晁鵬麗，黃松潔，方贊熙

隨著生物科學領域研究的不斷深入，生物芯片面世，然而由于生物芯片技術本身的局限性，并不能很好地運用于臨床。美國Luminex公司研發(fā)了液態(tài)芯片技術——多功能多指標并行分析系統(tǒng)（Flexible Multi-Analyte Profiling system，xMAP 技術）解決了這個問題，xMAP技術1次檢測，最多可以檢測100種指標，既能檢測蛋白質，也能檢測基因。在本研究中，利用該技術對HPV的27個亞型可同時進行分析。

人乳頭瘤病毒（HPV）是目前唯一確定的與腫瘤相關的病毒，除了眾所周知的宮頸癌，還與喉鱗癌，以及一些生殖器、肛門等癌癥相關。其中宮頸癌是女性好發(fā)腫瘤之一，居第二位。我國每年新發(fā)的病例約有十幾萬，其中近兩萬人死于該病，而HPV是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要條件。本研究通過對本地區(qū)517例體檢女性宮頸脫落細胞進行HPV基因的27個常見亞型的檢測，探討HPV隱性感染及亞型分布情況?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2014年10月至2015年6月在廈門大學附屬中山醫(yī)院體檢的517例女性，均無明顯臨床癥狀。年齡范圍25～73歲，取材時要求避開月經(jīng)期，48h內無性生活、陰道未使用藥物沖洗液。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 先用無菌棉簽擦去宮頸口過多的分泌物，然后用配套的采樣刷子，按照婦科常規(guī)取樣程序，采集宮頸脫落細胞。采集手法需輕柔亦要保證采集到足夠量的細胞可供檢測。采集完畢后將刷子放入專用樣本管，輕輕搖晃管子，利用管內的保存液將刷子上的細胞洗脫下來。蓋緊瓶蓋，做好標記。并在“醋酸白”等實驗前，采集宮頸脫落細胞。4℃保存，一周內檢測。

1.2.2 儀器與試劑 主要儀器：Life Eco基因擴增儀（杭州博日科技有限公司），Luminex 200多功能流式點陣儀（上海透景生命科技有限公司）。試劑：人乳頭瘤病毒基因分型試劑盒(上海透景生命科技有限公司)。共可檢測27種亞型，依據(jù)Cogliano V[1]和Schiffman M[2]的報道分為低危亞型10種：6、11、40、42、43、44、55、61、81、83；高危亞型 17 種：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82；以及內對照 Globin。

1.2.3 HPV DNA 提取 充分混勻樣本，吸取 200μl到潔凈的 1.5ml離心管，14000r/min 離心 3min，吸棄上清，每管中加入200μl的提取緩沖液，振蕩均勻，放入100℃金屬浴中保溫15min，將離心管取出14000r/min離心5min，上清液備用。

1.2.4 PCR擴增 取PCR反應管，在其中加入15μl配制好的反應體系和5μl的已提取待測樣本，加樣結束后放置擴增儀中進行擴增。

1.2.5 雜交與熒光染色 在雜交板各 孔中加 入22μl微球雜交液，再在對應孔中加入3μl的PCR擴增產物，雜交完成后，加入75μl的熒光素SAPE，反應 15min。

1.2.6 上機檢測 將微孔雜交板快速轉移至預熱好的Luminex流式分析儀上讀取結果。結果判斷：透景HPV計算軟件可以自動判斷結果。其判斷的標準如下：每孔均含陽性內對照Globin，內對照Globin的信號大于150，且大于等于2.5倍背景信號值，如否，可能是樣本中沒有采集到細胞或某種試劑失效，則需重新采樣重新實驗。各亞型陰陽性判斷亦遵從該標準，亞型信號＞150，且≥2.5倍背景信號，為陽性；反之，為陰性。

1.3 統(tǒng)計方法 應用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，感染率的差異比較用χ2檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染情況 517例體檢女性中總的HPV感染率為 19.3%，按年齡分為 25～30 歲、31～35 歲、36～40 歲、41～45 歲、46～50 歲、51～55 歲、＞55 歲 7個組， 各組 HPV 感染率分別為 18.9%、25.0%、16.2%、24.0%、18.5%、18.6%、12.3%，χ2=5.446，P=0.488；各組低危感染率分別為 1.9%、13.2%、5.4%、4.2%、4.9%、7.0%、3.7%，P=0.108（精確概率法）；高危 感 染 率 分 別 為 17.0% 、19.7% 、10.8% 、20.8% 、16.0%、11.6%、8.8%，χ2=6.675，P=0.352。 差異均無統(tǒng)計學意義。HPV陽性例數(shù)中總的人群混合感染例數(shù)占 27.0%， 各年齡組分別為 10.0%、63.0%、27.8%、8.7%、40.0%、0、12.3%，P=0.02 （精確概率法），差異明顯，其中以31～35年齡組最高、其次是46～50年齡組、再次是36～40年齡組。結果見表1。

表1 總人群及各年齡段HPV感染率、低危感染率、高危感染率和混合感染率

2.2 不同年齡組亞型分布情況 31～50年齡段低危亞型感染呈多樣化，而25～30年齡段和＞50歲年齡段低危亞型感染較單一。高危亞型：25～30年齡組常見感染亞型是18型和52型；31～35年齡組16和52型最多，其次是18和59型；36～40年齡組51、52、53、56 和 59 型較其他型多見；41～45 年齡組 52 型較多見；46～50 年齡組 39、51、52、58 較其他型多見；51～55年齡組亞型分布較簡單，僅有51、52和53型，其中以52型最多見；＞55年齡組HPV陽性的7例檢出的高危亞型有16、39、52、56和 58。而 26、31、35、82 則未發(fā)現(xiàn)感染例數(shù)。結果見表2。

3 討論

1995年，國際癌癥研究署確定了“HPV感染是女性宮頸癌和宮頸上皮內高度瘤變（CINⅡ/Ⅲ）發(fā)生的必要條件”，歷年來的多項研究也進一步證實了此觀點[3，4]。但由于在感染的初期，多數(shù)因為臨床癥狀不明顯或為炎癥表現(xiàn)，而被忽視甚至誤診，導致延誤治療時機，而逐漸病情惡化最終惡變。本文針對2014年10月至2015年6月期間來本院體檢的健康女性(年齡跨度25～73歲)的HPV檢測結果進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)這一人群中HPV的感染率高達19.3%，且與年齡無明顯相關性，與項璐璐和姜樹朋報道的數(shù)據(jù) 21.7%和 21.1%相近[5，6]。 女性HPV低危亞型感染通常引起一些婦科良性病變，而高危亞型感染才是導致惡性病變的高風險因素。本文對HPV低危感染率和高危感染率進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)人群總的HPV低危感染率為5.8%，而HPV高危感染率為15.5%，HPV高危感染要高出低危很多，且各年齡組均是如此。從年齡特點來看，HPV低危感染31～35年齡組高于其他年齡組，高危感染各年齡組無明顯差異。陳占國[7]報道相較于HPV單一感染，混合感染危害性更大，HPV混合感染是宮頸上皮由低級別病變向高級別病變發(fā)展進而演變?yōu)閷m頸癌的重要危險因素之一[8]，本結果中人群總的混合感染率為27.0%，其中31～35年齡組高達 63.2%， 其次是 46～50 年齡組 40.0%，再次是36～40年齡組27.8%。綜合上述結果可知，各年齡段的女性人群均存在宮頸癌發(fā)生的高危因素，31～35年齡段因其較高的HPV混合感染率而大大提高了患病的風險性。

表2 不同年齡組亞型分布情況（感染率）

高危型HPV致惡性病變能力與亞型密切相關[9]。2005年2月，經(jīng)國際癌癥研究署研究討論，導致宮頸癌的13種高危HPV亞型被確定，而當HPV檢測應用于宮頸癌篩查時不同亞型的致惡變能力差異需作為關鍵因素考慮在內。在中國宮頸癌常見的高危亞型有 8 種：16、18、58、52、31、33、59 和45型[10]。在本結果中，不同年齡組HPV亞型分布特點：31～50年齡段低危亞型感染呈多樣化，而25～30年齡段和＞50歲年齡段低危亞型感染較單一。HPV高危亞型25～30年齡組感染以18型和52型為主；31～35年齡組16和52型最多，其次是18和59 型；36～40 年齡組 51、52、53、56 和 59 型較其他型多見；41～45年齡組52型較多見；46～50年齡組39、51、52、58 較其他型多見；51～55 年齡組亞型分布較簡單，僅有51、52和53型，其中以52型最多見；＞55年齡組HPV陽性的7例檢出的高危亞型有 16、39、52、56 和 58。 從本結果分析得出：宮頸癌常見亞型中， 本地區(qū)25～30歲、31～35歲和＞55歲這三個年齡段的女性以感染HPV16型和HPV18型為主；36～40、41～45、46～50、51～55 這四個年齡段的女性以感染HPV52型和HPV58型為主?？傮w來說，本地區(qū)常見亞型基本和我國其他地區(qū)相符[11-13]。而不同年齡段間亞型分布的差異，可能與以下兩點有關：⑴機體防御清除病毒的能力；⑵性生活的頻次以及性伴侶的專一性。其中的相關性有待進一步地驗證。

從本結果研究分析來看，HPV感染可發(fā)生在各個年齡段， 且在 31～35、36～40 和 46～50 歲這三個年齡段中混合感染的幾率大。而HPV亞型與致病力及宮頸癌發(fā)病風險相關，HPV16和18是感染比例最高且與宮頸癌密切相關的主要2種亞型[14，15]， 在本結果中 25～30、31～35 歲和＞55 歲這三個年齡段的女性HPV16型和HPV18型感染率較大。因此各年齡段的婦女都應重視HPV篩查，在有條件的實驗室應盡可能開展HPV亞型檢測，可指導醫(yī)生更早地預警宮頸癌。針對HPV感染人群應結合宮頸脫落細胞檢查，定期監(jiān)測，積極治療，預防宮頸癌的發(fā)生。