劉志強 ，夏昱 ，陶敏 ，柯江維

再生障礙性貧血（AA）是一組由化學、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血干細胞及造血微環(huán)境損害，骨髓造血功能低下及全血細胞減少的疾病。引起AA發(fā)生的確切原因尚不明了，目前越來越多的臨床觀察和實驗研究表明，免疫系統(tǒng)紊亂在AA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，第46屆美國血液學年會明確提出AA是自身免疫性疾病，免疫異常表現(xiàn)在T淋巴細胞功能亢進[1]。DCs是適應性免疫的主要啟動者，是體內最重要的專職抗原提呈細胞（APC），在免疫應答的誘導中具有獨特的地位。Treg細胞是一種調節(jié)性的T細胞，其主要功能為抑制效應T細胞，維持免疫耐受，預防自身免疫性疾病發(fā)生。本研究采用流式細胞術分析AA患者外周血DCs和Treg細胞數(shù)量的變化及兩者的相關性，為進一步探討AA發(fā)病的免疫學機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2013年1月至2017年4月期間我院血液科收治的初診再生障礙性貧血患兒31例為病例組，其中男19例，女12例，年齡3至14歲，平均年齡8歲9個月。以上病例的診斷均參照國際再障診斷標準[2]。同期來我院門診健康體檢兒童26例為對照組，其中男15例，女11例，年齡4至13歲，平均年齡9歲1個月。兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 采集AA初診患兒及健康對照組兒童靜脈血lml，置含肝素抗凝管中，標本2h內檢測。

1.2.2 淋巴細胞CD系列表達檢測 每份待測標本分三管，相應取美國BD公司CD4-FITC、CD25-APC、CD127-PE，Lin2 （CD3、CD14、CD19、CD20、CD56）FITC 混 合 抗 體 ，HLA-DR-PerCP、CD11c-PE-cy7、CD123-APC鼠抗人熒光單克隆抗體10ml，加入肝素抗凝血100μl，混勻，室溫避光孵育20min，分別加入1×紅細胞裂解液1ml，室溫避光放置 10min，1000r/min離心 5min， 棄上清液，用PBS洗滌2次，棄上清，加PBS 250μl懸浮細胞，上機檢測。采用BD公司FACSCanto流式細胞儀檢測，BD FACSDiva軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理， 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示表示，組間均數(shù)比較采用配對和成組設計t檢驗，相關性分析應用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的相關信息

2.1 外周血DC1和DC2占淋巴細胞的百分比 本實驗通過對兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血DC1占淋巴細胞的百分比高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而外周血 DC2 占淋巴細胞的百分比與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 外周血DC1和DC2占淋巴細胞的百分比

2.2 外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比 AA患兒外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 見表 2。

表2 外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比

2.3 外周血DC1和Treg的相關性 分析顯示AA組和對照組DC1和Treg細胞在數(shù)量上呈負相關。見表3。

表3 DC1和Treg細胞水平對比及相關性分析

3 討論

目前認為T淋巴細胞異?；罨⒐δ芸哼M不僅參與了兒童感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]，亦是造成骨髓損傷、造血細胞凋亡及造血功能衰竭的主要原因。Treg細胞為CD4+T細胞的亞群，它們通過細胞間接觸和分泌抑制性細胞因子(TGF-β、IL-10等)方式發(fā)揮抑制功能[4]。Treg細胞的抑制性功能在維持機體內環(huán)境穩(wěn)定、誘導免疫耐受及防止AID的發(fā)生方面起著重要作用。有研究顯示在急性白血病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等血液系統(tǒng)疾病中存在Treg數(shù)量和功能的異常[5，6]。亦有研究表明，AA患者外周血也存在Treg數(shù)量和功能的異常。Solomou EE等[7]首次發(fā)現(xiàn)，確診再障的患者外周血單個核細胞中Treg細胞數(shù)量減低；其中7例接受免疫抑制治療后出現(xiàn)造血應答的患者中，有6例的Treg細胞數(shù)量和Foxp3表達水平相對未治療前均輕微升高；而3例接受免疫抑制治療達到完全緩解 (CR)的患者，Treg細胞數(shù)量較治療前增加。王西閣等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，急慢性AA患兒Treg細胞百分均低于對照組，與Solomou EE研究結果一至，且在SAA中Treg細胞比例進一步降低。在對獲得性AA研究中發(fā)現(xiàn)，病例組與健康對照組相比CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25+FOXP3+T細胞占CD4+T細胞百分比及其絕對值均明顯降低，經免疫抑制治療 (IST)3～6個月后Treg數(shù)量比治療前有所提高[7]。提示CD4+CD25+FOXP3+Treg在絕大多數(shù)AA患者中都是降低的，隨著IST有效，病情緩解，Treg數(shù)量上升。

本實驗通過對兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比低于健康對照組。Treg細胞是一類具有重要調節(jié)功能的T細胞亞群，具有免疫低反應性和免疫抑制性兩大功能，其正常水平和功能的維持有助于免疫系統(tǒng)對自身抗原的刺激建立良好的耐受狀態(tài)[9]。正常狀態(tài)下，機體不存在自身免疫反應，最重要的原因就是Treg細胞的存在抑制了自身反應性T細胞的活化。由此推測Treg缺乏，自身反應性T細胞增加，機體免疫耐受被打破，啟動自身免疫應答，免疫效應細胞增多，功能亢進，促進AA發(fā)生。

DCs是適應性免疫的主要啟動者，是體內最重要的APC。DCs既能誘導有效的免疫應答，同時在誘導免疫耐受中也十分重要。根據(jù)來源不同，DC細胞可以分為DC1和DC2（mDC和pDC）。余詩炎等[10]研究發(fā)現(xiàn)結核性胸膜炎患者外周血中mDC比例顯著高于對照組，胸腔積液中mDC比例高于外周血。重型AA患者的骨髓中，未成熟的和激活的DC1均明顯增加，且兩者比例失衡，促進Th0細胞向Th1型分化，使自身免疫耐受被打破、T細胞功能亢進而導致造血功能衰竭[11]。此外，還發(fā)現(xiàn)初發(fā)重型AA患者外周血中髓系DC前體（pDC1）顯著增多，并且pDC1與淋巴細胞系DC前體（pDC2）比值明顯失衡，與正常對照組存在差異；而在恢復期時上述指標下降，與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義[12]。Liu等[13]采用蛋白質組學技術分析mDC蛋白表達，經質譜鑒定發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)和丙酮酸激酶M2型蛋白(PKM2)在初治SAA患者mDC中表達上調；其中PKM2在進一步鑒定中發(fā)現(xiàn)，無論是蛋白水平還是mRNA水平在SAA患者mDC內表達均明顯增高。

本實驗通過對兒童AA的研究亦發(fā)現(xiàn)AA患兒外周血DC1占淋巴細胞的百分比高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義；外周血DC2占淋巴細胞的百分比與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。DC1分泌白細胞介素-12（IL-12）使機體的免疫應答反應加劇，促使Th0向Th1細胞分化并促進Th1細胞分泌γ干擾素（IFN-γ），進一步加劇了機體的免疫應答反應，從而促進AA發(fā)生。DC2則分泌IL-4，使Th0向Th2細胞分化，但DC2主要與B淋巴細胞功能有關，具有一定的吞噬、攝取、加工抗原的能力，但抗原呈遞能力低。由此可知，AA患者的DC亞群存在異常，其與激活Th1細胞相關的DC1明顯增多相關。這表明AA患者骨髓中DC1處于功能亢進狀態(tài)，可能是導致AA疫耐受被打破的重要因素。而抗原刺激則有可能是激活AA患者DC1，進而誘導免疫“瀑布”反應的始動因素。

本實驗通過進一步研究還發(fā)現(xiàn)，AA組和對照組DC1和Treg細胞在數(shù)量上呈負相關。一般認為，DCs誘導產生效應性T細胞還是調節(jié)性T細胞在很大程度上取決于其成熟狀態(tài)，即DCs/imDCs的比例[14]。有研究表明，來源胸腺的Treg細胞的產生，不需要和專門的DCs相互作用，而主要與胸腺內皮細胞和自身抗原有關[15]。亦有研究[16]認為AA患者骨髓中B淋巴細胞可以通過協(xié)同刺激因子影響Treg細胞導致T淋巴細胞異?；罨?，進而使骨髓造血功能衰竭。另外，調節(jié)性T細胞的產生依賴于所處的環(huán)境，在一定的環(huán)境下，T細胞遇到自身或外源抗原，由于DCs表面的協(xié)同刺激分子的表達改變或者細胞因子的格局變化亦可影響T細胞分化為調節(jié)性T細胞。有關DCs與Treg相互作用的分子機制還不很清楚，涉及的層面和環(huán)節(jié)非常復雜，還有待于進一步研究。