達(dá)。在EGFR突變細(xì)胞株過表達(dá)YAP可增加PD-L1的表達(dá)，敲減YAP后PD-L1表達(dá)下降，而過表達(dá)PD-L1則對YAP的表達(dá)沒有影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）發(fā)現(xiàn)YAP/TEAD結(jié)合在PD-L1啟動子區(qū)域，因此YAP是通過增加PD-L1的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)其表達(dá)[32]。同時，YAP表達(dá)參與乏氧環(huán)境中的腫瘤進(jìn)展[33]，在EGFR突變NSCLC中通過凋亡通路影響PD-L1調(diào)節(jié)EGFRTKI的耐藥[34]。

橋接整合因子-1（bridging integrator-1,BIN1）是一種MYC適配體蛋白，具有抑癌特性[35]。BIN1在NSCLC的EGFR突變細(xì)胞株中表達(dá)降低或缺失，而PD-L1在BIN1過表達(dá)后明顯下降，敲低BIN1后PD-L1表達(dá)明顯上調(diào)。無論體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)BIN1的過表達(dá)可使EGFR/MAPK信號通路失活從而抑制和調(diào)控PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸[36]。

3 PD-1/PD-L1抑制劑在EGFR突變NSCLC中的應(yīng)用

如前所述，EGFR突變可能通過不同信號通路影響PD-L1表達(dá)。EGFR突變NSCLC患者中EGFR-TKI獲得性耐藥也會導(dǎo)致PD-L1表達(dá)的明顯升高[37]，在經(jīng)過EGFR-TKI治療的患者中，獲得性MET陽性表達(dá)也參與了PD-L1表達(dá)升高的調(diào)控，在肺癌細(xì)胞中可能是通過miR-200/ZEB1進(jìn)行調(diào)控[38]。那么PD-L1是否可以作為一個重要的EGFR突變NSCLC中免疫原性評價(jià)指標(biāo)，繼而指導(dǎo)這類患者可能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑或聯(lián)合EGFR-TKI治療中獲益。過往針對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床研究納入標(biāo)準(zhǔn)僅考慮PD-L1陽性一方面，隨著對EGFR突變調(diào)控PD-L1表達(dá)相關(guān)分子機(jī)制的不斷認(rèn)識，針對EGFR突變患者抗PD-L1藥物療效的臨床數(shù)據(jù)也在不斷增多。Keynote-001作為I期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGFR突變NSCLC中使用pembrolizumab治療PD-L1陽性（TPS≥50%）和（TPS 1%-49%）患者的客觀緩解率（overall response rate,ORR）分別為20%和8.7%，而在PD-L1陰性（TPS＜1%）的情況下，ORR為0%[39]。在單臂、開放標(biāo)簽II期涉及亞洲、歐洲和北美多中心臨床研究ATLANTIC中，應(yīng)用durvalumab治療EGFR突變陽性、PD-L1高表達(dá)（TPS＞25%）的晚期或治療進(jìn)展的NSCLC患者中，ORR為14.1%，明顯高于PD-L1低表達(dá)（TPS＜25%）的3.6%[40]。由于缺乏針對pembrolizumab在EGFR突變和非突變NSCLC患者中的臨床療效證據(jù)，一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)（NCT02879994）對EGFR突變陽性且沒有接受過EGFR-TKI、晚期NSCLC及PD-L1陽性（＞1%，22C3抗體）的患者給予pembrolizumab治療。非常遺憾，由于缺乏治療有效性，該試驗(yàn)入組11例患者后即終止。結(jié)果表明pembrolizumab在未接受TKI治療、PD-L1陽性（包括TPS＞50%）的EGFR突變陽性晚期NSCLC患者中并不適用[41]。

在聯(lián)合用藥方面，Checkmate-012研究評估了nivolumab聯(lián)合化療/erlotinib/ipilimumab或作為單藥治療NSCLC患者的安全性和耐受性。作為該研究的一部分，在nivolumab聯(lián)合erlotinib治療組中，入組21例患者經(jīng)過聯(lián)合用藥直到出現(xiàn)疾病進(jìn)展或無法耐受的毒性反應(yīng)，其ORR為19%，24周的無進(jìn)展生存（progressive free survival,PFS）率為51%，18個月OS率為64%。其中20例EGFR-TKI經(jīng)治患者中3例達(dá)到部分緩解（partial response,PR），且中位緩解時間為60.1個月，1例EGFR-TKI初治的患者達(dá)到PR并在文獻(xiàn)報(bào)道時已持續(xù)接受了72.3個月的治療[42]。在多臂、開放標(biāo)簽的Ib期TATTON試驗(yàn)中，對Osimertinib聯(lián)合durvalumab治療EGFR-TKI敏感突變患者的效果進(jìn)行評估。其中Osimertinib是一個強(qiáng)效、不可逆的EGFR-TKI藥物，主要作用于EGFR-TKI敏感突變和T790M突變引起的繼發(fā)耐藥。在23例EGFR-TKI經(jīng)治患者中，T790M突變陽性的ORR為67%，EGFR初治患者ORR達(dá)到70%，但由于治療期間肺間質(zhì)疾?。╥nterstitial lung disease,ILD）的高發(fā)生率（13/34,38%），后續(xù)試驗(yàn)入組已經(jīng)暫停[43]。另外，還有很多聯(lián)合治療的相關(guān)臨床試驗(yàn)還在入組中，如NCT02039674、NCT02088112、NCT1454102、NCT02574078等。

4 展望

綜上所述，改善中晚期NSCLC患者生存問題一直是胸部腫瘤領(lǐng)域亟待解決的難題。EGFR突變可激活NSCLC細(xì)胞中的不同信號通路，介導(dǎo)PD-L1表達(dá)升高，從而導(dǎo)致免疫逃逸和治療失敗。但關(guān)于EGFR突變與PD-L1表達(dá)的相關(guān)研究仍處于起步階段，諸多未知因素尚有待解決。相信隨著對相關(guān)研究的不斷深入，將為PD-1/PD-L1抑制劑在EGFR突變NSCLC患者中單藥或聯(lián)合EGFR-TKIs的多模態(tài)免疫-靶向治療策略中提供理論基礎(chǔ)，以期改善未來NSCLC的治療預(yù)后。