田海芹 朱剛 王恒昌 陳飛飛

（江蘇省灌南縣畜牧獸醫(yī)站 222500）

小反芻獸疫也稱小反芻獸假性牛瘟、肺腸炎、口炎肺腸炎復(fù)合癥，俗稱 “羊瘟”，是由小反芻獸疫病毒引起的，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征的急性接觸性傳染病。主要感染山羊、綿羊等家養(yǎng)和野生小反芻動物，山羊高度易感，綿羊次之[1]。該病是世界衛(wèi)生組織（OIE）法定報告的動物疫病，在我國劃定為一類動物疫病。2007年我國首次在西藏阿里地區(qū)確證了小反芻獸疫的發(fā)生[2]。2012年 《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》將其列入13種重點防范的外來動物疫病。小反芻獸疫病毒樹副黏病毒科麻疹病毒屬，只有一個血清型[2]。

2014年江蘇省連云港市將小反芻獸疫由非免疫區(qū)調(diào)整為免疫區(qū)。根據(jù)新疆天康生物股份有限公司生產(chǎn)的活疫苗的使用說明書，其免疫持續(xù)期為 “36個月”。在實際使用過程中，不少村級防疫員及養(yǎng)羊戶對免疫持懷疑態(tài)度，為此灌南縣畜牧獸醫(yī)站在轄區(qū)內(nèi)選取45只羊進(jìn)行小反芻獸疫免疫試驗，探索羊小反芻獸疫抗體的抗體消長規(guī)律，并對其免疫效果及防控效果進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 疫苗

小反芻獸疫活疫苗（chone9株）新疆天康生物股份有限公司；疫苗批次2016041?？谔阋叨r滅活疫苗（OHM/02株+JSL株）新疆天康生物股份有限公司；疫苗批次2016017。

1.2 試驗動物

選取45只2～36月齡的羊作為試驗動物，性別不限，在試驗前對45只羊全部采集血清樣品，檢測小反芻獸疫抗體，結(jié)果為陰性者才能納入作為試驗動物。

1.3 免疫方案

每只羊注射1ml口蹄疫二價滅活疫苗（肌肉注射），7d后注射1ml的小反芻獸疫活疫苗（頸部皮下注射）。

1.4 免疫副反應(yīng)及臨床防控效果觀察

接種后21d內(nèi)對被免疫羊進(jìn)行接種局部觀察，對接種種幼畜進(jìn)行分別觀察，精神及采食狀態(tài)進(jìn)行觀察，以全面了解該疫苗的免疫副反應(yīng)情況。在試驗過程當(dāng)中，密切觀察羊?qū)π》雌c獸疫的免疫應(yīng)答能力。

1.5 血清樣品的采集

分別于疫苗接種后的第0、28、84、168、366、550天對羊只進(jìn)行采血。

1.6 檢測方法與試劑

檢測方法：阻斷ELISA方法檢測[3]；試劑盒：小反芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測試劑盒（青島立見）中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心外來動物疫病研究中心（OIE小反芻獸疫參考實驗室）生產(chǎn)，批號201641-1及201714-1。酶標(biāo)儀：Infinite F50酶標(biāo)儀是Tecan新一代的8通道光吸收酶標(biāo)儀，不僅能實現(xiàn)快速測量提供準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好的測量結(jié)果，而且還樹立了結(jié)構(gòu)緊湊的創(chuàng)新性設(shè)計新標(biāo)準(zhǔn)。憑借其簡潔易用的操作和數(shù)據(jù)分析軟件，Infinite F50可成為ELISA試驗一系列應(yīng)用的理想選擇。

檢測方法介紹如下：

（1）在A1和B1抗原包被孔中加入陽性血清，50μl/孔。

（2）在C1和D1抗原包被孔中加入陰性血清，50μl/孔。

（3）在E1和F1抗原包被孔中加入稀釋液，50μl/孔。

（4）在樣品孔中加入稀釋液，25μl/孔。

（5）在樣品孔中再加入待檢血清，25μl/孔。

（6） 37℃孵育 60min。

（7）棄去反應(yīng)孔中的液體。

（8）每孔用洗滌液清洗4次，洗滌液（1×）300μl/孔。

（9）每次除去洗滌液后，在吸水紙上拍干，除去殘留的液體。

（10） 每孔中加入酶標(biāo)單抗（1×） 50μl。

（11） 37℃孵育 30min。

（12） 重復(fù)步驟 7～9。

（13）每孔中加入底物溶液50μl/孔。

（14） 室溫中避光作用10～15min。

（15）每孔中加入50μl終止液終止所有反應(yīng)。

（16）用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔的OD450值，計算阻斷率。

阻斷率（PB）計算方法：

PB=100-[待檢血清 OD450nm（or對照 OD450nm）×100]/cm OD450的平均值。

（17）結(jié)果判定：①陽性對照阻斷率（PB）＞60，陰性對照阻斷率（PB）＜40，試驗結(jié)果有效，否則重新進(jìn)行試驗；②待檢樣品阻斷率（PB）＞50，判為陽性；③待檢樣品阻斷率（PB）≤50，判為陰性。

2 結(jié)果

2.1 小反芻獸疫抗體檢測結(jié)果

6個時間點抗體檢測結(jié)果（抗體陽性率）分別為：第0天0%（0/45）； 第 28天 100%（45/45）； 第 84天 97.7%（44/45）；第168天95.6%（43/45）； 第336天90%（40/45）； 第550天67.5%（27/45）。

2.2 免疫副反應(yīng)及臨床防控免疫效果

作者簡介：劉坤（1971.11-），女，遼寧省瓦房店市人，本科，獸醫(yī)師，主要從事動物防疫工作。

所有試驗羊未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫副反應(yīng)情況；試驗整個過程未發(fā)現(xiàn)試驗羊有小反芻獸疫感染情況。

3 討論

（1）新疆天康小反芻獸疫活疫苗具有良好的免疫原性，在免疫后最近的檢測時間第28天抗體陽性率達(dá)100%；在免疫后第84天，抗體陽性率為97.7%，略有下降；第168、336天檢測，抗體陽性率進(jìn)一步小幅度下降；在第336天保持在94.5%；隨著免疫時間的推遲，在免疫后550d抗體陽性率下降至67.5%。但總體來說，該小反芻獸疫活疫苗免疫持續(xù)期至少在550d以上，也就是說一年之內(nèi)只需接種一次該疫苗，即可獲得良好的免疫保護(hù)作用。

（2）本次試驗最初選用的45只試驗羊，因為試驗周期比較長，導(dǎo)致后續(xù)樣本數(shù)量因為種種原因（比如出售、轉(zhuǎn)地）略有減少，但對這部分羊的跟蹤監(jiān)測結(jié)果比較可靠。

（3）由于小反芻獸疫活疫苗目前僅有新疆天康生物有限公司獲得生產(chǎn)批文，對于畜牧獸醫(yī)工作者及養(yǎng)羊戶迫切關(guān)心的防控效果及免疫持續(xù)期問題。筆者認(rèn)為，該疫苗防控效果良好，具有良好的免疫原性，作為商品羊只需要接種一次該疫苗，即可有效預(yù)防小反芻獸疫，而對于種羊每隔18個月接種一次該疫苗，也能有效地防控小反芻獸疫。