周金慧 楊術(shù)鵬 李熠│文

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）

前言

我國是世界上蜂蜜產(chǎn)量和出口量均處于第一位的國家，但是蜂蜜質(zhì)量不容樂觀，仍然被國際同行認(rèn)為是“價(jià)低質(zhì)次”產(chǎn)品。而蜂蜜摻假是當(dāng)前影響我國養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)健康發(fā)展的最大障礙。總體而言，我國蜂蜜年產(chǎn)量不足40萬噸，但是市場的消費(fèi)量高達(dá)70萬噸以上，其中包括出口10余萬噸。這些數(shù)據(jù)反映了我國蜂蜜摻假的嚴(yán)重性。由于蜂蜜摻假鑒別技術(shù)受我國蜂蜜種類繁雜、蜂蜜摻假類型和工藝不斷變化的影響，一直未能定型，導(dǎo)致監(jiān)管部門無法有效地識別摻假蜂蜜，使摻假蜂蜜在市場泛濫[1]。

一、國內(nèi)外蜂蜜產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)對比分析

我國現(xiàn)行有效的蜂蜜產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》（GB 14963-2011）和《蜂蜜》（GH/T 18796-2012）[2-3]。其中GB 14963-2011是衛(wèi)生部制定的需強(qiáng)制執(zhí)行的國家標(biāo)準(zhǔn)，側(cè)重于理化指標(biāo)和安全指標(biāo)，對提高我國的蜂蜜安全性起到了至關(guān)重要的作用。但是當(dāng)前我國蜂產(chǎn)品，尤其是蜂蜜面臨著更加嚴(yán)重的摻雜使假問題，但是在該標(biāo)準(zhǔn)中未能就蜂蜜真實(shí)性指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定。因此，中華全國供銷合作總社在該標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上結(jié)合養(yǎng)蜂生產(chǎn)實(shí)際情況制定了新的推薦性的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（GH/T 18796-2012），在該標(biāo)準(zhǔn)中加入與加工和貯藏條件相關(guān)的參數(shù)和碳-4植物糖含量等蜂蜜真實(shí)性指標(biāo)。然而該方法僅對在蜂蜜中加入碳-4植物轉(zhuǎn)化糖（玉米糖漿和甘蔗糖漿）的摻假蜂蜜有效，對摻入碳3植物轉(zhuǎn)化糖（甜菜糖漿、大米糖漿、木薯糖漿和小麥糖漿）是無效的；另外一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法來自蜂蜜中高果糖漿的檢測-薄層色譜法（GB/T 18932.2-2002），該方法通過比較檢測樣品與陰性對照樣品、陽性對照樣品的薄層色譜條帶進(jìn)行定性結(jié)果判定，優(yōu)點(diǎn)是能夠清晰地顯示樣品中是否含有由于摻假導(dǎo)致的未完全轉(zhuǎn)化的寡聚糖，但缺點(diǎn)是檢驗(yàn)員的主觀性太大，容易造成結(jié)果的誤判，此外在檢測甘露蜜和進(jìn)口蜂蜜時(shí)容易出現(xiàn)假陽性，從而導(dǎo)致國內(nèi)外市場上流通著大量的“指標(biāo)蜜”，即各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)的摻假蜂蜜。

目前國際上針對蜂蜜的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)主要有歐盟的2001/110/EC[4]以及2001年修改后國際食品法典委員會的Codex standard for honey[5-6]。世界各國均主要依據(jù)這兩個(gè)條例為基礎(chǔ)，在本國實(shí)際情況基礎(chǔ)上分別建立各自國家的蜂蜜質(zhì)量安全法律法規(guī)，包括加拿大[7]，澳大利亞和新西蘭[8]和韓國[9]、希臘[10]、印度[11]、巴西[12]、塞浦路斯[13]、克羅地亞[14]、哥倫比亞[15]和中國[2-3]等。

水分含量高低是評價(jià)蜂蜜成熟度的主要標(biāo)志。加拿大依據(jù)水分含量對蜂蜜等級進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定，其中一等品水分含量<17.8%, 二等品水分含量<18.6%，三等品水分含量<20%[16]。德國、阿根廷、捷克和斯洛文尼亞等國規(guī)定蜂蜜中水分含量必須低于18%[17]。我國現(xiàn)行蜂蜜安全標(biāo)準(zhǔn)GB 14963-2011沒有設(shè)定水分指標(biāo)，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796 2012中水分限量按等級和類別劃分。一等品中荔枝等5種蜂蜜23%，其他26%，二等品中荔枝等5種蜂蜜20%，其他24%。相對于其他國家，我國水分含量要求普遍偏低，因此設(shè)定了7項(xiàng)包括嗜滲酵母在內(nèi)的微生物指標(biāo)的限量要求，而在其他各國未做要求。

羥甲基糠醛是評價(jià)蜂蜜是否高溫加工和儲存時(shí)間過長的主要指標(biāo)。德國、捷克、斯洛文尼亞、波蘭和日本分別規(guī)定蜂蜜中羥甲基糠醛含量不得超過10～35mg/kg，哥倫比亞作為熱帶國家將糠醛含量由原來的60mg/kg改為80 mg/kg。但是部分國家要求更低，如韓國和印度要求均超過了80mg/kg[18]。我國要求不得超過40mg/kg，針對蜂蜜中羥甲基糠醛的要求與其他國家相比處于中等水平。

酶值是衡量蜂蜜新鮮度和成熟度的指標(biāo)之一。波蘭要求蜂蜜酶值大于8.3，而俄羅斯是唯一1個(gè)要求每1個(gè)蜜種設(shè)定1個(gè)酶值的國家，其中洋槐>5，椴樹蜜>11，向日葵蜜>15，蕎麥米>18，而其他蜜種>7，同時(shí)如果酶值低于3的蜂蜜其糠醛含量必須低于15mg/kg[19]。而我國的要求相對較低，荔枝蜂蜜、龍眼蜂蜜、柑橘蜂蜜、鵝掌柴蜂蜜這4種蜂蜜酶值≥2，其他蜜種的蜂蜜≥4。

葡萄糖和果糖是蜂蜜主要糖類物質(zhì)，同時(shí)也是判斷是否為蜂蜜或成熟蜂蜜的指標(biāo)之一。國內(nèi)和大部分國際蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)中葡萄糖和果糖限量值都是60%～65%，而加拿大、阿根廷、巴西、哥倫比亞、埃塞俄比亞、印度、俄羅斯和塞爾維亞該指標(biāo)設(shè)定為不得低于65%[20]。

世界各個(gè)國家對蜂蜜中污染物限量都有相應(yīng)的規(guī)定。我國設(shè)定了鉛的限量為1.0 mg/kg。對于農(nóng)獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)來說，日本除對少數(shù)農(nóng)獸藥單獨(dú)規(guī)定其限量值外，其余藥物均實(shí)行肯定列表制度，即采用一律標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg。歐盟對于農(nóng)獸藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)主要有主要的法規(guī)有96/2005/EC、149/2008/EC、2377/90/EEC等，包括47項(xiàng)農(nóng)藥殘留，29項(xiàng)獸藥殘留，其中27項(xiàng)為禁用獸藥，其農(nóng)藥最大殘留限量一般在0.01～0.05mg/kg之間[21-22]。我國蜂蜜限量指標(biāo)主要有四環(huán)素族抗生素、8種磺胺類藥物、氟氯苯菊酯、溴螨酯、蠅毒磷、雙甲脒等，其限量值在0.01～0.1mg/kg，其限量值基本與歐盟標(biāo)準(zhǔn)持平或高于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。

二、蜂蜜真實(shí)性檢測技術(shù)指標(biāo)探討

我國蜂群總量高達(dá)900多萬群，其中600多萬群是意大利蜜蜂，主要分布在平原地區(qū)，采用轉(zhuǎn)場方式追花逐蜜生產(chǎn)蜂蜜；另外300萬群為中華蜜蜂，主要分布在我國廣大山區(qū)，一般為定地飼養(yǎng)。意大利蜂蜜的生產(chǎn)能力強(qiáng)，是我國商品蜂蜜主要組成部分。蜂農(nóng)為了充分發(fā)揮意蜂的采集能力，通常會在一定的區(qū)域甚至全國范圍內(nèi)進(jìn)行不斷轉(zhuǎn)場，充分利用不同地域蜜源植物的種類及花期的差異進(jìn)行蜂蜜生產(chǎn)。在生產(chǎn)過程中，蜂農(nóng)通常有意識的生產(chǎn)單花蜜，主要是單花蜜的價(jià)格較高、口感較好，尤其是洋槐蜜、椴樹蜜等。中蜂的生產(chǎn)能力較弱，但善于利用零星蜜源，從而導(dǎo)致生產(chǎn)的中蜂蜜基本上以雜花蜜為主。綜上可知，意大利蜜蜂生產(chǎn)的單花蜜是我國商品蜂蜜最主要的組成部分。如何有效的評價(jià)單花蜜是開展優(yōu)質(zhì)蜂蜜檢測技術(shù)的關(guān)鍵。

1.主要單花蜜參考標(biāo)準(zhǔn)樣本庫的建設(shè)

不同單花蜜中的物質(zhì)種類和含量均存在一定差異，基于此差異，便可以有效建立單花蜜評價(jià)的檢測方法。通常情況下，將目標(biāo)物質(zhì)的含量在其一定范圍內(nèi)視為單花蜜，否則將其視為非其他單花蜜或者雜花蜜。在這種情況下，參考單花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣本庫的構(gòu)建非常關(guān)鍵，如何取樣、儲存和鑒定是樣本庫建設(shè)中需要考慮的關(guān)鍵點(diǎn)。鑒于單一花種蜂蜜參考樣品在不同年份和不同生產(chǎn)區(qū)域之間存在成分差異，我們建議將篩選出的目標(biāo)特征物含量占同品種參考樣品50%以上的樣品視作單一花種優(yōu)質(zhì)蜂蜜。

2.優(yōu)質(zhì)單花蜜品質(zhì)評價(jià)指標(biāo)構(gòu)建

我國主要蜜源植物有油菜、洋槐、荊條、棗花、荔枝、龍眼、椴樹、柑橘、鴨腳木、烏桕、苕子、野壩子、石榴、老瓜頭、棉花、枸杞、五倍子、向日葵、桉樹等。糖類、水分、有機(jī)酸、游離氨基酸、有機(jī)堿、酚酸、黃酮和蛋白質(zhì)等是構(gòu)成蜂蜜的主要物質(zhì)。除去蜂蜜中的糖類、蛋白質(zhì)、水分、無機(jī)物等，蜂蜜還含有小于5%的有機(jī)物質(zhì)，如何識別、鑒定和定量這些有機(jī)物質(zhì)是理解不同單花蜜的關(guān)鍵，也是研究的重點(diǎn)。在蜂蜜中5%的有機(jī)物質(zhì)中，不同單花蜜之間存在一定的相同物質(zhì)，但是其含量往往存在差異[23]。依據(jù)新西蘭初級產(chǎn)業(yè)部的新標(biāo)準(zhǔn)，蜂蜜中4-甲氧基苯乙酮、2-甲氧基苯甲酸、和3-(4-羥基苯基)乳酸)的含量應(yīng)大于1 mg/kg；此外，還規(guī)定3-苯基乳酸大于400mg/kg時(shí)為麥盧卡單花蜜，20～400mg/kg時(shí)為麥盧卡雜花蜜[24]。除了麥盧卡之外，國際上還對其他種類的蜂蜜的鑒定提供了有意義的探索，比如板栗蜂蜜中的犬尿酸應(yīng)大于10mg/kg[25]、柑橘蜜中的咖啡因應(yīng)大于2mg/kg[26]等。上述研究均是基于蜂蜜中固有化學(xué)物質(zhì)的含量用于評價(jià)單花蜜的品質(zhì)，這為我們研究我國的主要單花蜜提供了非常有益的參考。此外，該方式不僅可以評估單花蜜品質(zhì)，也可為不同蜂蜜的混摻和蜂蜜摻假的鑒別提供輔助建議。不同蜂蜜的混摻也是當(dāng)前影響蜂蜜品質(zhì)關(guān)鍵因素之一，油菜、柑橘、向日葵、棉花、烏桕等大宗單花蜜，通常我們很難在市場上見到這些單花蜜，盡管這些蜂蜜的產(chǎn)量很大。究其緣由，主要是這類蜂蜜口感、色澤較差，或者是具有易于發(fā)酵等弊端。這些蜂蜜往往通過混入其他種類的蜂蜜中，采用以次充好的方式，冒充其他優(yōu)質(zhì)單花蜜。除此之外，不同單花蜜中的蛋白質(zhì)含量差異、花粉形態(tài)差異、單糖種類差異等均可為表征單花蜜提供有益的數(shù)據(jù)[27-30]。

盡管我國蜂蜜產(chǎn)量位居全球第一，但是有關(guān)蜂蜜中內(nèi)源性物質(zhì)的研究較為匱乏。至今，我國尚未頒布一種關(guān)于單花蜜的國家或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或方案。鑒于此，本研究團(tuán)隊(duì)采用液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)結(jié)合數(shù)據(jù)分析軟件Compound Discovery 2.0對我國主要單花蜂蜜中內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行了全組分分析，以期獲得各種單花蜜中主要和特征性的化學(xué)物質(zhì)。目前，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)完成了我國20余種主要單花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)的分析和鑒定工作，如油菜蜜中油菜素-1和油菜素-2、棗花蜜中的棗花素-1和棗花素-2、洋槐蜜中的洋槐素-1、洋槐素-2和洋槐素-3、荊條蜜中的荊條素-1和荊條素-2、荔枝蜜中的荔枝素-1和荔枝素-2等。這些已鑒定出來的物質(zhì)在單花蜜中的含量介于1～400ppm，基于其含量的高低可以有效的表征單花蜜的純度和品質(zhì)?？紤]到我國蜜源植物因地理位置、品種和年份的差異，單花蜜中各主要物質(zhì)的含量會存在一定的波動。因此，在制定各單花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)含量閾值時(shí)，需要科學(xué)論證，并不斷更新，使其更科學(xué)合理。通過借鑒麥盧卡蜂蜜的新標(biāo)準(zhǔn)，本研究團(tuán)隊(duì)首先制定了優(yōu)質(zhì)棗花蜜的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定優(yōu)質(zhì)棗花蜜中內(nèi)源性物質(zhì)棗花素-1和棗花素-2的含量應(yīng)該不低于其在棗花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣的中50%（兩者在棗花蜜標(biāo)準(zhǔn)樣中的含量均值分別為25mg/kg和3mg/kg），而介于20%～50%的稱之為棗花蜜的雜花蜜，對于那些內(nèi)源性物質(zhì)小于20%，將其歸為雜花蜜。同樣，此方案也推廣到其他優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)的制定中。此外，不同單花蜜中的蛋白質(zhì)含量差異、花粉形態(tài)差異、單糖種類差異等均可為表征單花蜜提供有益的參考數(shù)據(jù)。在優(yōu)質(zhì)單花蜜制定過程中，不斷增加有關(guān)其他檢測項(xiàng)目，以期制定的優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)更科學(xué)合理。

3.糖漿中特征性物質(zhì)的識別與檢測方法開發(fā)

目前國際上有關(guān)蜂蜜摻假的鑒別技術(shù)主要分為兩種方式，一種是采用靶向分析法，檢測摻入糖漿中的特征性標(biāo)志物，用于表征蜂蜜的真實(shí)性[9,31]；另外一種是近年來新出現(xiàn)的一種非靶向分析，即輪廓分析法，主要是采用核磁共振或者液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜等技術(shù)對蜂蜜中固有的成分進(jìn)行分析[32-33]。就目前有關(guān)蜂蜜摻假檢測機(jī)構(gòu)匯總的結(jié)果來看，目前，任何一種檢測方法均不能夠有效的鑒別蜂蜜摻假，均需要多種蜂蜜摻假方法綜合運(yùn)用，方能有效鑒別摻假蜂蜜。但是多種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用具有耗時(shí)、成本高、低通量等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前蜂蜜摻假的需要。

糖類主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等其他單糖、雙糖甚至多糖組成，其總含量往往大于65%。蜂蜜中混入的糖漿主要是來源于小麥、大米、玉米等作物。糖漿的生產(chǎn)主要是基于淀粉的水解、異構(gòu)化和純化等工藝實(shí)現(xiàn)的。在生產(chǎn)過程中，往往會引入一些異源性的糖類物質(zhì)，那些顯著區(qū)別于蜂蜜中的糖類物質(zhì)便可作為潛在的蜂蜜摻假標(biāo)志物，用于蜂蜜摻假的識別。本研究團(tuán)隊(duì)基于核磁共振和液相串聯(lián)高分辨質(zhì)譜等技術(shù)，在糖漿樣本中篩選出了多個(gè)顯著區(qū)別于蜂蜜中糖類的物質(zhì)，并基于此，建立了蜂蜜中糖漿摻假鑒別液相串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)的方法。通過對120余種蜂蜜摻假盲樣的考核，結(jié)果表明該方法對蜂蜜摻假的準(zhǔn)確率高達(dá)98.3%，顯著高于國內(nèi)同行業(yè)有關(guān)蜂蜜摻假的鑒別水平。本團(tuán)隊(duì)開發(fā)蜂蜜摻假方法簡單高效，這為優(yōu)質(zhì)單花蜜標(biāo)準(zhǔn)制定提供了有效保障，也為凈化國內(nèi)蜂蜜摻假的市場亂象提供了有力的技術(shù)支撐。

三、蜂蜜成熟度檢測技術(shù)

除了真實(shí)性之外，蜂蜜的成熟度技術(shù)指標(biāo)也是行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)，目前除了甘油（丙三醇）和脯氨酸兩個(gè)指標(biāo)外，其他指標(biāo)還不夠成熟，歐盟實(shí)驗(yàn)室對脯氨酸的控制標(biāo)準(zhǔn)是小于等于180mg/kg，南非的蜂蜜標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定脯氨酸含量不低于200mg/kg；在我國由于商品蜂蜜品種較多，不同品種之間含量差異較大，很難形成統(tǒng)一的成熟指標(biāo)，根據(jù)蜜種不同設(shè)定脯氨酸的指標(biāo)更為適宜。甘油（丙三醇）也是評價(jià)蜂蜜質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，因?yàn)槟透邼B透壓的微生物能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化為多羥基化合物，其中主要的就是甘油；此外，不成熟的低濃度蜂蜜在保存過程中極易產(chǎn)生微生物，導(dǎo)致甘油含量增加。因此蜂蜜中甘油含量水平不僅僅是蜂蜜的主要品質(zhì)指標(biāo)，也是成熟度指標(biāo)。本團(tuán)隊(duì)測試了全國67批次蜂蜜樣品，平均值為272mg/kg，目前我國出口歐盟蜂蜜的甘油含量必須滿足低于300mg/kg要求，現(xiàn)階段在其他蜂蜜成熟度評價(jià)指標(biāo)還不成熟的前提下，甘油可以作為評價(jià)優(yōu)質(zhì)蜂蜜成熟度的指標(biāo)。

結(jié)論

基于上述分析及測試結(jié)果，單一花種蜂蜜的特征物質(zhì)含量和甘油含量可以推薦作為下一步優(yōu)質(zhì)蜂蜜產(chǎn)品生產(chǎn)和消費(fèi)的質(zhì)量控制技術(shù)指標(biāo)，其中洋槐蜜中的洋槐素-1、洋槐素-2和洋槐素-3含量分別不低于16mg/kg、15mg/kg和6mg/kg，棗花蜜的棗花素-1和棗花素-2的含量分別不低于12mg/kg和1mg/kg，且甘油含量低于300mg/kg可視作優(yōu)質(zhì)蜂蜜產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)和品牌創(chuàng)建，對引領(lǐng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

本項(xiàng)目受國家蜂業(yè)提質(zhì)工程專項(xiàng)資助。