李 斌，楊繼富，趙 翠，紀雪梅

（1.中國水利水電科學研究院 水利研究所，北京 100048；2.濟南大學 資源與環(huán)境學院，山東 濟南 250022）

1 研究背景

農(nóng)村供水與排水密不可分，2005年以來全國開展了大規(guī)模農(nóng)村飲水安全工程建設(shè)，農(nóng)村供水快速發(fā)展，生活污水量迅速增加，亟需開展適宜污水處理技術(shù)研究與應用。曝氣生物濾池（Biological Aerated Filter，BAF）具有占地面積小、投資低和管理方便等特點，特別適于農(nóng)村生活污水處理。目前，有關(guān)BAF處理生活污水的研究主要集中于城市污水，但農(nóng)村污水是不同于城市和中小城鎮(zhèn)的一類污水［1］。農(nóng)村生活污水的水質(zhì)水量特征與城市差異較大，其排放量較小、有機污染物濃度高、排放不均勻，日變化系數(shù)一般高達3.0～5.0［2］，需要深入開展研究。BAF去除污染物主要依賴濾料表面形成的不同優(yōu)勢種群的生物膜［3］，微生物群落與其所處的環(huán)境條件密切相關(guān)，不斷進行著物質(zhì)和信息的交換［4］，進行微生物群落分析可深入認識和掌握BAF處理效率及機理。

20世紀90年代以來的研究表明，影響B(tài)AF處理效率的主要因素有填料［5］、進水污染物負荷、氣水比、DO、水溫和反沖洗工藝等；Pujol等［6］試驗證實濾速在6、13 m/h條件下BAF對BOD5的去除率基本保持不變；Canler等［7］試驗也同樣證實濾速增加對出水水質(zhì)影響很小；Farabegoli等［8］對BAF處理生活污水進行了3年中試研究，結(jié)果表明該工藝具有碳和氨氧化的高效率和穩(wěn)定性；He等［9］分別用膨脹土和天然沸石作為BAF的濾料進行市政污水處理試驗研究，認為沸石比膨脹土的抗沖擊負荷、抗低溫能力強。

傳統(tǒng)的微生物分析技術(shù)以微生物純培養(yǎng)為基礎(chǔ)，但大部分微生物類群不可培養(yǎng)，可培養(yǎng)的僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%［10］，因此傳統(tǒng)的微生物分析方法很難獲得微生物群落結(jié)構(gòu)的準確信息［11］。近年來，主要采用分子技術(shù)進行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，包括克隆文庫、DGGE、FISH、T-RFLP和qPCR等［12］。本文采用的高通量測序技術(shù)被稱為“下一代”測序技術(shù)，能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，具有效率高、成本低、時間短、操作簡便［13-14］等優(yōu)點。高通量測序技術(shù)已被廣泛應用于基因組［15-16］和轉(zhuǎn)錄組［17］?；驕y序儀（Miseq）是美國Illumina公司推出的一款小型測序平臺，Illumina MiSeq測序系統(tǒng)是國際上唯一在單個儀器上整合了擴增、測序和數(shù)據(jù)分析的新一代測序儀，由于其讀長長，準確性高，通量高［18］的優(yōu)點，已在微生物多樣性群落分析方面得到了廣大學者的認可［19］。

有關(guān)BAF對污水處理效率及微生物特性分析，邱珊［20］研究了不同結(jié)構(gòu)特性濾料對BAF處理城市生活污水效果的影響，以及反應器中不同高度微生物群落結(jié)構(gòu)變化，認為涂鐵改性陶粒更能促進微生物的生長繁殖；竇娜莎［21］以青島麥島污水處理廠的BAF為研究對象，分析了主要污染物的去除效果和微生物特性，認為氣水比、反沖洗和水溫是影響B(tài)AF群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子；胡保衛(wèi)等［22］對BAF的降解規(guī)律進行了研究，認為濾料在100～400 mm段的去除率增長速度較快，在700 mm之后去除率增長逐漸變緩；邱立平等［23］研究了BAF處理人工調(diào)配生活污水時反應器內(nèi)生物種群特征，認為沿水流方向生物膜活性變化呈現(xiàn)明顯的倒“V”性特點，高度營養(yǎng)級微生物占比較高。嚴子春等［24］研究了折流BAF中污染物與微生物沿程變化規(guī)律，認為首個單池對有機物有很好的去除效果，但對氨氮的去除效率較低，其中微生物以異養(yǎng)菌為主；后面單池中硝化菌增殖較快，硝化效果好。

本文以實際農(nóng)村生活污水為處理對象，選用改性沸石和礫石為BAF填料，設(shè)計3種填料結(jié)構(gòu)、2種氣水比，在進水流量、水力停留時間和C/N一定條件下進行BAF處理效果分析，應用高通量測序技術(shù)分析微生物種群類別、數(shù)量、分布特征，為優(yōu)化BAF設(shè)計、創(chuàng)造適宜微生物生存環(huán)境、提高農(nóng)村生活污水處理效率等提供科學依據(jù)。

2 試驗裝置與方法

2.1 裝置設(shè)計試驗裝置由4個反應柱組成（見圖1），進行平行試驗。反應柱為Ф120 mm有機玻璃柱，總高55 cm，表面積113.04 cm2；反應柱中濾池高度360 mm，進水流量72 L/d，水力停留時間18 h，C/N 8.2∶1。試驗采用上向流BAF結(jié)構(gòu)，對懸浮物有較強的攔截作用。

圖1 BAF系統(tǒng)工藝流程

為比較不同填料結(jié)構(gòu)對生活污水處理效率及微生物群落的影響，4個反應柱采用3種不同的填料結(jié)構(gòu)。1#反應柱填料為礫石，粒徑自上而下由小到大分為3層，上、中、下3層粒徑分別為8～10 mm、10～20 mm、20～30 mm；2#反應柱填料為沸石和礫石，粒徑為8～10 mm，按1∶1均勻混合后填充；3#反正柱填料為沸石和礫石，粒徑為8～10 mm，按1∶1分層填充，上層為沸石，下層為礫石；各反應柱最下層均為鵝卵石承托層。作為對照，4#反應柱的填料結(jié)構(gòu)與2#反應柱相同，氣水比為3∶1，其他反應柱的氣水比為5∶1。

反應柱正常運行后，濾料表面生成生物膜，膜表層有硝化作用的自養(yǎng)型細菌，膜里層有反硝化作用的異養(yǎng)型細菌，生活污水通過濾料時發(fā)生硝化、反硝化作用［25］。系統(tǒng)所需氧氣由底部曝氣泵提供，空氣與污水一同向上通過濾層，濾料的阻攔能夠延長氣與水的接觸時間，提高曝氣充氧效果。裝置反沖洗水流方向與過濾方向相反，采用氣水聯(lián)合反沖洗方式，反沖洗周期為36 h，每次持續(xù)時間20 min。

2.2 原水水質(zhì)試驗原水為試驗站附近北京大興區(qū)某村污水處理廠收集的生活污水，進水水質(zhì)如表1。

表1 進水水質(zhì) （單位：mg/L）

2.3 采樣方法為對比不同濾料結(jié)構(gòu)和氣水比條件下的生活污水處理效率，每個反應柱在同一高度設(shè)置出水口（距頂部70 mm），采取水樣。為分析各反應柱微生物種群類別、數(shù)量及分布特征，每個反應柱設(shè)上、中、下3個取樣點，距反應柱底部高度分別為435、232和75 mm，進行微生物采樣。

2.4 水質(zhì)分析方法根據(jù)國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第4版），CODCr采用重鉻酸鹽法，BOD5采用非稀釋法和稀釋法，氨氮采用水楊酸分光光度法，TP采用鉬酸銨分光光度法。

2.5 微生物群落分析方法采用16S rRNA基因-Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，流程為：（1）聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）。提取出來的基因組DNA，在16SrRNAV3-V4區(qū)內(nèi)進行擴增，通用引物序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）；PCR反應參數(shù)：95 °C預變性3 min，95 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30s，27個循環(huán)，72°C后保溫10 min，于10°C保存。（2）熒光定量。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物應用QuantiFluor?-ST熒光定量系統(tǒng)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。（3）Miseq文庫構(gòu)建。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。（4）Miseq測序。DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上，另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定，形成“橋（bridge）”；PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇，DNA擴增子線性化成為單鏈，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）。每次循環(huán)只合成一個堿基，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類，將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3'端黏性；繼續(xù)聚合第二個核苷酸，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

3 污染物去除效果分析

試驗運行90 d，在30 d后各反應器進入成熟期。從第40 d開始取水樣，每10 d取一次，進行原水和出水水質(zhì)檢測，分析不同反應柱污染物的去除效果。在反應器啟動初期，內(nèi)部填料表面尚未能形成生物膜，但由于沸石表面較為粗糙，充滿很多肉眼看不見的小孔，在內(nèi)部形成微空隙通道，這時主要靠過濾和物理吸附作用去除BOD和COD。普通曝氣生物濾池可通過分析COD及氨氮的去除率和生物量三項指標來判斷掛膜進展。通常認為，COD去除率達到70%～75%時異養(yǎng)菌掛膜完成，當氨氮去除率穩(wěn)定時即可認為自養(yǎng)菌掛膜成功［26］，之后進入正式運行的生物降解階段。從試驗運行情況看，在最初的20 d內(nèi)，出水水質(zhì)有較大波動，60 d后，出水水質(zhì)較為穩(wěn)定，說明反應柱進入生物降解穩(wěn)定階段，微生物生長性能良好，活性高，對有機物去除能力強。在反應柱運行中，生物膜逐漸增厚，膜的厚度一般應控制在300～400 μm，此時新陳代謝能力強，能保證較好的出水水質(zhì)［27］。當膜的厚度超過范圍時會導致溶解氧過低，影響微生物繁殖，生物膜活性變差，去除能力降低，出水水質(zhì)變差。與此同時進水中的顆粒物被截留在填料空隙中，過量微生物也聚集在填料空隙中，造成反應器堵塞。為此，本文設(shè)計了反沖洗系統(tǒng)，反沖洗周期為36 h，以防止堵塞產(chǎn)生。圖2—圖4表示各反應柱出水的BOD5、CODCr、氨氮和TP值隨時間變化情況。從圖2—圖4可以看出，60 d以后處理效果趨于穩(wěn)定，說明反沖洗能夠有效實現(xiàn)反應柱內(nèi)微生物新老更替，保持生物膜活性。

圖2 不同反應器BOD5出水濃度隨時間變化曲線

圖3 不同反應器CODCr出水濃度隨時間變化曲線

圖4 不同反應器氨氮出水濃度隨時間變化曲線

圖5 不同反應器TP出水濃度隨時間變化曲線

表2為各反應柱運行期平均出水水質(zhì)及污染物去除率。從表2中看到，1#、2#、3#反應柱的BOD5、CODCr和氨氮的去除率較高，達到84.51%～96.49%，出水平均濃度達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級A標準，說明在氣水比5∶1條件下3個反應柱設(shè)計能夠滿足有機物和氨氮去除要求；4#柱與2#柱填料結(jié)構(gòu)相同，但氣水比小，BOD5和CODCr處理效果較差，說明較大氣水比有利于提高有機物去除率；在4個反應柱中2#柱污染物綜合去除效果最好，說明BAF填料采用沸石和礫石按1∶1均勻填充方式更合理。

表2 各反應器運行期平均出水水質(zhì)及污染物去除率

與此同時看到，4個反應柱的TP去除率比較低，在29.62%～65.81%之間，出水平均濃度達不到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級A標準，說明該裝置對磷的去除能力較弱，需要根據(jù)出水再利用要求采取深度處理措施。生物除磷主要依靠聚磷菌的吸磷作用。聚磷菌吸磷能力的恢復需要在厭氧條件下進行釋磷，在交替好氧/厭氧條件下才能保證聚磷菌生長［28］。由于本試驗為曝氣生物濾池，不能保證良好的厭氧釋磷環(huán)境條件，導致除磷效果差。

4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在試驗結(jié)束前，在4個反應柱的上、中、下位置分別進行微生物采樣，采樣高度距反應柱底部高度分別為435、232和75 mm。在測試時將1#、2#、3#、4#反應柱上、中、下位置對應的樣品編號為A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D1、D2、D3。結(jié)果分析如下。

4.1 數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計Miseq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)。根據(jù)雙端測序讀長（PE reads，paired-end reads）之間的重疊（overlap）關(guān)系，將成對的讀長（reads）拼接（merge）成一條序列；同時對讀長（reads）的質(zhì)量和拼接（merge）的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的條碼（barcode）和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。

優(yōu)化數(shù)據(jù)量統(tǒng)計及長度分布如表3。從12個樣本中獲得419 241條高質(zhì)量16SrDNA序列，平均長度438.67bp′。

表3 優(yōu)化的序列

4.2 微生物OTU聚類及相關(guān)分析OTU（Operational Taxonomic Units）是為了便于進行分析，人為給某一個分類單元設(shè)置的同一標志，在具體分析時將測序得到的每一條序列進行歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。利用R語言工具統(tǒng)計和作圖，維恩（Venn）圖用于統(tǒng)計多個樣本中共有和特有的OTU數(shù)目［29］。本文4個反應柱各樣本中共有和特有的OTU數(shù)目統(tǒng)計分析結(jié)果如圖6所示。其中圖6（a）表示1#、2#、3#柱的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況；圖6（b）表示2#與4#柱相同填料結(jié)構(gòu)、不同氣水比條件下OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況；圖6（c）（d）（e）表示1#、2#、3#柱同一高度處樣本的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。

圖6 OTU分布維恩圖

通過測序，對4個反應柱12個樣品所產(chǎn)生的OTU進行統(tǒng)計分析，共形成1 654個OTU（97%相似度）。從圖6（a）得到，1#、2#、3#號柱的OTU數(shù)量差異很小，分別為1 533個、1 550個和1 530個，且共有1 390個OTU數(shù)，說明3個柱的微生物種類數(shù)量基本相同，也可以說在1 390個OTU中包含了3個反應柱中全部優(yōu)勢菌群。其中2#柱的OTU數(shù)量最多，說明BAF填料采用沸石和礫石按1∶1均勻混合后填充的結(jié)構(gòu)有利于微生物的生長。從圖6（b）得到，2#柱特有的OTU數(shù)為158個，遠大于4#柱特有的61個OTU數(shù)，說明相同填料結(jié)構(gòu)時，較大的氣水比更能增加微生物種類。該結(jié)果與前述各反應柱污染物去除效果分析相一致。

從圖6（c）（d）（e）得到，1#、2#、3#柱上層A1樣品的OTU數(shù)量1 049個，B1樣品1 271個，C1樣品1 184個；中層A2樣品1 205個，B2樣品1 237個，C2樣品1 273個；下層A3樣品1 348個，B3樣品1 269個，C3樣品1 284個。從中看到，1#和3#柱的OTU數(shù)量隨濾層高度增加而減少，說明下層微生物種類最多。其中1#柱填料為礫石，分為3層，粒徑自上而下由小到大，說明粒徑大的濾層有利于微生物生長；3#柱上層填料為沸石，下層為礫石，說明礫石濾料有利于微生物生長；2#柱填料為沸石和礫石按1∶1混合均勻后填充，其OTU數(shù)量隨高度先減少后增加，上層微生物種類最多，說明濾料相同條件下濾料高度對微生物種類也有影響。從同一高度不同濾料結(jié)構(gòu)的微生物類群看，1#、2#、3#號柱上層共有OTU785個，中層共有OTU895個，下層共有OTU971個，說明3個反應柱中的微生物種類和數(shù)量均存在差異。

4.3 多樣性指數(shù)分析單樣本的多樣性分析（Alpha多樣性）包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)，可反映微生物群落的豐度和多樣性。應用Mothur軟件計算得到4個反應柱上、中、下3層樣品的常用生物多樣性指數(shù)，見表4。

表4 生物多樣性指數(shù)

表4中，Chao和Ace是表示群落豐度的指數(shù)，Chao/Ace值越大，群落豐富度越高。Shannon和Simpson是表示群落多樣性的指數(shù)，Shannon值越大，多樣性越高；Simpson值越大，多樣性越低。Coverage是測序深度指數(shù)，其值越高樣本中序列被測出的概率越高，數(shù)據(jù)越可靠。從表4看到，4個反應柱的上、中、下各層Coverage值均在0.99以上，說明本試驗微生物多樣性測序數(shù)據(jù)可靠性高。

從表4看到，4個反應柱的Chao/Ace值均在0.98以上，且相差很小，說明各反應柱的微生物豐富度都很高。由表4中Shannon和Simpson指數(shù)綜合看出，各取樣點微生物多樣性相差不大，其中2#和3#柱中層濾料的微生物多樣性最大。

4.4 主成分分析主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），是一種對數(shù)據(jù)進行簡化分析的技術(shù)［30］，可有效找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)。對各樣本的OTU數(shù)進行主成分分析，找出影響各反應柱微生物多樣性的主要因素。本文在其他要素相同條件下分析4個反應柱的填料材質(zhì)、粒徑、高度、氣水比對微生物多樣性的影響，結(jié)果如圖7所示。其中圖7（a）（b）（c）為1#、2#、3#柱的填料材質(zhì)、粒徑、高度對生物多樣性的影響分析，圖7（d）為2#和4#柱不同氣水比對生物多樣性的影響分析。

圖7 微生物多樣性的主成分分析分布散點圖

從圖7（a）（b）（c）看出，各樣品的分布差異大，明顯分離，3個主成分的貢獻率明顯不同，第一主成分PC1的貢獻率為79.86%，第二主成分PC2的貢獻率為6.62%，第三主成分PC3的貢獻率為4.48%。從圖7（a）（b）看到，A1、C3分布于PC1負軸，且在同一象限內(nèi)，C1分布于PC1正軸，A1、C3均為小粒徑礫石，C1為沸石，說明不同填料材質(zhì)對微生物多樣性影響較大；從圖7（a）（c）看到，A1、B1、C1分布于PC2的正軸，A3、B3分布于PC2負軸，說明不同高度對微生物多樣性影響較大；從圖7（b）（c）看到，A3、C1分布于PC3正軸，其他均分布于PC3負軸，說明填料粒徑對微生物多樣性影響較大。從圖7（d）看出，第一主成分PC1的貢獻率為82.4%，第二主成分PC3的貢獻率為8.53%，說明氣水比的不同對微生物多樣性影響較大。

4.5 群落結(jié)構(gòu)組分分析將多個樣本的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對比，用柱狀圖形式呈現(xiàn)。其中不同顏色代表不同菌群，高度代表數(shù)量，以確認優(yōu)勢菌。本文對1#、2#、3#號反應柱的9個樣品進行不同菌群數(shù)量對比，結(jié)果見圖8。

圖8 微生物群落柱狀圖

從圖8看出，菌群數(shù)量比較大的優(yōu)勢菌群主要有6種，按數(shù)量多少排序為變形菌門（Protebacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Acfinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）；3個反應柱的優(yōu)勢菌群種類基本相同，但數(shù)量有所差異。這些優(yōu)勢細菌的存在，使得BAF中生物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，并具有良好的抗負荷沖擊能力。

根據(jù)以往研究，聚磷菌（Polyphosphate Accumulating Organisms，PAOs）類群的微生物包括產(chǎn)堿桿菌屬、腸桿菌屬、葡萄球菌屬、變形菌屬等［31］。由于本文未針對聚磷菌進行富集和鑒定，不能確定聚磷菌的有無及數(shù)量，但從優(yōu)勢菌群看出，在變形菌門中可能含有聚磷菌。下一步將通過特異性功能基因探針對聚磷菌進行深入研究，且BAF生物膜中還有一部分菌種無法確定，也需要深入研究。

5 結(jié)論

（1）1#、2#、3#反應柱BOD5、CODCr和氨氮的去除率比較高，達到84.51%～96.49%，出水平均濃度達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級A標準，說明在氣水比5∶1條件下3個反應柱設(shè)計合理，能夠滿足有機物和氨氮去除要求；在相同填料結(jié)構(gòu)條件下較大氣水比5∶1對有機物的去除效果明顯優(yōu)于較小氣水比3∶1。在4個反應柱中2#柱污染物綜合去除效果最好，說明BAF填料采用沸石和礫石按1∶1均勻填充方式更合理；4個反應柱對TP的去除效果未達標。

（2）1#、2#、3#號柱的OTU數(shù)量差異很小，分別為1 533個、1 550個和1 530個，且共有OTU數(shù)為1 390個，說明3個柱的微生物種類數(shù)量基本相同。其中2#柱的OTU數(shù)量最多，說明BAF填料采用沸石和礫石按1∶1均勻混合后填充的結(jié)構(gòu)有利于微生物生長。2#柱特有的OTU數(shù)為158個，遠大于4#柱特有的OTU數(shù)61個，說明相同填料結(jié)構(gòu)時5∶1氣水比更能增加微生物的種類；4個反應柱微生物豐富度均很高，微生物多樣性相差不大。

（3）1#、2#、3#柱的優(yōu)勢菌群主要有變形菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門等6種，不同高度的優(yōu)勢菌群種類相同，但在數(shù)量上有所差異。在3個反應柱中只有變形菌門中可能含有聚磷菌，也是除磷效果差的原因之一，需要根據(jù)出水再利用要求采取深度處理措施。

總之，本文在氣水比5∶1條件下BAF采用的填料及不同填充結(jié)構(gòu)合理，微生物群落數(shù)量及優(yōu)勢菌基本相同，有機物和氨氮去除效果達標，采用多種填料混合填充或同種填料選用較大粒徑有利于提高微生物多樣性，在填料結(jié)構(gòu)相同條件下采用較大氣水比可有效提高BAF處理效果。

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