陳 薛，張 賀，師長(zhǎng)宏*

(1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610500； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)

隨著高通量測(cè)序、微陣列芯片等技術(shù)在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，人們對(duì)惡性腫瘤的進(jìn)展和分子驅(qū)動(dòng)機(jī)制有了深入了解，在人源性腫瘤組織異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型的基礎(chǔ)上，采用原位移植的方法建立了人源性腫瘤組織原位異種移植(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)模型，觀察腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移特征。PDOX模型更好地保留了患者腫瘤的組織病理、基因組特性及藥物敏感性，并且可以作為患者“替身”來(lái)研究藥物反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化。

1 PDOX模型的研究概況

異質(zhì)性是腫瘤的基本特征，原發(fā)瘤中只用少數(shù)具有轉(zhuǎn)移潛能的瘤細(xì)胞能夠從原發(fā)灶脫落，突破周?chē)|(zhì)屏障，侵入血管或淋巴管，遷移、黏附于適宜部位，最終在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶[1-2]。良好的轉(zhuǎn)移模型一方面要保持原發(fā)瘤的生物學(xué)特性，另一方面要模擬腫瘤局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這一過(guò)程。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生與移植瘤原位細(xì)胞微環(huán)境及轉(zhuǎn)移器官的微環(huán)境密切相關(guān)[3]。原位移植是目前廣泛接受的腫瘤異種移植方法，可以更好保存腫瘤原有組織結(jié)構(gòu)，其惡性行為的表達(dá)更接近于臨床。常規(guī)制備轉(zhuǎn)移模型的方法是使用具有高轉(zhuǎn)移潛能的傳代腫瘤細(xì)胞系直接原位或異位移植，方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)移發(fā)生率低；或是在皮下形成實(shí)體瘤再行原位移植可提高轉(zhuǎn)移發(fā)生率。但細(xì)胞系長(zhǎng)期體外培養(yǎng)喪失腫瘤的異質(zhì)性，易造成原發(fā)瘤某些基因型和間質(zhì)成分的缺失，影響腫瘤生物學(xué)特性的表達(dá)，發(fā)生轉(zhuǎn)移概率不確定，與臨床實(shí)際存在較大差別[4]。

將人體新鮮的腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的PDX模型，較好地保持了原發(fā)瘤的異質(zhì)性[5-6]。但該類(lèi)模型主要移植于裸鼠皮下，很難發(fā)生與臨床相近的轉(zhuǎn)移特征。通過(guò)手術(shù)將腫瘤組織移植到與原發(fā)部位相應(yīng)動(dòng)物器官的原位移植可提供適合腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)環(huán)境[7]，有利于原發(fā)腫瘤的基因和生物學(xué)特性的表達(dá)，維持腫瘤的異質(zhì)性；由于移植部位血供豐富，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。已證實(shí)PDOX模型可更好地模擬患者腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)組分，包括免疫細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、周細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)以及豐富的血管、淋巴管，與皮下移植相比，PDOX模型更客觀、準(zhǔn)確地模擬人體腫瘤的體內(nèi)演進(jìn)過(guò)程，易形成與臨床腫瘤相似的轉(zhuǎn)移特征。

2 PDOX模型的建立方法

PDOX模型的建立可分為皮下移植后原位傳代和組織塊直接移植兩種方法。前者應(yīng)用最廣泛，主要是提高單位體積內(nèi)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，從而提高原位移植成功率。例如，Choi等[8]的一項(xiàng)研究探討了胃癌勞倫分型(Lauren classification)與腫瘤細(xì)胞百分比對(duì)移植成功率的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于彌漫型胃癌中的腫瘤細(xì)胞分散在基質(zhì)組織中，單位面積內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量很低[彌漫型(24.4±21.4)%，腸道型(47.0±28.7)%，其他類(lèi)型(41.0±26.3)%，P=0.001]使得它異種移植成功率大大降低。因此，將患者來(lái)源的腫瘤組織樣本首先接種于小鼠皮下生長(zhǎng)并傳代，在一定的傳代次數(shù)內(nèi)不僅能夠維持患者原發(fā)腫瘤的重要基本特征，還能夠擴(kuò)增患者原發(fā)腫瘤組織，以獲得足夠數(shù)量和高質(zhì)量的腫瘤材料用于原位移植。

采用臨床腫瘤標(biāo)本直接原位移植雖然可以提供與原發(fā)腫瘤相似的微環(huán)境，但成功率低，影響因素較多，特別是一些消化道腫瘤，因其原發(fā)于消化道腔內(nèi)，其原位移植的成功率進(jìn)一步降低[9]。主要原因是：①臨床標(biāo)本中單位體積內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量有限；②原位移植可接受的瘤組織較??；③手術(shù)操作難度大。盡管如此，這種組織移植更能重現(xiàn)患者原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性，并在小鼠連續(xù)傳代的早期階段(通常3～5代)較好地保持了原發(fā)瘤遺傳學(xué)和組織學(xué)復(fù)雜性，從而更加準(zhǔn)確地顯示出患者的臨床實(shí)際。

3 PDOX模型的優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 PDOX模型的優(yōu)點(diǎn)

3.1.1 保留原發(fā)腫瘤的基因特征

Braekeveldt等[10-11]對(duì)建立的神經(jīng)母細(xì)胞瘤PDOX模型進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果顯示MYCN擴(kuò)增和17q增加，保留了臨床相應(yīng)患者重要的基因特征。Zhang等[12]從建立的胃癌異種移植模型中觀察到其與親本腫瘤間FGFR2和MET基因擴(kuò)增的高度相似性。另一項(xiàng)小鼠腎包膜下原位移植患者源性腎細(xì)胞癌組織的研究中，所有成功的移植物中癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至臨床相關(guān)位點(diǎn)(包括骨)，且移植物和患者原發(fā)腫瘤之間具有可比較的全基因表達(dá)。給予伊舒替尼治療小鼠，與對(duì)照組相比，也顯示出了與臨床患者相似的反應(yīng)[13]。多項(xiàng)研究表明PDOX模型能夠保持患者腫瘤大多數(shù)的關(guān)鍵基因，個(gè)體化治療應(yīng)用前景廣泛。

3.1.2 保存腫瘤患者染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

Braekeveldt等[14]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)PDOX模型保留了腫瘤微環(huán)境標(biāo)志物及患者重要的腫瘤細(xì)胞分子特征，例如PDOX#5保留神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)志物CD56/NCAM、酪氨酸羥化酶、嗜鉻粒蛋白A和突觸泡蛋白的表達(dá)以及大多數(shù)染色體畸變(包括1p缺失和17q增加)，并使用NCAM免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining，IHC staining)檢測(cè)到腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散至肺和肝。Zhao等[15]對(duì)從人成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(即髓母細(xì)胞瘤)和膠質(zhì)瘤PDOX模型中分離的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行光譜核型分析檢測(cè)到染色體畸變，并在匹配的單層培養(yǎng)物中保持82.0%的數(shù)值變化和82.4%的結(jié)構(gòu)異常。魏強(qiáng)和脫朝偉等[16-18]分別建立了胰腺癌、直腸癌和肝癌原位移植模型，他們發(fā)現(xiàn)這些移植瘤的解剖學(xué)及組織病理學(xué)與人類(lèi)原發(fā)腫瘤相似，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定正常組織細(xì)胞及直腸癌、肝癌移植瘤細(xì)胞中的DNA含量，并進(jìn)行了染色體檢查，結(jié)果顯示細(xì)胞DI值(DNA index)為1.57～1.61，均為異倍體，DNA倍體水平和染色體核型的特點(diǎn)與原發(fā)腫瘤相一致，這些都為研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，篩選腫瘤標(biāo)志物及靶向治療提供了基礎(chǔ)。

3.1.3 保留原發(fā)瘤的微血管、基質(zhì)成分及相互作用

腫瘤基質(zhì)通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的增殖浸潤(rùn)、遷徙轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、腫瘤干細(xì)胞特性和耐藥性等調(diào)控腫瘤的發(fā)生、惡變及轉(zhuǎn)移。Boone等[19]研究發(fā)現(xiàn)雖然異位和原位卵巢癌異種移植模型都顯示了與腫瘤患者相似的組織學(xué)、基因?qū)W等特征，但在PDOX模型中腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移模式和腹水的發(fā)展與人體更為相似。Hoffman[20]描述了HER2陽(yáng)性宮頸癌的PDOX模型在裸鼠中轉(zhuǎn)移，包括腹膜、肝、肺以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，反映了患者原發(fā)腫瘤的轉(zhuǎn)移模式，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明裸鼠中的原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤具有與患者原發(fā)瘤相似的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。另外他們還建立了結(jié)腸癌的患者源性原位異種移植模型，與原位移植細(xì)胞系相比，原位瘤組織模型中可觀察到更大程度的轉(zhuǎn)移。Igarashi等[21]建立了成人橫紋肌肉瘤的皮下及原位模型，研究表明原位模型為惡性，與人原發(fā)腫瘤更相似，且腫瘤僅在PDOX模型中進(jìn)行侵襲，這些結(jié)果表明在異種移植模型中原位和皮下具有不同的微環(huán)境，腫瘤的生長(zhǎng)需要適當(dāng)?shù)哪[瘤微環(huán)境以模擬患者中的轉(zhuǎn)移侵襲行為。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明, 原位移植是邁向腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和反映患者藥物反應(yīng)的個(gè)體化模型的重要一步。

3.1.4 移植位點(diǎn)與化療反應(yīng)相關(guān)

受體器官的微環(huán)境可能會(huì)影響特定的治療反應(yīng)，原位移植模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)臨床患者的疾病預(yù)后，并為患者篩選出最合適的個(gè)體化治療方案，使患者從中獲益。分析原因主要是腫瘤微環(huán)境的一些成分，如血管生成、免疫細(xì)胞運(yùn)輸、以及基質(zhì)分泌的細(xì)胞外因子等是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物反應(yīng)的重要影響因素[22-24]。例如， Wilmanns等[25]建立原位、皮下及肝轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的小鼠模型，對(duì)比腫瘤生長(zhǎng)情況及其對(duì)多柔比星的敏感性差異，發(fā)現(xiàn)用多柔比星處理這些模型具有器官部位特異性反應(yīng)，皮下腫瘤比盲腸壁或肝臟中生長(zhǎng)的腫瘤對(duì)多柔比星更加敏感，這可能是由于皮下腫瘤的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)活性高于肝癌和盲腸腫瘤，從這些組織中收集的腫瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)顯示P-糖蛋白表達(dá)與其對(duì)多柔比星的敏感性成反比。Hiroshima等[26]同時(shí)建立了人類(lèi)宮頸癌皮下PDX模型和PDOX模型，并比較了二者在組織學(xué)與藥物反應(yīng)等方面的差異，他們應(yīng)用恩替諾特分別處理這兩種小鼠模型，結(jié)果顯示，藥物對(duì)皮下PDX移植瘤無(wú)生長(zhǎng)抑制作用，而在PDOX模型中，使用恩替諾特顯著降低了轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。已有多項(xiàng)研究表明腫瘤生長(zhǎng)所處的器官微環(huán)境能夠直接影響腫瘤的生物學(xué)特性，在PDOX模型中生長(zhǎng)的腫瘤具有差異化學(xué)敏感性[27-29]。

3.2 PDOX模型存在的問(wèn)題

盡管PDOX具有顯著的優(yōu)勢(shì)，但是依然存在一些局限性，其中最主要的問(wèn)題是人類(lèi)腫瘤基質(zhì)成分會(huì)逐步被小鼠基質(zhì)所取代[30]，從而導(dǎo)致小鼠與人類(lèi)之間藥物代謝方面的差異，影響基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果向臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化，通常這種基質(zhì)被取代的速率在3～5代之間。然而，不同類(lèi)型的腫瘤，甚至同一腫瘤的不同亞型的人類(lèi)基質(zhì)被取代的速率存在一定差異。例如，一項(xiàng)宮頸癌原位移植模型的研究顯示至少經(jīng)過(guò)5次傳代時(shí)，傳代腫瘤與患者來(lái)源腫瘤相比，具有相似的基質(zhì)成分、組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)[31]。乳腺癌腫瘤在4～8次傳代后，仍保留了原始腫瘤的主要特征[32]。另外在APC或p53突變中的結(jié)腸直腸癌異種移植模型中，連續(xù)傳代8次時(shí)觀察到的染色體呈現(xiàn)相反的變化結(jié)果[33]。在一項(xiàng)乳腺癌原位移植模型的報(bào)道中詳細(xì)描述了多次傳代后造成人源性基質(zhì)成分的喪失，研究者對(duì)移植模型中的白細(xì)胞，分別用小鼠和人的CD45特異性抗體染色，結(jié)果顯示移植物中CD45為鼠源性白細(xì)胞；同樣的，研究者在該模型中檢測(cè)到鼠源性的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而幾乎未檢測(cè)到人源性細(xì)胞[32]。另外，PDOX模型在每一次傳代過(guò)程中所發(fā)生的基質(zhì)成分變異程度尚未可知，且其發(fā)生變化的確切時(shí)間尚不清楚。而在傳代過(guò)程中丟失的組分，可能會(huì)對(duì)后期的藥物治療產(chǎn)生影響。因此，一般認(rèn)為低傳代數(shù)( < 10代)的異種移植模型能夠保持原發(fā)腫瘤的組織病理特征和基因完整性，是用于藥物檢測(cè)的理想模型[22]。

由于存在物種差異，移植到小鼠體內(nèi)的人類(lèi)腫瘤與其相應(yīng)的臨床患者相比，生長(zhǎng)速度較快，且人與小鼠的藥效動(dòng)力學(xué)存在差異[34]。PDOX模型的另外一個(gè)局限性是來(lái)源于患者原發(fā)腫瘤的樣本之間也存在個(gè)體差異，其是否發(fā)生轉(zhuǎn)移與樣本自身的浸潤(rùn)侵襲能力相關(guān)。PDOX模型是否建模成功往往需要數(shù)月的時(shí)間，而對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)患者是否能夠獲得足夠的生存時(shí)間從PDOX模型中獲益依然是一個(gè)待解決的問(wèn)題。

4 總結(jié)

雖然有些腫瘤細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移潛能，但在病人體內(nèi)并未發(fā)生轉(zhuǎn)移，可能是由于及時(shí)手術(shù)阻斷了腫瘤細(xì)胞粘附聚集形成轉(zhuǎn)移灶的途徑。如果將腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠原位，提供與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相適應(yīng)的微環(huán)境，不僅可以有效表達(dá)原發(fā)瘤的生物學(xué)特性，而且可充分展現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能，這是PDOX模型所特有的優(yōu)勢(shì)。由于腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移的發(fā)生受諸多因素影響，特別是免疫缺陷小鼠的微環(huán)境和人體內(nèi)環(huán)境尚不完全相同，原位移植瘤可能在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面與原發(fā)瘤存在一定的差別，原位移植并不能完全保證轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，建立個(gè)體化的轉(zhuǎn)移模型必須要先通過(guò)組織形態(tài)和腫瘤相關(guān)基因的分析，確認(rèn)原位移植瘤與原發(fā)瘤一致后才能進(jìn)行轉(zhuǎn)移模型篩選，同時(shí)考慮到轉(zhuǎn)移模型發(fā)生的比例，必須要有充足的PDX模型提供篩選。

同時(shí)，由于建立PDOX模型使用免疫缺陷小鼠，不能重現(xiàn)免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，目前已有研究通過(guò)移植人體免疫組織成功創(chuàng)建了“人源化PDX”小鼠模型[35-36]，推進(jìn)了其在免疫治療方面的發(fā)展。若將目前免疫治療中所使用的Anti-PD[37]和CAR-T療法[38]應(yīng)用于人源化PDOX模型，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，將會(huì)有良好的預(yù)期效果。

總之，PDOX模型在腫瘤研究中發(fā)揮了重要作用，使用PDOX模型所進(jìn)行的研究幾乎都顯示出了改善臨床效果的預(yù)期性。PDOX模型可以鑒定腫瘤生物標(biāo)記物，篩選敏感藥物，并根據(jù)患者對(duì)某種特定治療的反應(yīng)和預(yù)后的不同，將患者分為不同亞群，開(kāi)展個(gè)體化治療。目前多個(gè)機(jī)構(gòu)已經(jīng)創(chuàng)建了異種移植模型的數(shù)據(jù)庫(kù)，共享異種移植模型的信息與研究結(jié)果，使更多的患者獲益[39-40]。隨著PDOX模型的不斷改進(jìn)，將會(huì)產(chǎn)生更好的臨床轉(zhuǎn)化效果。

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