吳 迪，何小奪，陳 健，丁玉川(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中美神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100053)

卒中是成人致死、致殘的主要原因。近年來，已有1000多種神經(jīng)保護(hù)藥物在細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物模型上證實(shí)有效，但轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中卻均以失敗告終[1]。其中重要的因素是人類與嚙齒類動(dòng)物存在巨大的種屬差異，而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(nonhuman primates，NHPs)在組織結(jié)構(gòu)、免疫、生理和代謝等方面與人類高度近似，因此美國卒中治療專業(yè)委員會(huì)建議，新的神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前，在NHPs模型上進(jìn)行臨床前研究[2 - 3]。

大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)是人類腦缺血的多發(fā)部位，絕大多數(shù)的腦缺血模型都是針對(duì)MCA展開的。NHPs局部腦缺血模型的建立方法可大致分為血管內(nèi)介入方法和開顱手術(shù)方法，其中血管內(nèi)介入方法的模型制備過程與腦卒中的發(fā)病過程非常相似，因此值得特別關(guān)注[4]。按照血管再通情況，NHPs局部腦缺血模型可分為缺血再灌注和永久性缺血兩類。本文將就血管內(nèi)介入方法制備NHPs局部腦缺血模型的最新進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和分析。

1 永久性腦缺血模型

永久性缺血模型是指制備局部腦缺血模型后不能或不必進(jìn)行干預(yù)，不會(huì)出現(xiàn)自發(fā)再灌注的方法。制備NHPs永久性缺血模型所用的栓子包括線栓、聚苯乙烯球、黏合劑等。通過微導(dǎo)管將上述栓子注射到NHPs的MCA，栓子閉塞血管區(qū)域?qū)⒊霈F(xiàn)局部腦缺血，并且即使給予溶栓藥物也不會(huì)實(shí)現(xiàn)再通[5 - 7]。該方法具有目標(biāo)血管閉塞完全，梗死灶明確等優(yōu)勢(shì)。

最初研究采用黏合劑作為栓塞物質(zhì)，通過微導(dǎo)管將黏合劑注射到NHPs的MCA區(qū)域，隨后影像學(xué)驗(yàn)證黏合劑閉塞MCA分支，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實(shí)出現(xiàn)梗死灶。但是，該研究發(fā)現(xiàn)梗死灶大小(3.38～20.5 mL)差別很大，提示注射的黏合劑并未在注射部位局部閉塞血管[5]。因此，閉塞部位的不確定性導(dǎo)致模型癥狀和梗死灶的不均一性。此后研究中，Zhang等[6]采用絲線作為栓塞物質(zhì)，通過微導(dǎo)管將絲線送至MCA分支M2段的遠(yuǎn)端，他們發(fā)現(xiàn)恒河猴腦缺血模型梗死灶較小，而且模型出現(xiàn)對(duì)側(cè)神經(jīng)功能缺損的癥狀。為了更好的控制側(cè)支代償血流的作用，Tong等[7]采用絲線作為栓塞物質(zhì)，通過微導(dǎo)管將絲線送至MCA分支M3段，而后撤出微導(dǎo)管至M1段，在此置入絲線。該研究發(fā)現(xiàn)，通過該方法可以降低側(cè)支血流對(duì)于梗死灶的影響，梗死灶位置和大小相對(duì)恒定[7]。在永久性缺血模型中，通過微導(dǎo)管輔助，栓塞物質(zhì)能夠準(zhǔn)確閉塞MCA分支血管是制備NHPs腦缺血模型的關(guān)鍵。該模型的缺點(diǎn)是由于栓子不是血栓，尚不能進(jìn)行缺血性腦卒中的溶栓、取栓等治療。因此該模型可以很好的誘導(dǎo)局部腦缺血的發(fā)病過程，但是不能模擬干預(yù)過程。

另一種制備NHPs永久性腦缺血的血管內(nèi)介入方法是通過微導(dǎo)管注射微球。Cook等[8]研究發(fā)現(xiàn)，向食蟹猴頸內(nèi)動(dòng)脈注射10個(gè)直徑400 μm聚苯乙烯微球后，成功制備局部腦缺血模型。食蟹猴模型在基底節(jié)和內(nèi)囊區(qū)域出現(xiàn)顯著的梗死灶，出現(xiàn)顯著的對(duì)側(cè)神經(jīng)功能缺損癥狀。但是，注射10個(gè)直徑200 μm聚苯乙烯微球后僅出現(xiàn)輕微神經(jīng)功能缺損癥狀；注射10個(gè)直徑100 μm聚苯乙烯微球未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，即使增加到20個(gè)微球也未出現(xiàn)癥狀[8]。該研究提示，直徑400 μm聚苯乙烯微球可以閉塞食蟹猴MCA的主干，造成相應(yīng)區(qū)域的梗死。另一項(xiàng)研究中，Sato等[9]向食蟹猴頸內(nèi)動(dòng)脈注射直徑50 μm瓊脂糖微球后，模型并未表現(xiàn)局部腦缺血癥狀，MRI檢查顯示NHPs模型表現(xiàn)為腔隙性腦梗死。由于尚不能精確控制微球的閉塞部位，所以這類模型的梗死部位不確定。但是，注射微球所致的局部腦梗死，可以模擬臨床缺血性腦卒中支架置入或取栓治療過程中微栓子脫落而導(dǎo)致腦梗死的病理過程。

2 缺血再灌注模型

隨著介入醫(yī)學(xué)技術(shù)和設(shè)備的快速發(fā)展，更多的研究采用可回收的介入裝置，包括微導(dǎo)管、微球囊、彈簧圈等，制備NHPs缺血再灌注模型。理論上置入上述裝置后可以造成局部腦缺血，撤出裝置后可以實(shí)現(xiàn)血管再通。該模型具有梗死部位、梗死時(shí)程可控、撤出介入裝置后可以實(shí)現(xiàn)再通等優(yōu)點(diǎn)，因此，多項(xiàng)研究采用這類方法。

2.1 微導(dǎo)管方法

采用微導(dǎo)管制備NHPs局部腦缺血模型相對(duì)簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。de Crespigny等[10]將微導(dǎo)管置于食蟹猴MCA的遠(yuǎn)端分支，阻斷局部血流3 h，MRI檢查顯示模型動(dòng)物出現(xiàn)梗死灶。此后，其他研究也采用該方法制備NHPs局部腦缺血模型[11]。但是，de Crespigny等[10]的研究?jī)H報(bào)道模型出現(xiàn)較小的梗死灶(0.3～1.9 mL)，提示微導(dǎo)管并未完全閉塞目標(biāo)血管。此后，Wu等[12]研究采用外徑更大的微導(dǎo)管(Rebar 18)制備NHPs局部腦缺血模型，即使采用相同的閉塞部位和時(shí)間，該研究發(fā)現(xiàn)較大的梗死體積(9.7～20.1 mL)，明顯超出閉塞血管的供血區(qū)域，提示微導(dǎo)管完全閉塞目標(biāo)血管，造成局部血流顯著變化。因此，選擇合適的微導(dǎo)管、最佳的閉塞位置成為該方法制備NHPs模型的關(guān)鍵。

2.2 微球囊方法

運(yùn)用血管內(nèi)神經(jīng)介入技術(shù)將球囊導(dǎo)管置入MCA后，加壓后充盈球囊可以閉塞MCA，釋放壓力后撤出球囊可以實(shí)現(xiàn)再灌注。Gao等[13]采用球囊導(dǎo)管置入的方式，短暫閉塞恒河猴MCA 2 h成功制備缺血再灌注模型，梗死灶主要位于基底節(jié)和內(nèi)囊部位，模型動(dòng)物出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓癥狀。另一項(xiàng)研究采用相似的球囊導(dǎo)管，短暫閉塞狒狒MCA 3 h也成功制備缺血再灌注模型[14]。上述兩項(xiàng)研究表明，球囊導(dǎo)管可以成功制備NHPs缺血再灌注模型。但是，由于上述研究所用球囊導(dǎo)管直徑與NHPs MCA近端直徑接近，因此，球囊導(dǎo)管只能閉塞MCA近端或頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)遠(yuǎn)端血管，梗死灶通常較大，癥狀較重。

2.3 彈簧圈方法

運(yùn)用血管內(nèi)神經(jīng)介入技術(shù)將導(dǎo)管精確置于MCA特定位置后，釋放彈簧圈可以精準(zhǔn)閉塞MCA，解壓彈簧圈后可以實(shí)現(xiàn)局部血流再灌注。Zhang等[15]采用彈簧圈置入方法，短暫閉塞恒河猴MCA的M1段，缺血2 h后收回彈簧圈，實(shí)現(xiàn)再灌注，MRI檢查顯示梗死灶位于基底節(jié)區(qū)域，模型可以長(zhǎng)期存活。Guo等[16]采用相同的方法，短暫閉塞恒河猴M1段2 h后成功制備缺血再灌注模型。Zhao等[17]采用相同的方法，短暫閉塞恒河猴M2段2 h后也可成功制備缺血再灌注模型，與M1段閉塞模型相比，M2段模型的梗死灶較小、癥狀較輕。因此，彈簧圈方法可以精準(zhǔn)控制閉塞部位、閉塞時(shí)程，最終梗死灶大小與閉塞部位直接相關(guān)。

上述三種方法通過介入裝置的置入和撤出，成功模擬血栓形成和溶栓/取栓過程。但是，由于血管介入裝置對(duì)于局部血流和血管壁的影響，可能出現(xiàn)血管痙攣、局部血栓形成等不良反應(yīng)，影響模型制備的一致性。一項(xiàng)研究報(bào)道，采用球囊導(dǎo)管制備NHPs局部腦缺血模型后，雖然撤出球囊導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)MCA的完全再通，但是病理學(xué)結(jié)果顯示，深穿支動(dòng)脈出現(xiàn)局部血栓形成[18]。采用上述方法制備的NHPs缺血再灌注模型，易于控制缺血時(shí)間和或缺血部位，可以實(shí)現(xiàn)血管再通。

3 血栓模型

缺血性腦卒中發(fā)生的主要原因是血栓形成和栓子脫落，而針對(duì)血栓進(jìn)行的化學(xué)溶栓或機(jī)械取栓是目前缺血性腦卒中的主要治療方法[19]。采用血管內(nèi)介入方法制備NHPs局部腦缺血的血栓模型，既可以模擬腦卒中的發(fā)病過程，也可以模擬腦卒中的治療和干預(yù)過程。因此，這種NHPs模型是與腦卒中發(fā)病、治療關(guān)系最密切，也是最具有轉(zhuǎn)化前景的動(dòng)物模型[20]。

早期NHPs血栓模型研究發(fā)現(xiàn)，由于不能精準(zhǔn)控制外源性血栓在MCA的位置，所以梗死灶位置和大小非常不一致。Kito等[21]向食蟹猴MCA注射單條10 cm長(zhǎng)的血栓后成功制備局部腦缺血模型，模型動(dòng)物在基底節(jié)、皮層等部位出現(xiàn)梗死灶，出現(xiàn)行為、意識(shí)、感覺等異常表現(xiàn)。該項(xiàng)研究雖然控制外源性血栓的負(fù)荷量，但是病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，外源性血栓并未完全在注射部位。Gauberti等[22]在結(jié)扎MCA近端和遠(yuǎn)端的基礎(chǔ)上，注射外源性凝血酶誘導(dǎo)局部血栓形成，成功制備恒河猴MCA主干血栓形成的局部腦缺血模型。但是，上述兩項(xiàng)研究均報(bào)道，注射血栓壓力增大后，外源性血栓存在破碎的風(fēng)險(xiǎn)，造成梗死部位的不確定性。Wu等[12]參照嚙齒類動(dòng)物研究中制備白血栓的方法，改進(jìn)NHPs自體血栓制備方法，提高了恒河猴自體血栓的韌性。注射單條血栓后發(fā)現(xiàn)，血栓位于MCA的M1段或M2段，其中M2段血栓閉塞模型可以長(zhǎng)期存活，表現(xiàn)對(duì)側(cè)上肢神經(jīng)功能缺損，但是M1段血栓閉塞模型腦缺血癥狀嚴(yán)重，具有較高的死亡率[12]。

溶栓或取栓治療是急性缺血性腦卒中的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。因此，可以在NHPs血栓模型上模擬溶栓或取栓治療，評(píng)估新型溶栓藥物或設(shè)備。Qureshi等[23]報(bào)道，制備食蟹猴MCA血栓模型后，接受動(dòng)脈給予溶栓藥物(t-PA)治療的模型血管再通比例更高。但是，該研究每組僅納入4只模型動(dòng)物，因此，并未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另一項(xiàng)研究，制備食蟹猴MCA血栓模型后，經(jīng)動(dòng)脈給予尿激酶進(jìn)行溶栓治療，這樣可以降低梗死體積、改善意識(shí)狀態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能[24]。上述研究證明，NHPs血栓模型可以成功模擬缺血性腦卒中的發(fā)病和治療過程，給予溶栓治療后可以降低神經(jīng)功能缺損。

通過血管介入方法制備的NHPs血栓模型具有最接近臨床發(fā)病、治療過程的優(yōu)點(diǎn)，但是血栓模型仍然存在閉塞部位不完全精準(zhǔn)、血栓自溶、血栓延伸等不確定因素，因此，尚需輔助其他方法克服上述缺點(diǎn)[4]。此外，由于NHPs的MCA直徑較小，即使血栓可以閉塞MCA，目前臨床常用的取栓支架尚不能通過NHPs的MCA。因此，制備更小的取栓支架后才能在NHPs血栓模型上進(jìn)行取栓實(shí)驗(yàn)。

4 NHPs模型制備中血流動(dòng)力學(xué)改變

MCA通常是制備NHPs局部腦缺血模型的目標(biāo)血管，同時(shí)MCA閉塞時(shí)間、程度也是關(guān)系模型術(shù)后存活、癥狀輕重的關(guān)鍵因素[25]。由于MCA供血區(qū)域廣泛，同時(shí)發(fā)出豆紋動(dòng)脈等穿支動(dòng)脈，因此，臨床研究發(fā)現(xiàn)，MCA主干閉塞后，患者將發(fā)生“惡性腦梗死”，預(yù)后不良[26]。制備NHPs局部腦缺血模型的研究通常選用青年或中年動(dòng)物，無其他基礎(chǔ)疾病，MCA主干閉塞后，如果沒有良好的側(cè)支循環(huán)，NHPs模型易于死亡。因此，制備NHPs永久性腦缺血模型的研究通常選擇M1段的遠(yuǎn)端或M2段作為閉塞部位，避免閉塞MCA的主干。這樣可以保障MCA主干通暢，避免出現(xiàn)“惡性腦梗死”。NHPs缺血再灌注模型也僅僅閉塞MCA主干2～3 h，之后血管再通，保障MCA主干通暢[4, 27]。其次，血管內(nèi)介入方法所用裝置以及栓子(血栓或其他栓子)，都將顯著影響局部腦血流。上述裝置以及栓子作為外源性異物，都可以觸發(fā)血小板凝集，形成新生血栓，造成模型癥狀加重[28]。因此，采用血管內(nèi)介入方法制備NHPs模型過程中，應(yīng)該特別關(guān)注模型局部腦血流的變化。

5 動(dòng)物倫理問題

NHPs研究應(yīng)該嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，達(dá)到“3R”原則。首先，所用神經(jīng)保護(hù)藥物應(yīng)經(jīng)過細(xì)胞模型、嚙齒類動(dòng)物模型的驗(yàn)證，具有明確顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[25]。其次，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，計(jì)算達(dá)到研究目標(biāo)所需的最少動(dòng)物數(shù)量[29]。最后，在局部腦缺血手術(shù)過程以及后續(xù)治療過程中，選擇最佳的麻醉方式，保障術(shù)中平穩(wěn)，使用陣痛、麻醉藥物，盡量降低模型動(dòng)物的痛苦[30 -31]。

NHPs局部腦缺血模型為基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化和臨床研究提供了重要的研究工具，具有重要意義[32]。因此，根據(jù)不同研究的目標(biāo)和任務(wù)，建立重復(fù)性好、死亡率低且易于控制缺血時(shí)間的NHPs腦缺血模型是關(guān)鍵。

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