區(qū)錦瑩，李 嬋，李漢成，周玉婷，羅超華，莫志賢

(南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510515)

外泌體是一種直徑約20～150 nm并具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)真核細(xì)胞均能分泌外泌體，廣泛存在于多種體液中，如血液、腦脊髓液、尿液、唾液等。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、分化、再生以及神經(jīng)元谷氨酸能突觸的可塑性，且作為天然遞送載體，可穿越血腦屏障靶向傳遞藥物或核酸類(lèi)物質(zhì)，發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用[1]。大多中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)疾病形成機(jī)制尚不明確，且治療手段的相對(duì)匱乏，因而外泌體在CNS生理和病理學(xué)形成機(jī)制及其內(nèi)含物RNAs分子功能學(xué)等方面，成為了目前科研及臨床診治研究的熱點(diǎn)之一。

1 外泌體的來(lái)源、內(nèi)容物RNAs及作用方式

1.1外泌體的形成在CNS中，大多數(shù)的細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等均可形成及分泌外泌體[2]。首先，細(xì)胞膜內(nèi)出芽形成早期內(nèi)體(early endosomes，EEs)，EEs二次出芽形成管腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)。這些包含多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的ILVs，在與細(xì)胞膜融合后，釋放MVBs到細(xì)胞外基質(zhì)中，形成外泌體[3]。在ILVs形成過(guò)程中，內(nèi)涵體分選復(fù)合物(endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT)通過(guò)依賴與非依賴途徑，促進(jìn)EEs內(nèi)陷形成ILVs及運(yùn)輸內(nèi)容物進(jìn)入ILVs，最終形成包含內(nèi)容物的外泌體[4]。

1.2外泌體內(nèi)容物RNAs外泌體含有多種短鏈RNAs和長(zhǎng)鏈RNAs，其RNAs種類(lèi)及含量隨細(xì)胞狀態(tài)變化而發(fā)生改變。根據(jù)2015年9月最新版Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道，已從33種外泌體中發(fā)現(xiàn)27 642種mRNAs和4 934種miRNAs(http://www.microvesicles.org/)。除此之外，外泌體中還發(fā)現(xiàn)含有病毒RNA、tRNA片段、小核RNA、核仁小RNA、piRNA、非編碼RNAs (ncRNAs)等[5]。這些外泌體所包含的RNAs被稱為外泌體源性RNAs(exosomes shuttle RNAs，es-RNAs)。體外研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性mRNA(es-mRNA)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞后，通過(guò)翻譯蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)功能，參與多種生物學(xué)進(jìn)程如免疫反應(yīng)、腫瘤、病毒感染等。外泌體源性miRNA(es-miRNA)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞后，則通過(guò)沉默靶基因發(fā)揮RNA干擾作用，在轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控基因表達(dá)[6]。盡管已有研究報(bào)道es-RNAs可調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，但是其中的分子機(jī)制仍未闡述清楚。以es-miRNAs為例，在動(dòng)物細(xì)胞中，雙鏈前體miRNA(miRNA precusor, pre-miRNA)經(jīng)Dicer剪切后成為雙鏈成熟miRNA/miRNA*，并隨即整合進(jìn)入AGO2-RISC組裝復(fù)合體(AGO2-RISC-loading complex，AGO2-RLC)，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，其后RISC與靶基因mRNA特異性結(jié)合后誘導(dǎo)基因沉默。然而，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的單鏈成熟miRNAs如何與內(nèi)源性AGO蛋白結(jié)合形成RISC，這一機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。而miRNAs是以單鏈成熟、雙鏈成熟miRNA/miRNA*，還是RISC等形式存在外泌體中，目前也鮮有報(bào)道，這些問(wèn)題仍需解答以說(shuō)明外泌體是有效RNAs的載體。

1.3外泌體的作用方式細(xì)胞釋放外泌體后，后者通過(guò)與細(xì)胞表面分子的直接作用、與細(xì)胞膜融合以及胞吞等方式，與鄰近或遠(yuǎn)距離的受體細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的行為。與受體細(xì)胞接觸后，外泌體的內(nèi)容物或降解或釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而進(jìn)入胞質(zhì)的內(nèi)容物則進(jìn)一步被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞膜上，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。在此過(guò)程中，外泌體與受體細(xì)胞的相互識(shí)別是外泌體發(fā)揮作用的重要前提，但是目前有關(guān)兩者相互識(shí)別的作用機(jī)制還知之甚少。Purushothaman等[8]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素可作為外泌體的識(shí)別受體，而來(lái)自骨髓瘤細(xì)胞的外泌體，其表面的纖連蛋白與受體細(xì)胞的硫酸乙酰肝素結(jié)合，介導(dǎo)了外泌體-細(xì)胞相互作用。另有Edgar等[9]報(bào)道，外泌體通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)膜表面tetherin蛋白結(jié)合而聚集在Hela細(xì)胞表面，而敲除tetherin后，與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的外泌體數(shù)量下降了80%，并伴隨游離外泌體數(shù)量的增加。這些研究表明，不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體與靶細(xì)胞的識(shí)別機(jī)制可能不盡相同，這也可能是外泌體具有靶向性的原因之一。

2 外泌體源性RNAs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理活動(dòng)的影響

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，感覺(jué)神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、中間神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間需要通過(guò)物質(zhì)交流來(lái)發(fā)揮功能和維持細(xì)胞的完整性，而參與物質(zhì)傳遞的外泌體則完善了CNS細(xì)胞間信號(hào)交流網(wǎng)絡(luò)，在促進(jìn)神經(jīng)元存活、介導(dǎo)免疫反應(yīng)、改變突觸可塑性等方面發(fā)揮重要功能。2005年，Marzesco等[10]首次報(bào)道，在大腦早期發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)外泌體，并在胚胎期小鼠的神經(jīng)管腔內(nèi)液中發(fā)現(xiàn)外泌體(50～80 nm)及其他胞外囊泡(600 nm)，兩者均含有干細(xì)胞標(biāo)志分子prominin-1(CD133)，提示神經(jīng)干細(xì)胞可能通過(guò)胞外囊泡丟棄prominin-1，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的形成。隨后，Lachenal等[11]觀察到體外培養(yǎng)的成熟大腦皮層及海馬神經(jīng)元亦能釋放外泌體，且其釋放受胞膜動(dòng)作電位去極化和谷氨酸能突觸活動(dòng)的調(diào)節(jié)，表明外泌體可能參與CNS的正常生理活動(dòng)。Feliciano等[12]近年來(lái)在人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的胚胎腦脊液中發(fā)現(xiàn)外泌體，這些外泌體含有miR-124、125 b、17～5、92 b、93、92 a、181 a、99 b、Let-7等，與神經(jīng)干細(xì)胞共孵育后，通過(guò)活化IGF-mTORC1信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。Oh等[13]通過(guò)微流體示蹤法觀察到外泌體的釋放、轉(zhuǎn)移和攝取的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的miR-193 a通過(guò)阻斷增殖相關(guān)基因，促進(jìn)受體細(xì)胞——神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)育成為神經(jīng)元細(xì)胞。

CNS是一個(gè)龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，突觸作為其中的傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)在大腦功能中起著極其重要的作用。外泌體作為神經(jīng)細(xì)胞相互之間交流的途徑之一，不但參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的形成與分化，還參與調(diào)控突觸的可塑性，且可能是突觸順行與逆行信息傳導(dǎo)的潛在機(jī)制。Goldie等[14]發(fā)現(xiàn)，人源神經(jīng)母細(xì)胞經(jīng)K+誘導(dǎo)去極化處理后，樹(shù)突部位釋放富含miRNA的外泌體，經(jīng)突觸攝取后，外泌體miR-638、-149*、 -4281、let-7e靶向調(diào)控突觸功能相關(guān)mRNA，涉及調(diào)控前突觸、后突觸的分布密度和神經(jīng)元突觸的功能與結(jié)構(gòu)的可塑性。Morel 等[15]還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞釋放外泌體介導(dǎo)miR-124a的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT1的表達(dá)，這可能是神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞信息交流調(diào)控突觸活性的新機(jī)制，可為研發(fā)治療高表達(dá)GLT1所致疾病提供新思路。

3 外泌體源性RNAs參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病

外泌體攜帶疾病相關(guān)蛋白，如β-樣淀粉蛋白、α-突觸核蛋白、TDP-43等，造成“毒性”蛋白的散布，從而導(dǎo)致阿爾茨海默病 (Alzheimer’s disease, AD)、帕金森(Parkinson’s disease, PD)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等疾病的形成和傳播[16]。目前就外泌體方面，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制大多集中在研究疾病相關(guān)蛋白。盡管先前有報(bào)道，神經(jīng)退行性疾病病患血液及腦脊液中miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，但是研究大多在尋找簡(jiǎn)單可靠的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)診斷神經(jīng)退行性疾病，而就es-RNAs參與疾病的發(fā)展方面，相關(guān)研究還相對(duì)較少。目前，Sarkar等[17]報(bào)道，AD患者及轉(zhuǎn)基因AD小鼠相關(guān)腦區(qū)內(nèi)高度表達(dá)miR-34a，神經(jīng)元釋放內(nèi)含miR-34a的外泌體，被鄰近神經(jīng)元細(xì)胞攝取后，miR-34a靶向阻斷SIRT1和ADAM10基因，導(dǎo)致β-樣淀粉蛋白的形成與沉積，提示神經(jīng)元之間通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)疾病相關(guān)RNAs，以另一種方式引起AD“毒性”蛋白的散布，引發(fā)神經(jīng)毒性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致AD疾病的形成與發(fā)展。另有Hu等[18]發(fā)現(xiàn)，嗎啡可加重HIV病毒反式激活蛋白Tat介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗎啡使HIV Tat感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體內(nèi)miR-29b含量增加，神經(jīng)元細(xì)胞攝取該外泌體后，胞內(nèi)miR-29b含量增加，引起神經(jīng)保護(hù)因子——血小板源生長(zhǎng)因子PDGF-B表達(dá)水平的降低，從而使神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)生存率下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而干預(yù)外泌體的形成可逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，提示es-RNAs可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞損傷，促進(jìn)神經(jīng)損傷性疾病的形成。

腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的形成與發(fā)展具有重要作用，而外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的RNAs常常能改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而誘導(dǎo)增殖與轉(zhuǎn)移。惡性膠質(zhì)瘤是一種極難治愈的高度惡性腦內(nèi)腫瘤，van der Vos等[19]發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤釋放外泌體介導(dǎo)miR-451與miR-21轉(zhuǎn)移至小膠質(zhì)細(xì)胞及單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中，從而下調(diào)c-Myc mRNA的表達(dá)并釋放免疫抑制因子，保護(hù)腫瘤不受免疫攻擊。另外，Zhang等[20]的研究顯示，大腦轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞分泌因子使星型膠質(zhì)細(xì)胞聚集并發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)化，并促使后者分泌內(nèi)含miR-19a的外泌體。腫瘤細(xì)胞攝取該外泌體后，引起胞內(nèi)抑癌基因PTEN表達(dá)水平的降低，從而導(dǎo)致NF-κB依賴的趨化因子CCL2釋放增加，CCL2隨后招募IBA1+骨髓細(xì)胞刺激腫瘤細(xì)胞增殖，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。這些研究表明，在腦部腫瘤發(fā)展與增殖過(guò)程中，es-RNAs可改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而維持腫瘤在體內(nèi)的生存與發(fā)展。

4 外泌體源性RNAs在疾病的診斷及治療的應(yīng)用前景

研究發(fā)現(xiàn)，在多種中樞神經(jīng)疾病中，患者腦組織與體液miRNAs表達(dá)譜發(fā)生明顯變化。對(duì)比不易取得的腦部病理組織標(biāo)本，外泌體較易獲取，且能穩(wěn)定存在于體液中，因而es-miRNAs作為潛在的診斷中樞神經(jīng)疾病的標(biāo)記分子，極大地吸引著研究者的興趣。Riancho等[21]報(bào)道，與正常對(duì)照相比，AD患者腦脊液中es-miRNAs表達(dá)譜發(fā)生較大變化，其中15個(gè)miRNAs的明顯發(fā)生改變。50%與70%的正常對(duì)照樣品中分別檢測(cè)出miR-9-5p與miR-598，而所有的AD患者樣品中均沒(méi)有檢測(cè)出來(lái)，提示miR-9-5p與miR-598可能是AD潛在的標(biāo)記分子。而Cheng等[22]報(bào)道，使用商用試劑盒提取血液外泌體后，對(duì)es-miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，通過(guò)差異表達(dá)的es-miRNAs區(qū)分AD患者與正常對(duì)照，且該診斷體系的敏感度和特異度分別為87%和77%，提示該方法對(duì)AD有較好的診斷價(jià)值。

外泌體作為一種納米級(jí)別的胞外囊泡，能穿透血管壁和血腦屏障，且內(nèi)源性外泌體能躲避機(jī)體免疫反應(yīng)，不良反應(yīng)較少，因而具有成為基因治療的新載體的潛力[23]。Didiot等[24]報(bào)道，外泌體可作為寡核苷酸運(yùn)載體用于治療亨廷頓疾病。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87)與疏水修飾的hsiRNAs孵育后，分泌裝載hsiRNAs的外泌體，該es-hsiRNAs可被小鼠原代皮層神經(jīng)元攝取，從而促進(jìn)亨廷頓疾病mRNA和蛋白的劑量依賴性沉默。而通過(guò)注射es-hsiRNAs到小鼠紋狀體中，可致大腦兩側(cè)分布es-hsiRNAs，并促使兩側(cè)的亨廷頓病mRNA高達(dá)35%的明顯沉默。另外，Liu等[25]報(bào)道，293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染了狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RVG)與阿片樣物質(zhì)受體siRNA(MOR siRNA)后，分泌裝載MOR siRNA的外泌體(es-MOR siRNA)，且外泌體膜上表達(dá)RVG，能穿越血腦屏障，與神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)MOR siRNA進(jìn)入成神經(jīng)瘤細(xì)胞，明顯下調(diào)胞內(nèi)MOR mRNA與蛋白水平。小鼠靜脈注射es-MOR siRNA后，大腦皮層、海馬、下丘腦和紋狀體中均有分布MOR siRNA，明顯下調(diào)腦內(nèi)MOR mRNA與蛋白水平，且能明顯減少嗎啡誘導(dǎo)的條件位置性偏愛(ài)(conditioned place preference, CPP)時(shí)間，提示es-MOR siRNA可用于嗎啡的復(fù)吸治療。這些研究均顯示，經(jīng)修飾的外泌體裝載某些治療“藥物”，傳遞到腦部后可實(shí)現(xiàn)廣泛分布，進(jìn)而發(fā)揮治療作用，為多種中樞神經(jīng)疾病提供新的治療方向。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，外泌體源性RNAs，尤其是es-miRNAs在調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生理活動(dòng)、神經(jīng)元的分化發(fā)育、突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。盡管目前研究發(fā)現(xiàn)外泌體轉(zhuǎn)移的miRNAs在轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控受體細(xì)胞的基因表達(dá)，并參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的形成與發(fā)展。但是這些研究大多是在體外完成，包括體外培養(yǎng)細(xì)胞以及分離其外泌體，繼而在體外或體內(nèi)觀察該培養(yǎng)細(xì)胞的外泌體對(duì)受體細(xì)胞的作用。那么在體內(nèi)，如何通過(guò)監(jiān)測(cè)及追蹤某一體內(nèi)細(xì)胞分泌的外泌體，進(jìn)而觀察它對(duì)受體細(xì)胞的影響，且其轉(zhuǎn)移的RNAs的量是否能使受體細(xì)胞的表型發(fā)生“質(zhì)的改變”，這些問(wèn)題仍需進(jìn)一步的探討。另一方面，外泌體因包裹疾病標(biāo)記分子，且能穩(wěn)定存在于體液中，極大地推動(dòng)了基于外泌體的疾病診斷試劑盒以及新型治療工具的研究與發(fā)展。但是，CNS疾病相關(guān)細(xì)胞分泌的外泌體在腦脊液及血液中含量較低，且目前提取方法所得外泌體得率及純度較低，使得以生物標(biāo)記分子es-miRNAs為基礎(chǔ)的疾病診斷研究重現(xiàn)性較差，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，外泌體作為一種新型的非細(xì)胞治療方法，既可避免細(xì)胞治療帶來(lái)的安全隱患，又可包裹基因藥物穿越血腦屏障，因而在治療CNS疾病中有良好的應(yīng)用前景。但是，目前主要提取外泌體的方法仍是傳統(tǒng)的超速離心法，操作時(shí)長(zhǎng)，步驟繁瑣，因此，仍需要開(kāi)發(fā)快速有效的分離方法，以獲取大量且純度較高的外泌體，以適應(yīng)研究需求。

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