, , , , , 洪志,3*

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 哈爾濱 150081; 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院, 上海 201209; 3. 上海健康醫(yī)學(xué)院, 上海 201308)

目前,有關(guān)賽諾嗎嗪殘留的分析方法已有很多報道,儀器分析方面大多采用液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法[4-10]等。這些方法使用的儀器成本較高,需要專業(yè)人員操作;而且賽諾嗎嗪屬極性化合物,其樣品前處理過程復(fù)雜,使用溶劑量較大,對色譜柱、流動相配比要求極高,檢測結(jié)果穩(wěn)定性不高,導(dǎo)致檢測方法無法普及。因此,如何快速準(zhǔn)確、低成本地分析食品中的賽諾嗎嗪成為亟待解決的問題。

本工作采用原位聚合法,以金電極為基底,賽諾嗎嗪為模板分子,鄰苯二胺為功能單體,制備賽諾嗎嗪分子印跡電化學(xué)傳感器,測定食品中的賽諾嗎嗪。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

CHI 660B型電化學(xué)工作站,配三電極系統(tǒng)(金電極為工作電極、鉑柱電極為對電極、飽和甘汞電極為參比電極);PHSJ-3F型酸度計;KQ-100型超聲波清洗器;BS 110型分析天平;IT-07A-3型恒溫電磁攪拌器;Synergy型超純水系統(tǒng)。

測試背景溶液:0.1 mol·L-1KCl和5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]混合溶液。

賽諾嗎嗪、鄰苯二胺、2-(三氟甲基)丙烯酸和鄰氨基酚為分析純,試驗用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

電化學(xué)傳感器在室溫下工作,采用三電極系統(tǒng),金電極為工作電極,鉑柱電極為對電極,飽和甘汞電極作為參比電極。

1．3 試驗方法

1．3．1 金電極的預(yù)處理

將金電極分別用0.30,0.05 μm的Al2O3粉末拋光鏡面,用水洗凈電極表面后,依次在硝酸、乙醇、水中超聲5～10 min,取出后用水洗凈,用氮氣吹干。將處理好的電極放于測試背景溶液中,用循環(huán)伏安法掃描(掃描速率50 mV·s-1),測試電極性能,當(dāng)循環(huán)伏安曲線電位差在70 mV以下,電極方可使用。

1．3．2 賽諾嗎嗪分子印跡電化學(xué)傳感器工作電極的制備

稱取石墨烯0.000 5 g,用10 mL二甲基甲酰胺溶解,超聲2 h使石墨烯分散均勻,用滴涂法分兩次將10 μL分散好的石墨烯溶液滴涂在金電極表面,自然干燥后待用。

以石墨烯修飾的金電極為工作電極,分別稱取賽諾嗎嗪0.027 7 g和鄰苯二胺0.003 0 g置于容量瓶中,用甲醇-乙酸-乙醇-pH 7.00磷酸鹽緩沖溶液(4+1+1+4)混合溶液定容至10 mL,制成自組裝溶液,分別超聲和氮吹10 min除氧,保持電解池密閉遮光,浸入三電極系統(tǒng),室溫靜置15 min,在電位-0.3～1.2 V內(nèi),以50 mV·s-1掃描速率掃描22圈,然后取出工作電極,自然晾干后將其在乙酸-甲醇(1+9)混合溶液中浸泡一定時間以洗脫賽諾嗎嗪印跡分子,得到賽諾嗎嗪印跡電極。非印跡電極的制備,除不含模板分子外,其他條件同印跡電極的制備過程。

1．3．3 傳感器的電化學(xué)分析檢測方法

在測試背景溶液中,分別采用循環(huán)伏安法、電化學(xué)阻抗法和差分脈沖伏安法(DPV)對印跡電極傳感器進(jìn)行表征,每次測試完用水淋洗。

1．3．4 樣品分析

利用粉碎機(jī)將蛋黃和蛋白充分混合并于-20 ℃儲存,稱取蛋黃蛋白混合液1.000 g,加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液10 mL,以4 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心15 min,用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋上清液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,待測。

2 結(jié)果與討論

2．1 功能單體的選擇

功能單體的選擇主要由模板分子的結(jié)構(gòu)特性決定,模板分子和功能單體之間作用的強(qiáng)度和取向是使分子印跡聚合物獲得良好的分子識別性能的關(guān)鍵[11]。試驗分別選用鄰苯二胺、鄰氨基酚、三氟甲基丙烯酸和丙烯酰胺作為電聚合的功能單體。通過循環(huán)伏安法比較峰電流的大小,鄰苯二胺作為功能單體可以得到較大的峰電流;且鄰苯二胺含有較多的氫鍵使鄰苯二胺和環(huán)丙氨嗪可以形成較多的氫鍵,通過試驗驗證了當(dāng)賽諾嗎嗪與鄰苯二胺的物質(zhì)的量比為1∶6時對模板分子的響應(yīng)最好。

因此,對于賽諾嗎嗪模板分子,以鄰苯二胺為功能單體可望制備對賽諾嗎嗪親和性高、對同系物的辨別能力強(qiáng)及選擇性好的分子印跡聚合物材料。

2．2 石墨烯對金電極的影響

石墨烯具有很高的導(dǎo)電性和比表面積,其理論比表面積高達(dá)2 600 m2·g-1,在室溫下具有較高的電子遷移率(1.5×104cm2·V-1·s)[12-13],將石墨烯修飾到金電極表面后,可明顯增強(qiáng)其導(dǎo)電性,進(jìn)而提高傳感器的靈敏度。圖1為金電極和石墨烯修飾金電極的阻抗圖和循環(huán)伏安圖。

(a) 阻抗圖

(b) 循環(huán)伏安圖 1-金電極;2-石墨烯修飾金電極圖1 金電極和石墨烯修飾金電極的阻抗圖和循環(huán)伏安圖Fig. 1 Impedance and cyclic voltammograms of gold electrode and graphene modified gold electrode

由圖1(a)可以看出,金電極經(jīng)過石墨烯修飾之后,其電阻明顯減小,導(dǎo)電性明顯提高。由圖1(b)可以看出,金電極經(jīng)石墨烯修飾后,循環(huán)伏安響應(yīng)明顯提高。

2．3 掃描圈數(shù)的影響

在模板分子存在下,利用循環(huán)伏安法電聚合鄰苯二胺,在電極上形成一層聚合膜,沉積在電極表面的膜的厚度對電化學(xué)傳感的性能有較大影響。膜太厚則包埋在膜中的印跡分子不易洗脫出來,增加洗脫時間;而膜太薄則形成的特定位點太少,不能有效地重新鍵合固定賽諾嗎嗪模板分子。因此,可通過掃描的圈數(shù)來控制膜厚度。試驗選擇掃描圈數(shù)為22圈,見圖2。

圖2 不同掃描圈數(shù)下的循環(huán)伏安圖Fig. 2 Cyclic voltammograms under different scan cycles

2．4 模板分子和功能單體的濃度對分子印跡聚合物的影響

制備分子印跡聚合物時,印跡比例越大,活性作用位點越多,其印跡聚合物越規(guī)則,而規(guī)則的聚合物有助于識別模板分子與辨別其同系物,同一模板分子其印跡比例越大,則分子印跡聚合物識別模板分子的能力就越強(qiáng),非特異性吸附就越弱。但印跡比例過大,功能單體之間會因空間距離、位阻效應(yīng)和作用位點不足而產(chǎn)生自身的締合,從而使模板分子與功能單體分子間斥力增大,導(dǎo)致二者之間距離增大,使其氫鍵數(shù)目變少,復(fù)合物穩(wěn)定性減弱。鄰苯二胺功能單體和賽諾嗎嗪印跡分子的濃度比對分子印跡聚合物膜的性質(zhì)有較大影響。試驗在鄰苯二胺和賽諾嗎嗪的物質(zhì)的量比分別為2∶1,3∶1,4∶1,5∶1,6∶1時,制備不同的賽諾嗎嗪分子印跡膜電極,采用DPV檢測印跡電極響應(yīng)性能。當(dāng)鄰苯二胺與賽諾嗎嗪的物質(zhì)的量比為6∶1時,制備的印跡膜具有最大的響應(yīng)。因此,試驗中采用二者的物質(zhì)的量比為6∶1。

2．5 聚合底液酸度對分子印跡聚合物的影響

由于賽諾嗎嗪分子印跡聚合物之間的相互作用主要是氫鍵作用,所以選擇合適的聚合底液酸度尤為重要?？刂破渌囼灄l件不變,分別在pH為5.50,6.00,6.50,7.00,7.50,8.00的電聚合溶液中進(jìn)行聚合膜電化學(xué)制備試驗,結(jié)果表明:當(dāng)聚合底液的pH為7.00時,響應(yīng)電流最大,見圖3。因此,試驗選擇聚合底液的pH為7.00。

圖3 聚合底液酸度對分子印跡聚合物的影響Fig. 3 Effects of acidity of the polymerization base solution on the molecularly imprinted polymer

2．6 洗脫溶劑和洗脫時間的選擇

試驗分別采用乙醇、水、甲醇-乙酸(9+1)混合液、乙腈-乙酸(9+1)混合液和甲醇-乙腈-乙酸(4+3+3)混合液洗脫模板。結(jié)果表明:甲醇-乙酸(9+1)溶液去除模板的效率最高。因為賽諾嗎嗪易溶于甲醇,加入乙酸可以使印跡膜發(fā)生溶脹反應(yīng),從而有利于印跡分子的洗脫,而其他萃取劑只能去除部分模板。試驗發(fā)現(xiàn),在恒溫磁力攪拌器慢速攪拌條件下,用甲醇-乙酸(9+1)混合液10 mL清洗印跡電極6 min,即可將印跡分子徹底洗脫出來,取出電極后用甲醇沖洗電極表面殘留的乙酸。

2．7 印跡傳感器的DPV響應(yīng)

分別將印跡電極置于6.0×10-9,6.0×10-8,6.0×10-7,6.0×10-6,3.0×10-5,6.0×10-5,1.0×10-4,3.0×10-4,6.0×10-4mol·L-1的賽諾嗎嗪溶液中,靜置2 min,取出自然晾干后放入測試背景溶液,利用差分脈沖伏安法進(jìn)行測試,見圖4。記錄峰電流的變化,得到電流的變化(y)與賽諾嗎嗪濃度(x)的線性回歸方程為y=0.304 3x+3.611,相關(guān)系數(shù)為0.998 5。

圖4 傳感器的差分脈沖伏安圖Fig. 4 Differential pulse valtammograms of the sensor

以3s/k(s為DPV峰電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計算得該傳感器的檢出限為1.0×10-9mol·L-1。

2．8 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

采用DPV分別對相同濃度的賽諾嗎嗪、三聚氰胺和三聚氰酸進(jìn)行檢測。試驗發(fā)現(xiàn)傳感器對三聚氰酸和三聚氰胺基本沒有電流響應(yīng),說明該傳感器對賽諾嗎嗪表現(xiàn)出良好的特異選擇性。

將使用過的傳感器在洗脫劑中超聲清洗5 min,依次用甲醇和水淋洗過后可使傳感器基本恢復(fù)到響應(yīng)前的狀態(tài)。分別檢測6.0×10-5mol·L-1賽諾嗎嗪溶液,平行測定5次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%,說明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2．9 樣品分析

將最佳條件下制備的印跡電極置于樣品溶液中靜置2 min,取出自然晾干。采用DPV進(jìn)行定量測定,峰電流基本沒有變化(<5%),說明樣品中無賽諾嗎嗪檢出。對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n=5)Tab. 1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

本工作以賽諾嗎嗪為印跡分子,鄰苯二胺為功能單體,采用電聚合的方法在金電極表面制得了具有良好性能的賽諾嗎嗪分子印跡電化學(xué)傳感器,也可為檢測其他小分子物質(zhì)提供一種參考方法。

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