孔德倉，楊 柳，曹 明，龐曉明*，王愛華

棗(Ziziphus jujuba Mill.)原產(chǎn)我國，具有悠久的栽培歷史，同時也是我國第一大干果樹種［1］。由于花小且棗花為蟲媒花，棗的花粉收集存在著較大的困難，影響棗的人工雜交的成功率。揭示棗花粉萌發(fā)率的品種差異和不同時期的差異，對提高棗的花粉收集效率具有重要意義。張俊娥［2］以29個品種為材料，發(fā)現(xiàn)棗品種花粉育性在初花期和盛花期無明顯差異。而劉玲等［3］對比20個棗品種后發(fā)現(xiàn)，棗不同品種在同一時期的花粉萌發(fā)率存在著顯著的差異;另外，‘蘋果棗’和‘冬棗’的花粉量和花粉萌發(fā)率自5月底(初花期)開始花粉量總體呈上升趨勢，在6月中下旬(盛花期)達(dá)到最高水平。但至今還沒有針對同一時期，處于不同發(fā)育狀態(tài)的棗花粉萌發(fā)率的對比研究報道。因此，筆者以‘京39’和‘無核小棗’2個優(yōu)良品種為材料，對不同開花時期的花粉萌發(fā)率進(jìn)行對比，以期探索合適的花粉采集時期，為棗樹的人工雜交育種工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試品種分別是‘京39’和‘無核小棗’，取自河北省滄縣國家棗樹良種基地。2017年5月底6月初，自田間采集各品種樹冠外圍2～3年生枝健壯棗吊上的蕾黃期和萼片展平期的花于2 mL離心管，加硅膠，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。蕾黃期花朵小心地用鑷子撥開花瓣，取出完整花藥，按朵計量，分?jǐn)傆谂囵B(yǎng)皿上，使其在室溫下自然晾干［4］。

1.2 方法

采用2種方法進(jìn)行花粉萌發(fā)率的測定:

1.2.1 離體培養(yǎng)法 具體方法參見文獻(xiàn)［5］。根據(jù)張學(xué)英［6］、林敏娟［4］等的研究，較合適的培養(yǎng)基配比為:質(zhì)量濃度分別為硼酸100 mg/L，蔗糖150 g/L，瓊脂10 g/L。將不同時期的花粉散播于涂有薄層培養(yǎng)基的載玻片上，蓋上蓋玻片，將其放置在墊有兩層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于28℃烘箱內(nèi)暗培養(yǎng)24 h。每個處理10次重復(fù)，每個載玻片上取5個視野進(jìn)行觀察。

1.2.2 紅四氮唑(TTC)染色法 TTC染色法是利用染色劑與花粉間發(fā)生顯色反應(yīng)，最終呈現(xiàn)深紅色和中紅色的是有活力的花粉，統(tǒng)計有活力花粉的百分率。首先在載玻片上滴加1～2滴TTC溶液，取晾干的蕾黃期的充分成熟、飽滿、未開裂花藥播撒在溶液上，蓋上蓋玻片，用鑷子柄均勻敲擊蓋玻片，使花粉充分散出;將萼片展平期的花粉在滴有TTC溶液的載玻片上均勻蘸濕，蓋上蓋玻片，將其放置在35℃的烘箱內(nèi)暗培養(yǎng)20 min，每個處理10次重復(fù)，每次鏡檢5個視野，取平均值代表每個處理的花粉活力值。TTC溶液的配置具體見文獻(xiàn)［7］。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

(1)將各處理組合所得花粉萌發(fā)率的值進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

(2)用EXCEL和SPSS分別進(jìn)行可重復(fù)方差分析和相關(guān)性分析，通過P值和F統(tǒng)計量、F臨界值判斷各因素以及交互效應(yīng)的差異顯著水平和相關(guān)程度。

(3)利用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，用標(biāo)記字母法表示多重比較結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

方差分析結(jié)果表明，2種不同的測定方法下，棗品種和花發(fā)育時期這2個因素的不同水平對花粉萌發(fā)率均有顯著影響(表1和表2)。在萼片展平期不同測定方法對不同棗花粉萌發(fā)存在差異(圖1)，離體培養(yǎng)法測定下，‘無核小棗’的花粉萌發(fā)率約為50.0%，‘京39’的花粉萌發(fā)率約為22.2%;TTC染色法測定下，‘無核小棗’的花粉萌發(fā)率約為30.0%，‘京39’的花粉萌發(fā)率約為37.5%。

表1 TTC染色法花粉萌發(fā)率方差分析

表2 離體培養(yǎng)法花粉萌發(fā)率方差分析

注:(1)‘京39’TTC染色法的花粉萌發(fā)，(2)‘無核小棗’TTC染色法的花粉萌發(fā)，(3)‘京39’離體培養(yǎng)法的花粉萌發(fā)，(4)‘無核小棗’離體培養(yǎng)法的花粉萌發(fā)。

多重比較可知，就花發(fā)育時期的花粉活力而言，‘京39’在蕾黃期差異顯著，萼片展平期差異不顯著;‘無核小棗’在蕾黃期差異不顯著，在萼片展平期差異顯著(表3和表4)。此外，相關(guān)分析結(jié)果表明，‘無核小棗’的2個不同花發(fā)育時期顯著相關(guān)(R=0.69)。而‘京39’兩個不同采集時期呈負(fù)相關(guān)(R=－0.50)。因此，在雜交育種和研究花粉萌發(fā)特性的時候，應(yīng)該考慮花粉的時期在不同品種中可能存在的差異，有利于提高育種效率。

表3 花粉萌發(fā)率的LSD多重比較結(jié)果

表4 不同品種不同時期的花粉萌發(fā)率比較

3 結(jié)論與討論

‘無核小棗’和‘京39’2個棗品種間的花粉萌發(fā)率差異顯著，說明不同品種其花粉特性是不一樣的，與劉玲等［3］的研究結(jié)果一致，這可能與不同棗品種自身攜帶的遺傳信息不同相關(guān)?！疅o核小棗’花粉萌發(fā)率高于‘京39’，是較好的花粉親本。花粉的不同發(fā)育時期對花粉萌發(fā)率具有顯著影響，兩個品種在不同的時期其相關(guān)性存在較大差異。由此可見，花粉的采集時間是一個重要的因素，需要我們著重考慮。

在花粉萌發(fā)率的兩種測定方法中，離體培養(yǎng)法較好，結(jié)果穩(wěn)定性高。而TTC染色法測量結(jié)果普遍高于離體培養(yǎng)法，且差異較大，這和前人研究結(jié)果一致［2，8］，這個可能是由于染色法受到花粉的代謝情況或者花粉壁厚度的影響［9］。所以結(jié)果并不能較真實(shí)而準(zhǔn)確的反映花粉的萌發(fā)率，只能作為粗略的估計。在離體培養(yǎng)法中，培養(yǎng)基是能否準(zhǔn)確測定花粉萌發(fā)率的關(guān)鍵。劉玲［10］和王玖瑞［5］等實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基質(zhì)量濃度均為瓊脂5 g/L，蔗糖150 g/L。而本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基配置中蔗糖的質(zhì)量濃度相同，但瓊脂為10 g/L，另外加了100 mg/L的硼酸。陳文濤等［11］研究表明，適宜的硼酸濃度對于棗花粉萌發(fā)率和花粉管的生長具有顯著的促進(jìn)作用。這個可能是測得花粉萌發(fā)率結(jié)果偏高的原因。此外，即使相同的品種在同一時期，花粉萌發(fā)力也會因?yàn)榄h(huán)境條件，表現(xiàn)出較大差異，如‘京39’在蕾黃期大的花粉，在培養(yǎng)基和TTC染色液中萌發(fā)率大不相同。這個現(xiàn)象啟示我們，要對不同棗品種的特點(diǎn)有一個充分了解的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行花粉育性工作，提高工作的效率。

棗花粉的萌發(fā)率不僅和品種和花期有關(guān)，也和柱頭部位有關(guān)［9］?；ǚ鄣拿劝l(fā)率普遍偏低［6，9，12，13］，本次研究的棗花粉萌發(fā)率比前人研究得到的略高，這可能還與采集的時間以及棗樹在不同區(qū)域生長的差異有關(guān)。

在‘無核小棗’花粉活力研究方面，有過相關(guān)報道。劉玲等［3］利用離體培養(yǎng)法測得初花期‘無核小棗’的花粉萌發(fā)率為2.85%。吳碩等［9］的研究結(jié)果表明，在蕾黃期的‘無核小棗’花粉萌發(fā)率為39.05%。本次研究獲得的‘無核小棗’花粉萌發(fā)率的結(jié)果稍有不同，可能與不同的無核品系和培養(yǎng)基不同等有關(guān)。

［1］ 劉孟軍.中國棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告1949-2007［M］.北京:中國林業(yè)出版社，2008:24.

［2］ 張俊娥.中國棗品種資源花粉生物學(xué)研究［D］.太谷:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

［3］ 劉玲，王玖瑞，劉孟軍，等.棗不同品種花粉量和花粉萌發(fā)率的研究［J］.植物遺傳資源學(xué)報，2006，7(3):338-341.

［4］ 林敏娟，陳功明，王振磊，等.棗不同品種花粉量及花粉萌發(fā)特性的研究［J］.塔里木大學(xué)學(xué)報，2014，26(1):105-108.

［5］ 王玖瑞，劉孟軍，梁海永.棗樹單花不同開放階段花粉萌發(fā)率和內(nèi)源激素的變化［J］.園藝學(xué)報，2005，32(4):677-679.

［6］ 張學(xué)英，于川江，郭振懷，等.棗不同品種花粉粒萌發(fā)和花粉管生長的研究［C］//河北省果樹學(xué)會.河北省果樹學(xué)會第十三屆學(xué)術(shù)年會論文集.石家莊:河北果樹編輯部，1995:5.

［7］ 王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等.花粉的保存及其生活力測定［J］.植物學(xué)通報，2002，19(3):365-373.

［8］ 李穎岳，續(xù)九如，史良，等.臺灣青棗不同品種花粉萌發(fā)和生活力測定［J］.果樹學(xué)報，2005，22(6):728-730.

［9］ 吳碩，賈彥麗，智福軍，等.18個棗品種花粉數(shù)量與萌發(fā)率的研究［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，21(1):42-45.

［10］ 劉玲.棗雄性不育種質(zhì)篩選及其不育機(jī)理研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［11］ 陳文濤，袁德義，張日清，等.硼及植物生長調(diào)節(jié)劑對棗花粉萌發(fā)的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35(3):496-501.

［12］ 王堯.棗授粉生物學(xué)研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［13］ 李守勇.不同產(chǎn)地冬棗品質(zhì)特性及其遺傳變異研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2004.