侯文肖，段 軍

（中日友好醫(yī)院 外科重癥醫(yī)學科，北京 100029）

膿毒癥 （sepsis）是指由感染引起的機體器官功能障礙，同時伴隨著多種細胞因子和炎性介質的誘導、合成與釋放的綜合征[1]。由于其病理生理機制較復雜，發(fā)病機制未能明確，使得臨床治療相對棘手，致使膿毒癥在臨床上擁有較高的病死率 （25%～30%），且其所致休克病死率高達50%[2，3]。研究分析表明，每年全球約有3150萬人罹患膿毒癥，死亡人數(shù)高達500多萬[4]。同時，這也是導致ICU患者病死率較高的重要原因[5]。為了能夠進一步地研究膿毒癥的病理生理機制和指導臨床治療，就需要借助動物模型來模擬人類膿毒癥。因此，本文就近五年常見的膿毒癥動物模型的研究進展做一綜述。

1 膿毒癥的病理生理機制

膿毒癥的致病機制尚未完全闡明，目前被研究者公認的是當機體受到創(chuàng)傷、感染甚至休克時，體內各種體液系統(tǒng)和細胞系統(tǒng)被激活，導致多種炎性介質和細胞因子的合成、表達和釋放。通過炎癥介質一系列的連鎖反應，產生生物學放大效應，使炎癥反應不斷加重，引起局部和全身炎癥反應的失控，使血管內皮細胞廣泛損傷，進一步促進白細胞黏附并啟動凝血系統(tǒng)，引起全身器官組織損害，最終導致多器官功能障礙。由于對其機制認識的有限性，因此在膿毒癥的治療上，應用抗炎介質和抗細胞因子臨床實驗大都不能取得滿意的臨床效果[6]。如果能夠通過建立理想的膿毒癥動物模型真實再現(xiàn)人類膿毒癥的免疫系統(tǒng)改變，必然會對膿毒癥病理生理機制的研究和臨床治療等工作產生十分重要的影響。

2 膿毒癥動物模型的基本要素及理想模型

研究認為，良好膿毒癥動物模型的制作需要具有以下必備要素：高排低阻血流動力學表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)；伴多個器官功能障礙；有較高的自然死亡率，依據(jù)膿毒癥的病理轉歸，動物模型的自然死亡率要求達到50%～70%；膿毒癥是嚴重感染等因素引起的機體炎癥反應過度激活造成的自身損傷，不是因為細菌和內毒素對機體的直接作用，故出現(xiàn)器官功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應具有相對的時間間距[7]。在臨床上，膿毒癥發(fā)生進展性器官功能障礙或衰竭一般需要幾天甚至幾周，然而制作的動物模型只需要短短幾個小時或者幾天就可以表現(xiàn)出來[8]。Hubbard等[9]認為理想的膿毒癥動物模型應具備以下條件：膿毒癥動模型的血培養(yǎng)均為陽性；膿毒癥早期時表現(xiàn)為暖休克狀態(tài)，即高血容量和高代謝的特點，晚期表現(xiàn)為冷休克狀態(tài)，即低血容量和低代謝的特點；同時，動物模型最好既成本小，又要重復性好。

3 常用的膿毒癥動物模型

綜合近幾年文獻分析，常用的膿毒癥模型主要分為3大類：（1）細菌感染模型，如動物體內注射活的病原體；（2）毒血癥模型，如向動物注射脂多糖等毒素；（3）宿主屏障破壞性模型，如盲腸結扎一穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）及升結腸支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。下面詳細介紹這三類常用的膿毒癥模型

3.1 細菌感染模型

細菌注射模型多通過靜脈、肌肉、腹腔內等不同途徑向動物注射活的病原體，引起局部和全身炎癥反應來達到引發(fā)膿毒癥的臨床表現(xiàn)。通過使用已知菌落的活病原體可以在很大程度上控制菌血癥模型。輸注活病原體的方式主要包括3種：（1）小劑量一次性輸注；（2）小劑量持續(xù)輸注；（3）大劑量一次性輸注。利用這3種方式造模，都可以產生與膿毒癥相類似的炎癥反應及血流動力學變化。Van等[3]研究認為小劑量單次輸注對動物模型誘發(fā)機體炎癥反應較輕，器官功能損傷不是特別明顯，使得死亡率很低。此種造模方法不符合膿毒癥的臨床預后規(guī)律，多已不被采用，而大劑量一次性輸注會使動物模型的臟器過早衰竭及死亡；此種方式造模在血流動力學方面開始就表現(xiàn)為低排高阻，與膿毒癥早期的高排低阻則相反；一般還沒來得及啟動炎癥反應機制時，動物模型就已經死亡了。

小劑量持續(xù)輸注能模擬細菌從感染部位持續(xù)釋放入血的特點，讓動物模型有足夠的時間啟動炎癥反應機制，使促炎細胞因子腫瘤壞死因子（TNF）呈低水平升高，維持較長時間的高排低阻的血流動力學變化及高代謝狀態(tài)，產生與膿毒癥相似的病理生理狀態(tài)及臨床特征。Skorup等[10]利用這種方法向豬體內小劑量持續(xù)輸注大腸桿菌，結果顯示，在G-導致的膿毒癥或休克的早期階段，聯(lián)合應用內酰胺類及氨基糖苷類抗生素可增強抗菌效果。然而，G+導致的感染在膿毒癥中所占的比例逐年增加，尤以金黃色葡萄球菌居多[9]。G+活化Toll樣受體2的主要成分是細菌脂蛋白（BLPs），通過活化核因子（NF）-KB 和 AP-1，促進機體釋放炎癥因子；同時磷壁酸（LTA）利用Toll樣受體2減弱中性粒細胞表面的的CXCR2的表達，從而抑制中性粒細胞對細菌的清除，從而發(fā)生膿毒癥[11]。李倩等[12]研究表明臨床上膿毒癥后期多是G+和G-合并感染，從而加重了患者病情，也增加了治療難度。郭松喜等[13]通過微透析技術，分別研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位對藥物的回收率，推算出不同靶部位的藥物濃度，進而也為臨床治療開辟了一條新的道路。

3.2 毒血癥模型

膿毒癥動物模型最早使用的就是毒血癥模型，20世紀90年代國外研究者發(fā)現(xiàn)了LPS結合蛋白（LBP），通過向動物體內注射內毒素—脂多糖（LPS）來誘發(fā)機體產生炎癥因子，進而發(fā)展為全身的炎癥反應，達到模擬人體膿毒癥炎癥反應機制的效果[14]。理論上，直接靜脈輸注脂多糖就可以造模。但是，綜合文獻報道關于毒血癥的造模方式，根據(jù)向靜脈輸注的速度和單位量，也是分為小劑量一次性輸注、小劑量持續(xù)輸注和大劑量一次性輸注三種方式。Johannes等[15]認為劑量的衡量標準應以降低早期血壓和減少腎小球灌注為目標。陳明祺等[16]通過靜脈小劑量持續(xù)輸注LPS，建立小鼠膿毒癥模型，為研究其炎癥反應和免疫功能，分別于輸注LPS后的特定時間段測定血清中的炎癥介質濃度，測定單核細胞HLA-DR表達水平，并留取腸粘膜組織標本觀察病理改變情況。研究結果提示四逆湯可調節(jié)全身炎癥反應系統(tǒng)，促進感染性小鼠腸黏膜、腸功能和免疫功能的修復。有國外研究報道，膿毒癥主要通過激活三條信號通路，介導適應性免疫或產生放大的級聯(lián)反應，觸發(fā)機體釋放大量的細胞因子和炎性神經遞質[17]，促使全身炎癥反應綜合征及代償性抗炎反應綜合征的發(fā)生，最終導致膿毒血癥。DOI等[14]認為該模型并不能完全模仿人類膿毒血癥，注射脂多糖只是早期引起細胞因子劇增，而炎癥反應消失非?？欤麄€過程極其短暫。比如用抗腫瘤壞死因子和白介素-1治療注射脂多糖的動物模型，治療作用卻并不理想。

3.3 宿主屏障破壞性模型

宿主屏障破壞性模型是使機體的保護屏障遭到破壞，讓細菌和其他腸道內容物漏出、移位。腹腔感染是膿毒癥患者最常見的感染源，且引起腹腔感染相對較容易，所以膿毒癥常用的動物模型就是腹腔感染模型。早期腹腔感染模型是在動物腹腔內直接輸注稀釋的盲腸內容物、帶有細菌的自體凝塊或大腸桿菌。而現(xiàn)在的造模方式主要包括盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型和升結腸支架植入腹膜炎 （colon ascendens stent peritonitis，CASP）模型。LI等[18]認為盲腸結扎穿孔方法是評價膿毒癥動物模型的金標準。因為CLP可以產生與人類膿毒癥十分相似的炎癥反應。血流動力學變化、免疫反應及生物化學的改變[8]。CASP模型比CLP模型產生的炎癥因子反應更強及在血液的細菌數(shù)更多，此種模型主要用于研究彌漫性腹膜炎的病理生理特點和治療方案。

盲腸結扎穿孔（CLP）模型：20世紀80年代Wichterman等把這種模型改良并推廣，是現(xiàn)在應用最廣泛的模型。盲腸里存在糞便，把盲腸結扎穿孔，使含有細菌的糞便不斷進入動物腹腔致其腹腔感染，從而模仿臨床上發(fā)生的腹膜炎及膿毒癥。在制作CLP模型過程中，我們可以根據(jù)感染程度的不同結扎盲腸的不同部位，這也是CLP模型的其中一個優(yōu)點，即能夠造成不同嚴重程度的膿毒癥[19]。Huber-Lang等[20]認為雙阻斷白細胞分化抗原14（cluster of differentiation 14，CD14）和補體 C5（complement C5）比單獨阻斷CD14或補體C5可以很大程度上增加膿毒癥大鼠的生存率，因此，在以后的膿毒癥治療中，可以嘗試特定的阻斷CD14和補體C5，或許可以成為治療膿毒癥的一種新方法。到目前為止，臨床上也沒有可以明確診斷膿毒癥及判斷預后的敏感性或者特異性指標[21]。最近國內學者的一篇影響膿毒癥預后因素的多元Cox回歸模型分析表明，腸道術后、APACHEII評分、空腹血糖、HDL-C、BUN、Ca2+、LY、PLT和SOFA評分是影響膿毒癥患者預后的獨立危險因素[22]。國外有研究報道人參皂苷Rb1可以減輕膿毒癥大鼠肺及肝的損害，使其生存率得到明顯提高；其生理機制主要是通過改善動脈血壓、下調TLR4-mRNA的表達及阻止 TNF-α 的生成[23]。

升結腸支架植入腹膜炎（CASP）模型：由于CLP模型可以形成腹腔內膿腫和膿毒癥兩種情況，但模型的壞死組織缺少像臨床上手術切除的干預方式，后來研究者通過建立CASP模型解決了這個問題。Traeger等[24]研究表明升結腸支架植入腹膜炎（CASP）模型的嚴重程度與腹腔內放的支架的直徑及臟器功能衰竭進程有關。升結腸支架植入腹膜炎（CASP）模型造成腹膜炎后會迅速發(fā)展為全身炎癥反應綜合征，隨后發(fā)生的CARS讓機體逐步進入低炎癥反應狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)大鼠模型的肝臟中存在IL-10表達較多，TNF量較少，而在大鼠的肺中則相反；可以推測它在很大程度上調控著機體的免疫反應。BURAS等[25]研究發(fā)現(xiàn)臨床中膿毒癥患者的血漿IL-10、IL-6、TNF水平比CASP模型中明顯降低，表明全身炎癥反應綜合征和代償性抗炎反應綜合征可能在機體的不同部位同時發(fā)生。

4 展望

雖然膿毒癥動物模型的造模方式有多種，但是每一種膿毒癥模型都有各自的優(yōu)缺點，不能完全反應人類機體膿毒癥的演變過程[26]。盡管如此，膿毒癥模型的研究在指導膿毒癥臨床治療中仍然發(fā)揮重要作用。由于膿毒癥病理機制十分復雜，為了對其有更詳細的認知，要求我們在制作動物模型過程中，依據(jù)實驗目的不同，一定要在自己的研究中標注好這些明確因素。這樣不僅可以讓后期研究者得到有價值的信息，還可以讓膿毒癥動物模型的制作日趨完善。通過微透析技術研究正常大鼠和膿毒癥大鼠不同靶部位的回收率，推算出不同靶部位的藥物濃度，這或許為膿毒癥的研究提供了新思路。雙阻斷白細胞分化抗原14和補體C5可以使膿毒癥大鼠的生存率明顯提高，因此特異性的阻斷CD14和補體C5，是否也可以成為臨床上治療膿毒癥的一種新方法?希望以后制作的動物模型可以真實再現(xiàn)人類膿毒癥，從而解決膿毒癥臨床治療這一難題。