王 毅，王 凌，康紹軍*，曾 桂

(1.重鋼總醫(yī)院神經(jīng)外科，2.放射科，3.超聲科，重慶 400081)

腦卒中是全球第二大死亡原因和成人致殘的首要原因[1],其中缺血性腦卒中發(fā)病率最高，我國的發(fā)病率約為43.70%～78.90%[2]。目前,缺血性腦卒中的臨床治療，除于發(fā)病急性期6 h以內(nèi)溶栓以及后期功能鍛煉外，尚無更有效的治療措施。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經(jīng)生長因子家族成員之一，具有保護神經(jīng)元、減少神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)元在有害環(huán)境下生存等作用[3-5]。BDNF治療實驗性卒中，可促進卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)，改善卒中預(yù)后[6]。正常血腦屏障(blood brain barrier， BBB)通透性低，外周大分子物質(zhì)很難通過BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。另外，外周血液系統(tǒng)內(nèi)存在的BDNF內(nèi)切酶，導(dǎo)致BDNF半衰期短，劑量不穩(wěn)定，限制其臨床應(yīng)用[6]。研究[8]顯示，卒中后靜脈注射5 μg BDNF對大鼠梗死范圍無保護作用，而對BDNF進行化學(xué)修飾后，可與BBB上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor， TfR)結(jié)合，進入大腦發(fā)揮保護作用。近年研究[9]表明,超聲聯(lián)合微泡可以靶向開放BBB，使得大分子藥物有機會直接通過BBB進入特定區(qū)域發(fā)揮治療作用，從而簡化或省去藥物的化學(xué)修飾過程。筆者應(yīng)用這一效應(yīng)實現(xiàn)BBB早期開放，對大腦中動脈梗阻(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型預(yù)防性靜脈注射BDNF，旨在評價其對急性缺血性腦卒中缺血部位的預(yù)防性治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠27只，體質(zhì)量約200～300 g(購自第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，隨機分為假手術(shù)組、BDNF組、BDNF超聲組，每組動物9只。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度(22±1)℃,12 h循環(huán)黑白照明，自由取食與飲水。所有動物飼養(yǎng)的設(shè)施和環(huán)境遵照國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》(GB14925-2001)，飼養(yǎng)管理和實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本實驗經(jīng)我院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 MCAO模型的建立及治療 術(shù)前12 h實驗動物禁食不禁飲。經(jīng)尾靜脈緩慢推注2.5%戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich公司)2.5 mg/kg體質(zhì)量進行麻醉，將實驗動物仰臥保定于解剖臺，頸部備皮并消毒。于頸部正中切口，暴露頸前肌，沿右側(cè)胸鎖乳突肌間隙分離肌肉組織，分離暴露右側(cè)頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery， ICA)和頸外動脈(external carotid artery， ECA)。結(jié)扎ECA近心端和遠心端，中間剪斷，暫時夾閉ICA、CCA。將尼龍線插入ECA，用5-0絲線用力結(jié)扎，打開ICA處動脈夾，將尼龍線插入ICA，繼續(xù)插入顱內(nèi)至微感阻力，插入深度約(18.5±0.5)mm，使尼龍線頭端通過大腦中動脈起始處，到達較細的大腦前動脈，結(jié)扎ECA、固定尼龍線并防止出血。阻斷1 h后退出尼龍線進行再灌注，5-0慕絲線結(jié)扎ECA，逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3天注射青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司),每天2.5萬U/kg體質(zhì)量。

假手術(shù)組：只進行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導(dǎo)入線栓；BDNF組：在模型建立前通過尾靜脈預(yù)防性注射50 μg BDNF(Sigma-Aldrich公司)，不進行超聲輻照；BDNF超聲組：經(jīng)尾靜脈注入50 μg BDNF和2 ml超聲造影劑聲諾維(干粉溶于5 ml生理鹽水；SonoVue，Bracco公司)，以超聲診斷儀(HP Sonos-5500型)S3探頭輻照動物顱腦10 min。頻率采用諧波1.7 MHz/3.3 MHz，成像深度3 cm，超聲輸出機械指數(shù)為1.0，超聲重復(fù)頻率1 Hz。實驗結(jié)束后，將動物回籠飼養(yǎng)。術(shù)后24 h后每組取3只動物檢測腦組織內(nèi)BDNF濃度，剩余動物在術(shù)后第1、3、7天進行MR檢查并進行行為學(xué)評價，最后取腦進行TTC染色。

1.3 ELISA檢測 取各組動物梗死部位相同質(zhì)量的腦組織，按照W/V=11∶100加入蛋白裂解液充分勻漿并提取蛋白，按照ELISA試劑盒說明書檢測BDNF含量，并計算對應(yīng)的濃度值。

1.4 MR檢查 采用Agilent 7.0T MR儀(美國安捷倫科技有限公司)。術(shù)后第1天行DWI，參數(shù)：15層，層厚1 mm，層間距0，TR 2 000 ms, TE 36 ms，回波間隔時間10 ms, 平均次數(shù)20, FOV 30 mm× 30 mm，矩陣128×128。術(shù)后第3天和第7天采用FSEM T2W序列掃描，參數(shù)：15層，層厚1 mm，層間距0，TR 2 524 ms, TE 20 ms，回波間隔時間 20 ms,平均次數(shù)16，F(xiàn)OV 40 mm×40 mm，矩陣196×196。

1.5 TTC染色 經(jīng)生理鹽水灌注后取腦，保持大腦的完整性。-20℃冰箱中速凍20 min左右，用專用腦槽，將大腦切片，然后置于0.05%新鮮配置的TTC中，37℃避光孵育15～30 min，PBS洗3次，每次約1 min，多聚甲醛固定30 min～24 h。

1.6 行為學(xué)評價 術(shù)后第1天、第3天和第7天，采用改良的Bederson評分對大鼠進行行為學(xué)評價。0分，行為完全正常；1分，提起鼠尾離開地面，對側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收；2分，放至地面，手術(shù)對側(cè)抗力下降者；3分，觀察其行走，圍繞手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈者；4分，無法自主活動者。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 14.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。3組行為學(xué)評分的比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織內(nèi)BDNF含量 術(shù)后24 h，3組間腦組織BDNF水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.83，P均<0.05)，兩兩比較示BDNF組 [(79.8 ± 20.8)pg/ml]、BDNF超聲組[(127.0 ± 22.9)pg/ml]腦組織BDNF水平均高于假手術(shù)組[(46.9 ± 17.9)pg/ml](P均<0.05)；BDNF超聲組高于BDNF組(P<0.05)。

2.2 腦梗死面積 BDNF組：隨著時間的延長，高信號梗死區(qū)域逐漸增大，術(shù)后第7天梗死區(qū)面積基本接近半個腦。BDNF超聲組：隨著時間的延長，高信號梗死區(qū)域面積逐漸縮小，術(shù)后第7天時，梗死區(qū)面積小于術(shù)后第1天和第3天。術(shù)后第7天BDNF超聲組梗死區(qū)面積比BDNF組小，水腫較BDNF組輕(圖1)。腦組織TTC染色示術(shù)后第7天BDNF超聲組白色缺血梗死區(qū)面積明顯較BDNF組小(圖2)。

2.3 行為學(xué)評價 術(shù)后第1天、第3天，BDNF組和BDNF超聲組行為學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后第7天，BDNF超聲組的行為學(xué)評分明顯低于BDNF組(P<0.05)，見圖3。

圖1 大鼠腦部冠狀位MRI顯示梗死灶區(qū)域為高信號區(qū) 術(shù)后第1天、第3天、第7天假手術(shù)組(A～C)、BDNF組(D～F)和BDNF超聲組(G～I) 圖2 術(shù)后第7天腦組織TTC染色圖 A.假手術(shù)組; B.BDNF組; C.BDNF超聲組 (白色區(qū)域為梗死灶)

圖3 術(shù)后第1天、第3天和第7天,假手術(shù)組、BDNF組和BDNF超聲組大鼠Bederson評分隨時間的變化曲線

3 討論

我國腦血管病的患病率高，臨床死亡率高，后遺癥多。BDNF作為潛在的藥物分子，被用來治療包括缺血性卒中等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。抑制或因敲除BDNF可擴大卒中梗死體積，應(yīng)用BDNF治療實驗性卒中，可促進卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)，改善卒中預(yù)后[3-5]。外周血液系統(tǒng)存在BDNF內(nèi)切酶，導(dǎo)致外周給藥半衰期短，劑量不穩(wěn)定。因此，BDNF安全、穩(wěn)定、高效地跨越BBB到達靶區(qū)，是BDNF治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。

BBB是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，很多治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物由于BBB的作用而難以在腦組織達到有效濃度，不能充分發(fā)揮療效[10]。目前跨越BBB給藥的方式主要有4種：①穿顱路徑或經(jīng)鼻路徑給藥，但易損傷腦組織及并發(fā)感染等；②利用甘露醇等前體藥物開放BBB[11]，促進藥物進入腦組織，但此方式彌散性開放全腦的BBB，藥物會對正常組織造成影響；③對藥物進行脂溶性化學(xué)修飾、改變分子量大小和電荷以促進其跨BBB[12]，但給藥效率較低；④利用高分子藥物載體，如脂質(zhì)體，但載體的載藥量較低，難以達到治療濃度。

研究[9]表明，超聲微泡介導(dǎo)聲孔效應(yīng)可以靶向性、可逆性開放BBB，引起B(yǎng)BB通透性暫時增加，同時并未引發(fā)局部腦組織的明顯損傷。已有研究[13-14]證實，低頻診斷超聲可穿透顱骨準(zhǔn)確聚焦開放BBB，同時微泡的應(yīng)用大大降低了超聲的空化閾值。Fan等[15]將微泡同伊文思藍染料共同經(jīng)靜脈注射到動物體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲照射區(qū)域內(nèi)伊文思藍染料的溢出率明顯高于非照射區(qū)域，而單獨超聲照射的對照組雙側(cè)無明顯變化；實驗中各組均無出血或其他腦實質(zhì)損害。

本研究對MCAO動物模型預(yù)防性使用BDNF，并通過超聲微泡介導(dǎo)的BBB靶向開放效應(yīng)，提高BDNF的局部濃度，驗證其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防性治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在治療后24 h，BDNF超聲組腦組織中BDNF含量明顯高于BDNF組及假手術(shù)組，提示超聲促進了藥物在治療區(qū)的聚集。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)BDNF組腦組織中BDNF含量高于假手術(shù)組，可能隨著腦缺血的發(fā)展，BBB逐漸被破壞，血液循環(huán)中BDNF部分進入了梗死區(qū)域。BDNF超聲組MRI上高信號梗死區(qū)面積隨時間逐漸縮小，第7天時，其梗死區(qū)域小于第1天和第3天。與BDNF組比較，BDNF超聲組梗死區(qū)域也明顯縮小，且水腫較輕。盡管BDNF可以隨著BBB破壞而進入梗死區(qū)，但隨著藥物在血液中的降解，進入梗死區(qū)的BDNF尚不能達到有效的治療劑量，故BDNF組的梗死面積與BDNF超聲組比較具有較大的差異。TTC染色結(jié)果與MRI結(jié)果一致。行為學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后第7天BDNF超聲組的評分明顯低于BDNF組。均提示BDNF對神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的保護和治療作用，并且超聲微泡介導(dǎo)的聲孔效應(yīng)開放了目標(biāo)區(qū)域的BBB，提高了藥物在靶區(qū)的治療濃度，促進了神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，本研究觀察BDNF在超聲介導(dǎo)下對MCAO大鼠模型的治療作用，為缺血性腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種高效、無創(chuàng)、安全的治療方法。

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