華欣 朱曉莉

肺癌是現階段發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一，其中約85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。一般情況下，NSCLC的發(fā)生發(fā)展是由多途徑、多因素共同作用的結果，其中腫瘤新生血管的形成在腫瘤增殖、侵襲和轉移的過程中起到重要作用[2]。一方面，腫瘤組織想要生長必須依賴新生血管為其提供血流灌注，給予營養(yǎng)物質，從而增強其增殖和侵襲活力；另一方面，新生血管的內皮通透性高，癌細胞容易突破內層，浸潤周圍器官和組織，也可利用新生血管通過血液循環(huán)將原發(fā)癌細胞送至轉移的靶器官[3]。

腫瘤新生血管形成過程復雜，由多個促進因子、抑制因子共同調控，當促進血管生成的因子作用強于抑制血管生成的因子時，腫瘤新生血管便開始生成。血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）是目前研究較為深入且重要的促血管生成因子，已被證實Ang-2在NSCLC組織、血清中異常表達[4]，然而Ang-2的表達與癌細胞增殖、侵襲、轉移之間的關系仍有待探索，這也對尋找NSCLC治療的新靶點有重要指導意義。

1 Ang-2的生物學作用

1.1 Ang家族及Ang-2的生物學作用 血管生成素家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4，它們都可與酪氨酸激酶受體Tie2結合，啟動或調控血管生成過程，其中Ang-1、Ang-2與血管生成的關系最為密切。Ang-1在正常組織中表達廣泛，與Tie2受體結合后可驅化附近的血管支持細胞如平滑肌細胞和周細胞至血管內皮細胞周圍，使內皮細胞和周圍支持細胞緊密連接，從而穩(wěn)定血管，最終起到限制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤生長的作用[5]。Makinde等[6]發(fā)現，Ang-1或Tie2蛋白缺乏均會影響到本身血管的完整性，使小鼠死于胚胎期，證實了Ang-1作為血管穩(wěn)定因子的重要作用。

Ang-2主要由血管內皮細胞及內皮旁細胞分泌，正常情況下在胎盤、子宮、卵巢中表達[7]。在缺氧或炎癥反應時會引起Ang-2的異常釋放，其作為Ang-1的天然拮抗劑，競爭性地與Tie2結合，從而阻斷Ang-1的穩(wěn)定血管作用，導致內皮細胞與周圍細胞的連接離斷，引起內皮細胞的不穩(wěn)定，由此造成血管失穩(wěn)和內皮活化，在血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）存在的情況下，Ang-2會促進內皮細胞接受VEGF等血管生成誘導劑的出芽信號，使腫瘤組織內的新生血管持續(xù)生成[8]。目前已發(fā)現Ang-2/Tie2系統(tǒng)在多種惡性腫瘤的組織、血液中表達升高，并與腫瘤微血管密度（intratumoral microvessel density,IMVD）、臨床分期、預后等關系密切，有望成為重要的抗腫瘤血管形成靶點[9]。

1.2 Ang-2和VEGF的相互作用 主要的內皮細胞特異性生長因子除了Ang家族外，還有VEGF家族。VEGF是目前最強的促血管生成活性分子，其家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及其受體VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3[10]。腫瘤來源的VEGF可促進其本身的分泌，放大促血管生成信號，并可在肺癌細胞系中通過PI3K/AKT、RAS/ERK和STAT3等信號通路誘導Ang-2等各種血管生成因子的顯著分泌，形成血管生成因子網絡，共同調節(jié)腫瘤血管生成[11]。腫瘤組織生長到一定體積時，會發(fā)生不同程度的缺氧。在常見的肺癌細胞株A549中研究發(fā)現，缺氧會刺激細胞分泌缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）、VEGF、Ang-2的生成，這種表達依賴于PI3K/Akt信號通路途徑[12]?，F已證實[13]，Ang-2與VEGF在腫瘤新生血管生成上關系密切，且具有相互促進作用，Ang-2可上調VEGF的表達，而VEGF也可以反過來促進Ang-2的分泌。在VEGF的影響下，Ang-2具有促血管生成或退化的雙重作用：一方面，Ang-2本身可誘導腫瘤組織內新生血管呈非出芽式生長，但此時的新生血管周邊細胞缺如，膠原排列紊亂，管壁基質稀少，故生成很不穩(wěn)定，只有在VEGF的作用下，內皮細胞才能發(fā)生遷移、增殖，最終形成成熟的新生血管；另一方面，當無VEGF時，Ang-2則誘導原有血管退化與數目減少，同時伴有內皮凋亡[14]。

2 Ang-2在NSCLC中的異常表達

2.1 Ang-2在NSCLC中的診斷價值 為了明確在NSCLC中Ang-2的表達情況，Wong等[15]率先在28對肺癌和癌旁組織中驗證發(fā)現，正常組織中Ang-1和Tie2的表達顯著上調，而肺癌組織中VEGF和Ang-2表達顯著上調，并且Ang-2表達量與VEGF表達的程度和強度呈顯著正相關，這表明在正常情況下Ang-1/Tie2途徑介導的血管穩(wěn)定機制占主導地位，但在腫瘤微環(huán)境作用下Ang-2和VEGF被相伴誘導上調，兩者相互協(xié)作介導腫瘤血管生成。后來陸續(xù)有研究[16-18]證實NSCLC患者組織、血清中Ang-1表達明顯下降，Ang-2、VEGF呈高表達，且腫瘤中這些血管生成分子的表達譜差異與IMVD及腫瘤侵襲、轉移等惡性生物學行為顯著相關，提示Ang-2及VEGF可以作為NSCLC早期診斷的潛在生物標記物。

為了評價Ang-2的診斷價值，2016年Xu等[19]在188例孤立性肺結節(jié)（solitary pulmonary nodule,SPN）中檢測發(fā)現，Ang-2診斷惡性SPN患者和健康志愿者以及惡性SPN和良性SPN患者之間的敏感度和特異度分別為80.5%和97.5%，以及69.5%和92.5%。類似地，在惡性胸腔積液的肺癌患者中Ang-2和VEGF的水平顯著升高，檢測Ang-2、VEGF、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）診斷肺癌合并惡性胸腔積液的價值，發(fā)現三者均能特異性診斷，當聯合診斷效率最高，敏感性達97.7%，特異性達66.7%[20]。

2.2 Ang-2在NSCLC中的預后價值 目前已有充分研究證實Ang-2可以作為鑒別NSCLC的生物標記物，而且與腫瘤的分期及預后有一定關系。Qiu等[21]的最新研究顯示，肺癌組織中Ang-2的表達水平與臨床分期、腫瘤直徑、分化程度有關。2017年一項納入了1,911例肺癌病例的薈萃分析[22]顯示，血清高Ang-2水平與較晚的臨床分期（III期、IV期）、淋巴結轉移相關，與年齡、性別、吸煙史、組織學類型無關，且高表達的患者預后顯著變差，這提示Ang-2在腫瘤侵襲、淋巴性轉移方面起到重要作用，提示Ang-2的表達水平可作為肺癌預后預測因子。

Tanaka等[23]分析236例NSCLC患者生存率與Ang-2、VEGF表達情況的關系，結果顯示：Ang-2陽性較陰性表達的患者5年生存率顯著下降（53.5%與70.3%）；Ang-2陽性、VEGF高的患者生存率較Ang-2陽性、VEGF低的患者顯著下降（41.4%與63.6%），提示Ang-2陽性導致NSCLC患者總體生存率降低，而且這種影響在VEGF共同高表達時更明顯。類似地，Andersen等[24]在335例NSCLC病例中發(fā)現兩者共同高表達時具有顯著的差存活率和預后。以上結果可用Ang-2的生物學功能來解釋：隨著腫瘤體積的增加，當新生血管未形成時，瘤內缺氧導致腫瘤細胞表達Ang-2，從而誘導內皮細胞不穩(wěn)定，血管通透性增加，不穩(wěn)定的血管出芽，在高表達的VEGF等生長因子刺激下最終新生血管成熟，促進癌細胞增殖及轉移。

3 Ang-2促進NSCLC增殖、侵襲、轉移的作用機制

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展依賴于新生血管的形成，但Ang-2在NSCLC中是如何作用以促進新生血管生成，繼而導致腫瘤增殖、侵襲和轉移仍不明確，目前相關研究進展如下。

3.1 Ang-2-TEM軸 TEMs（Tie2 expressing monocytes）是指表達Tie2的單核細胞/巨噬細胞，其在慢性炎性疾病、腫瘤血管及淋巴管生成中起到重要作用，研究表明Ang-2可通過調節(jié)此亞群，起到調節(jié)腫瘤血管生成和免疫系統(tǒng)的作用[25]。Coffelt等[26]研究發(fā)現Ang-2可以募集人TEMs，并上調胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase,TP）、組織蛋白酶B（cathepsin,CTSB）兩種促血管生成酶和VEGF、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase,MMP9）、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase,COX-2）和WNT5A等強效促血管生成因子的表達來顯著增強TEMs的促血管生成活性。隨后，陸續(xù)證實了Ang-2還可以通過刺激TEMs而上調強效免疫抑制因子如白細胞介素10（interleukin,IL-10）、人甘露糖受體C1（mannose receptor,MRC1）和調節(jié)性T細胞（rgulatory cells,Tregs）的趨化因子配體17（chemokine ligand,CCL17），并下調腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、IL-6、IL-12等細胞因子，最終抑制細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocytes,CTLs）的活化并擴展CD4+CD25+FOXP3+Tregs的表達[27-30]。隨后發(fā)現，高水平的IL-10、MRC1、CCL17以及低水平的TNF-α、IL-6、IL-12細胞因子表達屬于巨噬細胞“M2”激活狀態(tài)下的產物[31]，因此推測腫瘤中的Ang-2通過誘導TEMs表達“M2”表型以發(fā)揮促血管生成作用。值得注意的是，Ang-2對腫瘤血管的作用具有器官依賴性。在小鼠肝轉移模型中，敲減Ang-2后，血清中粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF）和CXC趨化因子配體1（CXC chemokine ligand,CXCL1）顯著上調，導致Tie2+/CD11b+/CD31-型免疫細胞的募集，最終腫瘤血管代償性生成；相反，在肺轉移瘤中Ang-2缺陷型小鼠腫瘤血管生成減少，血清G-CSF不增加，但發(fā)現轉移過程中伴隨著細胞因子IL-13、IL-15的顯著增加，而IL-13已知可抑制某些癌細胞系的增殖，IL-15可啟動T細胞分裂、NK細胞發(fā)育和CD8+記憶T細胞的產生[32]。因此，這些細胞因子的差異性變化可以解釋Ang-2對肺和肝中的腫瘤生長以及血管生成的不同作用。

3.2 Ang-2/Tie2通路中涉及的相關細胞因子和蛋白

3.2.1 IL-10 IL-10是一種與NSCLC預后相關的免疫抑制因子，Hatanaka等[33]在95例NSCLC手術標本中驗證出IL-10的高表達與Ang-2和Tie2基因的表達顯著相關，且在IL-10高表達區(qū)域腫瘤血管的數量明顯增多，從而提示了Ang-2/Tie2系統(tǒng)網絡可通過誘導免疫因子IL-10的表達實現對新生血管的調控。

3.2.2 血管滲漏相關因子 在肺癌轉移前期，已有研究[34]證明Ang-2、MMP3和MMP10表達上調，繼而導致血管通透性增加，循環(huán)腫瘤細胞外滲和轉移，進一步研究證實，腫瘤細胞的惡性程度與其誘導Ang-2、MMP3和MMP10的表達能力呈正相關，且TNF-α和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）也參與了這些轉移相關因子的調節(jié)。此外，Ang-2還通過促進磷脂酰肌醇特異性磷酯酶（phosphatidylinositol specific phospholipase,PLCγ2）的激活和鈣離子（Ca+）內流等生物學行為以誘導多種血管滲漏相關細胞因子（組胺、緩激肽、VEGF）的表達[35]，表明Ang-2可通過調節(jié)血管滲漏過程促進腫瘤的發(fā)展。

3.2.3 中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps,NETs） NETs是中性粒細胞在適宜刺激下釋放到胞外的一種纖維網格樣結構。最初被認為具有捕獲細菌、控制感染的作用，近年來NETs被發(fā)現還具有細胞毒性和免疫原性成分，與多種非感染性病理狀態(tài)如腫瘤、自身免疫疾病相關。Lavoie等[36]證實，Ang-1和Ang-2均可與NETs表面的Tie2受體結合，并上調NETs的合成和釋放，釋放后的NETs可誘導中性粒細胞和內皮細胞活化，從而在Ang-2介導的促炎和促血管生成過程中作出貢獻。

3.2.4 凋亡、轉移相關蛋白 HMGA2是一種與腫瘤發(fā)展相關的遷移蛋白，2016年一項研究[37]發(fā)現在肺鱗癌中Ang可結合其下游調控蛋白HMGA2的啟動子，使其表達量增加，繼而顯著提高了細胞的增殖、遷移及侵襲能力。Survivin作為迄今發(fā)現的功能最強的凋亡抑制蛋白，其在肺癌患者血清中表達量高于正常對照組，且與Ang-2和VEGF的表達呈顯著正相關，有研究[38]表明在VEGF的影響下，Ang-2可上調survivin的表達從而促進腫瘤血管生成，三者協(xié)同促進肺癌的進展和轉移。肺癌細胞中金屬蛋白酶9（A disintegrin and metalloprotease,ADAM9）的上調與大腦轉移顯著相關，研究顯示在ADAM9沉默的細胞中Ang-2、VEGF-A的表達受到抑制，表明ADAM9可通過血管重構促進腫瘤轉移[39]?？傊?，以上研究成果證明Ang-2通過調控各種凋亡、轉移蛋白來影響肺癌細胞的生物學行為。

3.3 Ang-2與腫瘤炎癥微環(huán)境 最新的一項薈萃分析[8]顯示，Ang-2與炎癥標志物（纖維蛋白原、白細胞、超敏C反應蛋白）均呈正相關，提示Ang-2在炎癥反應中起到了重要作用。轉移生態(tài)位模型認為，腫瘤發(fā)生轉移之前，轉移位點必須提供有利于腫瘤細胞生長的炎癥微環(huán)境（即轉移生態(tài)位），這是形成新的轉移灶的前提條件[40]。Srivastava等[41]在乳腺癌肺轉移的模型中發(fā)現，肺轉移瘤來源的細胞為趨化因子受體2（chemokine receptor,CCR2）陽性和Tie2陰性的轉移相關巨噬細胞（CCR2+Tie2-MAMs），深入研究發(fā)現，在轉移發(fā)生之前，Ang-2可通過自分泌的方式刺激轉移生態(tài)位處的血管內皮細胞，繼而誘導粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule,ICAM-1）和CCL2的表達上調，營造出適合巨噬細胞存活和粘附的生態(tài)環(huán)境，使得遠端氣管內皮細胞對CCR2+Tie2-MAMs粘附敏感從而促進腫瘤轉移。Fiedler等[42]也同樣證實了Ang-2可發(fā)揮促炎細胞因子的作用，其通過促進內皮細胞上調ICAM-1和血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule,VCAM-1）的表達，從而誘導炎性細胞與內皮細胞的牢固粘附。隨后Scholz等[43]利用體外實驗證明了Ang-2誘導的炎性粘附僅對單核細胞有效，而對淋巴細胞沒有影響?？傊?，目前研究均證實了Ang-2可作為造成腫瘤炎癥微環(huán)境的炎癥反應調節(jié)劑，參與腫瘤轉移和生長的過程。

3.4 周細胞的覆蓋與EMT 周細胞是血管重要的結構和功能組分，位于血管內皮細胞周圍，目前認為周細胞覆蓋率高的患者，血管屏障穩(wěn)定，總體生存率更高[44]。周細胞具有抑制或促進腫瘤生長和轉移的階段特異性作用，這種相反的功能受到Ang/Tie2傳導信號的調控[45]。早期非缺氧腫瘤中，檢測到Ang-1的高表達，而Ang-2無明顯改變，此時在Ang-1/Tie2的作用下，周細胞增加對血管的包裹，從而提高了血管穩(wěn)定性，導致“新生血管生成抑制”的表型，阻礙了腫瘤生長和轉移；相反，晚期腫瘤負荷增加時，此時Ang-2水平升高，在Ang-2的主導作用下，周細胞覆蓋率下降，導致血管缺陷，瘤內缺氧加重，引起上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition,EMT）增加，最終促進腫瘤轉移[4,46]。

3.5 Ang-2其他相關信號通路

3.5.1 鈣調磷酸酶-NFAT-Ang-2信號通路 在腫瘤轉移之前VEGF即與轉移灶處內皮細胞上的VEGF受體結合活化，繼而激活PLCγ2/Ca2+途徑，繼而導致細胞內Ca2+上調，使得Ca2+調節(jié)的鈣調磷酸酶被激活，導致活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）家族的轉錄因子去磷酸化[47]，繼而下游的靶標Ang-2增加，之后激活轉移灶內皮，促進轉移，當過表達內源性抑制劑例如Dscr-1基因后，Ang-2 mRNA顯著下調，并抑制了早期轉移病灶中內皮活化[48]，證實了鈣調磷酸酶-NFAT-Ang-2信號通路可調節(jié)早期轉移灶的內皮活化，在促進轉移灶處的腫瘤細胞接種和擴增中起重要作用。

3.5.2 Ang-2-β1-整合素信號通路 β1-整合素在維持內皮肌動蛋白細胞骨架中具有雙重的作用，依賴于Ang-2的亞細胞定位功能：細胞外周中的β1-整合素維持肌動蛋白細胞骨架，而細胞中心的β1-整合素拉伸粘連，激活肌動蛋白應力纖維。Ang-2可通過直接相互作用激活內皮β1-整聯素，血清中的促炎細胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α等也可激活下游的β1-整合素，使得定位在細胞中心的β1-整合素伸長粘連作用顯著增強，繼而含VE-鈣粘連蛋白（VE-cadherin）的肺微血管內皮細胞-細胞連接減弱，最終降低內皮單層完整性，導致屏障功能降低，毛細血管滲漏增加，以此通過Ang-2-β1-整合素信號通路途徑促進腫瘤侵襲和轉移[49]。

3.6 Ang-2在淋巴管生成方面的作用 淋巴轉移是NSCLC擴散的重要途徑，在腫瘤缺氧、高壓的微環(huán)境作用下，腫瘤細胞和間質細胞會誘導淋巴管生長因子的分泌和活化，而最終淋巴管生成依賴于多種生長因子（包括VEGF家族、Ang家族等）的調節(jié)。NSCLC組織、血液中檢測到高表達的Ang-2與淋巴結轉移和患者低生存率相關，但其具體機制尚未闡明。事實上，Ang-2雖然通過競爭性拮抗作用破壞血管內皮穩(wěn)定，但在淋巴內皮中Ang-2/Tie2通路發(fā)揮的卻是激動作用，Ang-2可通過激活淋巴管內皮細胞（lymphatic endothelial cells,LECs）上的Tie2受體，引起LECs的遷移、增殖和淋巴管增生[50]。Souma等[51]在小鼠模型中發(fā)現這種相反的生物學功能取決于血管內皮蛋白酪氨酸磷酸酶（vascular endothelial protein tyrosine phosphatase,VEPTP）的存在與否：LECs中缺乏VEPTP，此時Ang-2/Tie2發(fā)揮內皮激動功能，相反，血管內皮表達高水平的VEPTP，而VEPTP會提高Tie2的激活閾值并阻止Ang-2的激活，這揭示了Ang-2促進淋巴轉移的部分機制。

4 針對Ang-2的靶向治療進展

腫瘤所處的缺氧、酸性、高間質壓力的微環(huán)境，形成了藥物遞送到腫瘤組織中的病理性屏障[52]。傳統(tǒng)的抗血管生成方法主要集中在抑制新血管形成和破壞原有腫瘤血管方面，代表藥物如貝伐珠單抗（抗VEGF單克隆抗體）雖然短期內可抑制腫瘤血管生成，但隨后會因血管退化和稀疏造成腫瘤組織的極度缺氧，導致Ang-2的表達上調，繼而促進VEGF非依賴性的腫瘤血管生成，并最終導致耐藥性增加[53]。

多項研究證明，在腫瘤進展早期階段對VEGF或Ang-2進行阻斷可顯著減少血管生成、腫瘤生長、侵襲和轉移，且減少了血管滲漏和周細胞脫落[54]。但單獨阻斷Ang-2或VEGF表達的效果都不甚滿意[55]。Ang-2和VEGF雙重阻斷的抑瘤功效被證明大于單一阻斷Ang-2或VEGF，然而，無論是單一或是雙重阻斷仍然存在增加腫瘤缺氧和隨后惡化腫瘤微環(huán)境的風險[56,57]。 最近在小鼠模型中研究發(fā)現，ABTAA（Ang-2抑制和Tie2激活抗體）和ABA（Ang-2抑制抗體）相比，ABTAA誘導腫瘤脈管系統(tǒng)正常化，導致血液灌注增加，且顯著減少乳酸酸中毒和腫瘤生長、轉移，最終通過營造有利的腫瘤微環(huán)境以增強化療藥物的遞送[58]，可作為有效抗癌藥物。因此，未來抗血管生成靶向藥物可著力于Ang-2相關因子的雙靶點或多靶點聯合，但怎樣搭配才能發(fā)揮最大效能仍在探索，同時尋找實現腫瘤血管正?；?、不惡化腫瘤微環(huán)境以增強化療藥物遞送的靶向藥物仍是關鍵。

5 小結與展望

Ang-2作為一類重要的促血管生成因子，已被證實在NSCLC組織、血液中表達顯著上調，且與腫瘤TNM 分期、淋巴結轉移相關，提示Ang-2可作為NSCC診斷和預后的潛在生物學標志物。目前關于Ang-2是如何促進腫瘤增殖、侵襲、轉移的相關機制仍在研究，已知其可通過干擾血管內皮穩(wěn)定性、誘導新生血管生成、調節(jié)炎癥和血管滲漏過程、促進周細胞脫落、促進淋巴管增生、淋巴內皮細胞增殖等方面實現對癌細胞惡性生物學行為的調控，以上機制為針對Ang-2的靶向藥物研究提供新目標。