王龍，李黎貝，馬啟峰，耿洪偉，陳全家，曲延英，范術(shù)麗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽 455000)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病是以大麗輪枝菌浸染為主的維管束病害，對棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)等農(nóng)藝性狀有很大影響。1914年在美國發(fā)現(xiàn)棉花黃萎病，隨后在澳大利亞等主要產(chǎn)棉國也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了棉花黃萎病[1]。1935年，棉花黃萎病由美國傳入中國，20世紀(jì)90年代，棉花黃萎病在我國主要產(chǎn)棉區(qū)逐年蔓延，其中西北內(nèi)陸植棉區(qū)、黃河流域植棉區(qū)、長江流域植棉區(qū)等地的范圍不斷擴(kuò)大。棉花黃萎病成為阻礙棉花實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等育種目標(biāo)的主要因素，已成為提高棉花的產(chǎn)量、纖維品質(zhì)的主要障礙[2]。【前人研究進(jìn)展】有研究認(rèn)為，棉花黃萎病抗性由單基因控制的質(zhì)量性狀[3-5]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，棉花黃萎病抗性由多個微效基因共同控制的數(shù)量性狀[6-9]。產(chǎn)生兩種結(jié)論的原因，可能是研究人員所選不同供試材料而造成的，并且棉花抗黃萎病性狀受環(huán)境影響較大。棉花黃萎病抗性QTL(Quantitative trait locus)定位在國外的相關(guān)研究較少，國內(nèi)相關(guān)研究較多；SSR分子標(biāo)記已成為研究黃萎病的主要技術(shù)，研究群體由先前的陸陸群體轉(zhuǎn)變?yōu)楹ｊ懭后w，因為后者的多態(tài)性較好。作圖群體也由初級的F2、BC1群體向更適合精細(xì)定位的RIL(Recombinant inbred lines)、NIL(Near isogenic lines)等群體過度。高玉千等[10]利用海陸組合的F2群體、通過RAPD(Random amplified polymorphic DNA)和SSR(Simple sequence repeat)標(biāo)記找到2個主效QTLs和一個微效QTL；王紅梅等[11]利用F2/F2∶3群體定位到6個與黃萎病抗性相關(guān)的QTLs；昝偉等[12]研究結(jié)果表明：在F2群體中，通過SSR分子標(biāo)記檢測到與棉花黃萎病抗性相關(guān)的2個主效QTLs，并且定位到第一連鎖群上；李磊[13]研究結(jié)果表明：在構(gòu)建的兩個F2群體上進(jìn)行定位，找到6個與黃萎病抗性相關(guān)的QTLs，其中包括3個抗病QTLs，3個感病QTLs。目前，關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)成為一項技術(shù)體系比較完善、相對比較成熟的研究功能基因定位的一種方法。關(guān)聯(lián)分析要比常規(guī)QTL定位技術(shù)優(yōu)勢更明顯，(1)以自然群體為材料，無需構(gòu)建專門的作圖群體，而QTL作圖至少需要花費(fèi)2年以上的時間來完成群體的構(gòu)建；(2)可實現(xiàn)對其作圖群體(自然群體)一個基因座上所有等位基因的考察，而絕大部分QTL作圖所利用的群體是兩親本雜交、重組自交后代，每一基因座一般只能涉及兩個等位基因；(3)定位精度高，可以達(dá)到單基因水平。關(guān)聯(lián)分析的方法在玉米、大麥、大豆、小麥等多個作物的一些功能基因定位研究中得到廣泛應(yīng)用[14-24]。近年來，通過關(guān)聯(lián)分析定位與棉花農(nóng)藝性狀相關(guān)功能基因的報道已有一些。Abdurakhmonov[18-19]利用285份陸地棉材料構(gòu)建自然群體，并結(jié)合使用202個SSR標(biāo)記，研究了該群體纖維品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果表明：與纖維長度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有23個，與纖維比強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有19個。賀道華等[20]用92份栽培棉構(gòu)建自然群體，對其進(jìn)行掃描，并結(jié)合均勻分布于26條染色體上的132個 SSR標(biāo)記，獲得21個與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)的SSR位點(diǎn)。梁冰等[21]構(gòu)建68份陸地棉材料為自然群體，以160對SSR引物對該群體進(jìn)行基因型檢測，發(fā)現(xiàn)了與棉花纖維品質(zhì)等主要農(nóng)藝性狀相關(guān)的SSR位點(diǎn)。Kantartzi等[22]以56份亞洲棉品種構(gòu)建自然群體，通過98個SSR標(biāo)記對該研究群體的纖維品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果表明：與纖維長度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記3個，與纖維比強(qiáng)度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個。Wang等[23]以55個海島棉品系構(gòu)建自然群體，使用258個SRAP標(biāo)記、170個SSR標(biāo)記與該研究群體的產(chǎn)量、纖維品質(zhì)等性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析， 研究結(jié)果表明，與產(chǎn)量性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有26個，與纖維品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有46個?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，關(guān)于研究棉花黃萎病抗性方面的關(guān)聯(lián)分析報道較少。Zhao等[24]構(gòu)建自然群體以158個陸地棉材料為研究對象，利用與棉花抗黃萎病性狀相關(guān)的212個SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果表明，與黃萎病抗性相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)有42個，其中新發(fā)現(xiàn)的有32個標(biāo)記位點(diǎn)。郭志軍等[25]構(gòu)建自然群體以178份材料為研究對象，利用74對SSR引物與該群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測到位于NAU1514- NAU2754區(qū)間內(nèi)與棉花抗黃萎病性狀相關(guān)的1個QTL。【擬解決的關(guān)鍵問題】以186份陸地棉材料組成的自然群體為研究對象，對其抗黃萎病性狀進(jìn)行4個播期的表型鑒定，利用篩選出的140個SSR標(biāo)記進(jìn)行基因分型，分析群體結(jié)構(gòu)和品種間親緣關(guān)系，利用TASSEL4.0軟件的廣義線性模型(General line model，GLM)(P<0.001)和混合線性模型(Mixed linear model，MLM)(P<0.01)軟件，對棉花農(nóng)藝性狀和標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘棉花農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，為棉花抗黃萎病分子標(biāo)記輔助選擇育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗以186份陸地棉材料構(gòu)建自然群體。表1

表1 186份陸地棉材料來源
Table 1 The origin regions of 186 upland cotton accessions

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所試驗基地位于安陽市白璧鎮(zhèn)，將供試材料種植在試驗基地，試驗設(shè)計為2年(2015和2016年)、2個不同播期(春播和夏播)一共4個環(huán)境的種植模式。186份供試材料播種期分別標(biāo)記為 M(2015年4月26日)、 W(2015年5月23日) 、 Y(2016年5月1日)和 Z(2016年5月25日)，一共4個環(huán)境。采用隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)置3次重復(fù)，行長6 m，行距0.7 m，株距0.3 m，常規(guī)大田農(nóng)事管理。

在棉花黃萎病發(fā)病高峰期進(jìn)行黃萎病表型病級鑒定，分別為2015年8月1日、2016年8月2日進(jìn)行，試驗地棉花黃萎病的表型病級鑒定采用5級制的劃分方法[26]。表2

表2 棉花葉片黃萎病級劃分標(biāo)準(zhǔn)
Table 2 The classification standard of cotton leaf verticillium wilt

1.2 方 法

1.2.1 SSR標(biāo)記

以棉花幼苗八葉期葉片為試驗材料，提取DNA參考宋國立等[27]改進(jìn)的CTAB法。選取覆蓋陸地棉26條染色體的140個SSR標(biāo)記位點(diǎn)，對186份供試材料進(jìn)行基因型檢測，在該群體中檢測到355個等位變異。所用SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為10 μL： 包括模板DNA 30 ng，10×PCR Buffer 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，10 mmol/L SSR引物2 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.1μL，加ddH2O補(bǔ)足至10 μL。試驗所用的Taq聚合酶和dNTP均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；30個循環(huán)(94℃變性30 s，58℃退火溫度45 s，延伸45 s)；72℃延伸10 min；10℃保存。使用濃度為8的聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，待跑完電泳以后，銀染方法依據(jù)張軍等[28]的方法進(jìn)行并照相保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

帶型統(tǒng)計采用0、1統(tǒng)計法，在同一遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為‘？’。根據(jù)DNA Marker結(jié)合Quantity One軟件的方法，以此來判斷多態(tài)性條帶的大小。

利用Power Maker V3.25軟件計算引物的多態(tài)性信息含量(Polymorphism information Content，PIC)[29]。

參照Henderson[30]提出的BLUP(Best Linear Unbiased Prediction)法，通過R語言中的“l(fā)me4”包進(jìn)行四個環(huán)境下的育種值計算。

對186份陸地棉材料構(gòu)建的自然群體基于數(shù)學(xué)模型進(jìn)行的類群劃分，通過使用 STRUCTURE2.3.4分析軟件[31]，進(jìn)一步對該群體的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行估算，并計算得出的186份研究群體中每個個體所相應(yīng)的Q值。使用該軟件程序設(shè)定K為1至10，將MCMC(Markov Chain Monte Carlo)開始時的不作數(shù)迭代(Length of burn- in period)設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，參照文自翔等[32]的設(shè)置對程序進(jìn)行處理，并進(jìn)行10次重復(fù)計算[24]。通過SAS運(yùn)算出最大似然值，根據(jù)運(yùn)行結(jié)果確定合適的K值，若似然值LnPD隨K值的增大而持續(xù)增大，則可參照Evanno等[33]的方法根據(jù)ΔK確定合適的K值。

通過使用TASSEL4.0軟件模型，利用廣義線性模型(General linear model，Q模型)是以個體Q值作為協(xié)變量，而混合線性模型(Mixed liner model，Q+K模型)是以Q值親緣關(guān)系(Kinship)作為協(xié)變量，運(yùn)用兩種模型對4個環(huán)境下抗黃萎病表型數(shù)據(jù)與SSR位點(diǎn)進(jìn)行回歸分析。利用SPAGeDi-1.3[34]軟件對親緣關(guān)系進(jìn)行計算。通過運(yùn)用Bresghellohe和Sorrells等[35]提出的“無效等位變異”方法，分析了棉花抗黃萎病表型效應(yīng)值情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間鑒定

供試材料種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所試驗基地，在棉花黃萎病發(fā)病高峰期進(jìn)行黃萎病表型鑒定，分別為2015年8月1日、2016年8月2日進(jìn)行，黃萎病的表型病級鑒定采用馬存[26]提出的5級制劃分方法。圖1

圖1 田間棉花葉片病級劃分標(biāo)準(zhǔn)
Fig.1 The standard phenotype of cotton leaf in classifying verticillium wilt resistance in the field

2.2 陸地棉材料的群體結(jié)構(gòu)

研究186份供材料的群體結(jié)構(gòu)，通過使用Structure version2.3.4軟件對其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：LnP(D)值隨K值的增大而增大，發(fā)現(xiàn)沒有一個拐點(diǎn)，因此，無法確定該研究群體結(jié)構(gòu)的K值；隨后采用通過ΔK法來確定群體結(jié)構(gòu)的K值[33]。當(dāng)K=2時，平均似然值的斜率改變，將186份研究材料分成2個亞群。一個亞群有96份材料，占總數(shù)的51.60% ；另一亞群有90份材料，占總數(shù)的48.40%。

利用Structure軟件，計算出當(dāng)K=2時，可將186份研究材料劃分為2個亞群，得到對應(yīng)的Q值，為關(guān)聯(lián)分析協(xié)變量的分析提供依據(jù)。圖2

圖2 186份陸地棉材料的群體結(jié)構(gòu)
Fig.2 The population structure 186 cultivated upland cotton

2.3 單個環(huán)境下關(guān)聯(lián)

通過使用140對SSR引物做分子標(biāo)記，在該群體中檢測到355個等位變異，平均每對引物的等位變異為2.54，其中平均值為0.76，引物多態(tài)性信息含量變化范圍：0.50～0.99；將186份供試材料兩年、兩個播期共四個環(huán)境的棉花黃萎病指數(shù)，結(jié)合140個SSR標(biāo)記，通過GLM(P<0.001)模型和MLM(P<0.01)模型同時進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在檢測到的355個位點(diǎn)中，同時能在兩個模型下檢測到且與黃萎病抗性相關(guān)的位點(diǎn)有22個。有3個標(biāo)記位點(diǎn)與M播期相關(guān)聯(lián)，有6個標(biāo)記位點(diǎn)與W播期相關(guān)聯(lián)，有3個標(biāo)記位點(diǎn)與Y播期相關(guān)聯(lián)，有11個標(biāo)記位點(diǎn)與Z播期相關(guān)聯(lián)。其中，NAU998和CGR5258兩個位點(diǎn)不僅與Y播期、Z播期的黃萎病病指相關(guān)聯(lián)，還分別于M播期、W播期的黃萎病病指相關(guān)聯(lián)。NAU998和CGR5258兩個位點(diǎn)表型變異解釋率分別為5.53%和12.07%。表3

表3 陸地棉抗黃萎病性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記的貢獻(xiàn)率及P值

2.4 多點(diǎn)環(huán)境下關(guān)聯(lián)

將兩年、兩個播期下共四個環(huán)境的表型數(shù)據(jù)構(gòu)建BLUP(Best linear unbiased prediction)模型，同時進(jìn)行該模型與單個環(huán)境下的GLM模型以及MLM模型下的關(guān)聯(lián)分析。研究表明，在GLM模型下關(guān)聯(lián)到14個位點(diǎn)，在MLM模型下關(guān)聯(lián)到3個位點(diǎn)，最終發(fā)現(xiàn)兩個位點(diǎn)同時存在于2個環(huán)境以上，分別為NAU998和CGR5258，該結(jié)果與單個環(huán)境下關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果相吻合，說明這兩個標(biāo)記可能在棉花黃萎病抗性的分子鑒定方面有較好的效果，對棉花分子標(biāo)記輔助育種有一定的應(yīng)用價值。圖3

圖3 關(guān)聯(lián)分析流程
Fig.3 The flow chart of association analysis

2.5 抗黃萎病性狀表型效應(yīng)值

與棉花抗黃萎病性狀相關(guān)的兩個位點(diǎn)，分別為NAU998和CGR5258。依據(jù)文自翔[32]提出的“無效等位變異”判斷方法，得出SSR位點(diǎn)對表型效應(yīng)的影響。位點(diǎn)NAU998在四個環(huán)境下的表型效應(yīng)分別為0.03/0.08/-0.005/0.033，增效效應(yīng)更為顯著，說明這個位點(diǎn)的存在有利于提高棉花黃萎病的抗病性；位點(diǎn)CGR5258在四個環(huán)境下的表型效應(yīng)都表現(xiàn)為-0.001/-0.001/-0.001/-0.001，均為減效效應(yīng)，這個位點(diǎn)的存在會使棉花黃萎病的感病性提高。在育種過程中，可選擇具有NAU998位點(diǎn)同時缺失CGR5258位點(diǎn)的中間材料，以提高選育材料的黃萎病抗性。表4

表4 抗黃萎病性狀的表型效應(yīng)
Table 4 Phenotypic effects of resistance of Verticillum wilt

3 討 論

目前，有關(guān)棉花關(guān)聯(lián)分析的研究大多數(shù)于集中于主要農(nóng)藝性狀等方面，然而關(guān)于棉花抗黃萎病性狀的報道仍然較少[21,25]。陸地棉黃萎病抗性的遺傳方式為數(shù)量性狀，由多個微效基因共同控制，且致病菌有變化快的特點(diǎn)，而且棉田的發(fā)病易受濕度和溫度等條件的影響。研究利用兩年、兩個播期的四環(huán)境數(shù)據(jù)，發(fā)掘與陸地棉抗黃萎病性狀相關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，為培育棉花抗黃萎病新品種提供可靠的分子標(biāo)記。在檢測到與抗黃萎病性狀相關(guān)聯(lián)的22個位點(diǎn)中，兩個環(huán)境中同時被關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)NAU998和CGR5258，并且在前人研究結(jié)果中尚未出現(xiàn)。因此，可通過構(gòu)建分離群體對這2個位點(diǎn)進(jìn)行驗證，并應(yīng)用于改良棉花抗黃萎病育種實踐。

研究在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析過程中運(yùn)用了GLM和MLM兩種模型，GLM通過群體結(jié)構(gòu)Q值作協(xié)變量；而使用MLM模型在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時，不但使用了Q值作協(xié)變量，還引用了親緣關(guān)系K；因此，在一定程度上能降低關(guān)聯(lián)結(jié)果的假陽性，使結(jié)果更為準(zhǔn)確，無論是單個環(huán)境下的關(guān)聯(lián)結(jié)果還是多個環(huán)境下的關(guān)聯(lián)結(jié)果，MLM模型所關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)始終少于GLM模型。研究在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時使用了Henderson提出了BLUP法，即最佳線性無偏預(yù)測法，這種方法最初運(yùn)用于動物育種當(dāng)中，而20世紀(jì)80年代中期以后，BLUP方法開始應(yīng)用于牧草、農(nóng)作物及園林植物的遺傳改良研究，在關(guān)聯(lián)分析研究中用來構(gòu)建模型處理多年多點(diǎn)的數(shù)據(jù)，可進(jìn)一步消除多年多點(diǎn)對數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)結(jié)果的影響，且已在大豆，玉米等[36-38]的關(guān)聯(lián)分析研究中得到應(yīng)用。

結(jié)合前人對棉花黃萎病抗性QTL定位的研究結(jié)果，利用e-PCR程序[39]，與前人研究結(jié)果相比，NAU998和CGR5258不能比對到Zhang等[40]構(gòu)建的連鎖群中。但是在最近的研究中，分別與抗病性QTLs位點(diǎn)qDI-C3-3的近距離標(biāo)記MUSS59相近，與QTLs位點(diǎn)qDI-C15-3的近距離標(biāo)記NAU3337相近[41]，且分別位于NAU3775與BNL0663和NAU3684與BNL3971之間[42]。出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于定位的材料不同而導(dǎo)致的，NAU998和CGR5258標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，將對棉花抗黃萎病基因的克隆和功能驗證奠定堅實的基礎(chǔ)[43]。

4 結(jié) 論

將四個環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行BLUP之后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，無論是GLM模型還是MLM模型所關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)都少于單個環(huán)境下所關(guān)聯(lián)到的位點(diǎn)，BLUP的精準(zhǔn)性，研究得到的NAU998和CGR5258兩個位點(diǎn)具有較好的可靠性。

近年來，有關(guān)棉花關(guān)聯(lián)分析主要以SSR標(biāo)記居多，傳統(tǒng)的研究提供基因組多態(tài)性信息相對較少，未來的發(fā)展更趨向于通過基于簡化基因組測序技術(shù)和重測序技術(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析[44-46]。研究通過使用140對SSR做分子標(biāo)記，檢測到355個等位變異，進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，標(biāo)記數(shù)量需要進(jìn)一步加大，研究結(jié)果只是粗略意義上的全基因組關(guān)聯(lián)分析， 因此，還需增加標(biāo)記的密度，可以結(jié)合SNP標(biāo)記，開展更加詳實的棉花抗黃萎病GWAS研究；第二，要對已發(fā)掘的SSR位點(diǎn)進(jìn)一步功能驗證，通過構(gòu)建分離群體進(jìn)行標(biāo)記與性狀的相關(guān)性分析，可進(jìn)行QTL分析，以此來提高相應(yīng)位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。通過對棉花抗黃萎病性狀的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘了一些與黃萎病抗性相關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，為陸地棉抗黃萎病材料進(jìn)行全基因組掃描提供了更多的分子標(biāo)記。