黃啟秀 曲延英 姚正培 李夢(mèng)雨 陳全家

?

海島棉枯萎病抗性與類黃酮代謝途徑基因表達(dá)量的相關(guān)性

黃啟秀 曲延英 姚正培 李夢(mèng)雨 陳全家*

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830052

枯萎病是危害海島棉生產(chǎn)的重要因素之一, 研究枯萎病抗性分子機(jī)制將為培育抗病海島棉品種、解決枯萎病對(duì)海島棉的危害問題提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上, 對(duì)海島棉枯萎病抗性差異表達(dá)基因進(jìn)行分析(Differentially Expressed Gene, DEG); 以7個(gè)抗病性表現(xiàn)不同的海島棉品種為材料, 利用qRT-PCR方法研究抗病差異表達(dá)基因在接種0~40 h的表達(dá)量差異, 分析基因表達(dá)量與病情指數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明, DEG分析得出類黃酮代謝通路相關(guān)基因與海島棉枯萎病抗性有關(guān)。qRT-PCR分析顯示抗病材料中類黃酮代謝通路關(guān)鍵基因的表達(dá)量顯著高于感病材料。在接菌后多個(gè)時(shí)間點(diǎn), 類黃酮代謝通路中的關(guān)鍵基因、和在抗病材料中的表達(dá)量顯著或極顯著高于感病材料, 其中和基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。綜上所述, 類黃酮代謝通路相關(guān)基因?qū)u棉枯萎病抗性均有影響, 且、和基因是關(guān)鍵基因。

海島棉, 枯萎病, 類黃酮, 表達(dá)分析, 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

海島棉(L)在棉花栽培種中纖維品質(zhì)最優(yōu)[1], 枯萎病的浸染導(dǎo)致其產(chǎn)量和纖維品質(zhì)降低[2]。研究表明在相同條件下對(duì)陸地棉(L.)和海島棉接種枯萎病菌, 后者的感病程度較重[3]。陸地棉枯萎病抗性遺傳與海島棉不同, 校百才等[4]研究發(fā)現(xiàn)陸地棉的枯萎病抗性以加性效應(yīng)為主, 而Smith等[5]認(rèn)為海島棉的抗性是由2個(gè)具有加性效應(yīng)的顯性基因共同決定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 從分子水平上研究棉花的抗病機(jī)制已有諸多報(bào)道, Yang等[6]利用基因沉默技術(shù)證明在海島棉抗黃萎病過程中扮演重要角色。Gao等[7]研究發(fā)現(xiàn)和是影響棉花抗黃萎病性的關(guān)鍵基因。但目前關(guān)于海島棉抗枯萎病性基因研究的報(bào)道仍然較少, 挖掘海島棉抗病基因, 為海島棉抗病育種提供依據(jù)十分關(guān)鍵。

近年來, 越來越多的研究者采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)挖掘功能基因。Xu等[9]以海島棉抗病品種海7124為材料, 利用RNA-seq技術(shù)分析其接種黃萎病菌V991菌株后的轉(zhuǎn)錄組變化, 檢測(cè)到3442個(gè)差異表達(dá)基因, 并認(rèn)為木質(zhì)素代謝通路相關(guān)基因在棉花抗病防御反應(yīng)中扮演重要角色。王春暉[10]對(duì)陸地棉抗黃萎病自交系1017012及其接菌后6個(gè)時(shí)間段的RNA混樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)接菌后上調(diào)表達(dá)基因59 856個(gè), 下調(diào)表達(dá)基因51 976個(gè), 128條代謝途徑相關(guān)基因富集表達(dá)。

類黃酮化合物作為重要的次生代謝物, 廣泛分布于維管植物[11]。研究表明其與植物抗病性密切相關(guān)。Malhotra等[12]和賈振華[13]發(fā)現(xiàn)類黃酮化合物槲皮素在番茄和擬南芥的抗病方面發(fā)揮積極作用。Anna等[14]研究證實(shí), 25種類黃酮物質(zhì)可抑制黃萎病菌絲的生長(zhǎng)。關(guān)于類黃酮代謝途徑結(jié)構(gòu)基因與植物抗病性的關(guān)系已有研究: 轉(zhuǎn)反義基因楊樹中抗病物質(zhì)兒茶素(Catechin)含量明顯降低[15], GbCHI蛋白能顯著抑制大麗輪枝菌()孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)[16]。植物在遭受病原微生物浸染后活性會(huì)增強(qiáng), 說明由它調(diào)控的類黃酮代謝途徑是植物抵抗病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)之一[17]。雖然類黃酮代謝途徑中個(gè)別基因?qū)χ参锟共〉挠绊懸延兄T多研究, 但系統(tǒng)性總結(jié)并揭示海島棉類黃酮代謝途徑中各基因與海島棉枯萎病抗性的關(guān)系還未見報(bào)道。本研究以7個(gè)抗病性表現(xiàn)不同的海島棉品種為材料, 研究RNA-Seq富集到的6個(gè)類黃酮代謝途徑相關(guān)基因及另外2個(gè)關(guān)鍵基因和在0 h和其他5個(gè)接菌時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異, 并對(duì)基因表達(dá)量與病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析, 以期探究類黃酮代謝途徑相關(guān)基因影響海島棉枯萎病抗性的關(guān)鍵時(shí)期和關(guān)鍵基因, 為培育海島棉抗病品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取海島棉材料新海14 (母本, 感病), 06-146 (父本, 抗病)及其雜交后的F2:6RIL群體中的抗、感株系RIL10893 (超抗)、RIL10895 (高抗)、RIL10897 (感病)和RIL10796 (易感)共6份材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。選取海島棉抗病材料06-146、埃棉2號(hào)(抗病)、DJ-07-136 (抗病)、5917 (抗病)、新海14、海92-3 (感病)和埃及棉424 (感病)共7份材料進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析(表1和表2)。

1.2 種植及采樣方法

選取飽滿種子, 經(jīng)75%乙醇沖洗3次, 雙氧水浸泡4~5 h后, 放入ddH2O里浸泡催芽24 h左右至露白, 將種子放在鋪有濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒中, 28℃避光恒溫培養(yǎng)至芽長(zhǎng)3 cm左右, 移至霍格蘭氏(Hoagland’s)營(yíng)養(yǎng)液中, 在25℃, 光暗周期16 h/8 h的條件下培養(yǎng)。待第一片真葉完全展開時(shí), 接種稀釋至1×106個(gè)mL–1的枯萎病菌(生理小種7號(hào))。選取0 h及接菌后40 h的棉株下胚軸, 經(jīng)液氮速凍處理, –80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析

從0 h及接菌后4、10、18、28和40 h的棉株下胚軸提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 得到的Reads用Trinity軟件進(jìn)行無方向組裝, 將短的Reads拼裝成長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本, 用以鑒定轉(zhuǎn)錄本的亞型, 對(duì)unigene進(jìn)行RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads, 每百萬reads中來自某基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù))處理, 再用DEG進(jìn)行差異分析(篩選閾值為<0.005且|log2Fold Change|>1)。使用DAVID (The Database for Annotation, Visualization and Intergrated Discovery)在線平臺(tái)(https://dauid.ncifcrf.gov/)對(duì)這些基因進(jìn)行功能聚類分析, 明確海島棉在抗病過程中涉及的相關(guān)代謝通路中主要基因, 以及這些基因在不同品種和不同接菌時(shí)期的表達(dá)差異。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料

表2 實(shí)時(shí)熒光定量材料

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理方法

將得到的差異表達(dá)序列, 運(yùn)用NCBI中的ORF finder和BlastX找到序列的保守區(qū)域, 利用Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表3)。使用天根生化科技有限公司的試劑盒(RNA plant Plus Reagent), 按照產(chǎn)品說明書提取總RNA。參照Thermo Fisher Scientific科技公司RNA純化試劑盒(Thermo Scientific Gene JET)的具體步驟對(duì)總RNA進(jìn)行純化, 利用Titertek-Berthold檢測(cè)系統(tǒng)有限公司(Titertek-Berthold)的超微量分光光度計(jì)(Colibri)檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量, RNA濃度大于80 ngmL–1, 且A260/A280大于1.8, 采用賽默飛世爾(Thermo Fisher Scientific)公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First strand cDNA Synthesis kit)反轉(zhuǎn)錄提取后的RNA, 用ddH2O稀釋cDNA樣品5倍后, 置–80℃?zhèn)溆?。使用全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司qRT-PCR試劑盒(TransStart Green qPCR SuperMix), 通過美國(guó)ABI公司Prism 7500 Fast System, 以為內(nèi)參, 檢測(cè)7個(gè)品種(3個(gè)感病品種, 4個(gè)抗病品種), 6個(gè)接菌時(shí)期(0、4、10、18、28和40 h)的基因表達(dá)量變化。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。根據(jù)Ct值, 利用公式2–DDCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2–DDCt=2–[(Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因)處理組–(Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組]

表3 熒光定量引物

1.5 病情指數(shù)的調(diào)查與計(jì)算

于2014年和2015年4月中旬將材料種植于新疆阿拉爾市新開嶺鎮(zhèn)枯萎病重病田中, 2次重復(fù)。在每年10月5日左右, 選擇連續(xù)5株棉株, 采用剖桿的方法考察海島棉的枯萎病抗性, 參照五級(jí)分類法[18]判斷棉花的發(fā)病級(jí)別并計(jì)算病情指數(shù)。

病情指數(shù)(DI) = ∑級(jí)數(shù)×每級(jí)病株數(shù)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 DEG分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析DEG數(shù)據(jù)得出兩親本差異表達(dá)基因755個(gè), 抗病親本上調(diào)表達(dá)的基因1185個(gè)。利用RIL群體中抗病材料RIL 10895和RIL 10893, 感病材料RIL 10897和RIL 10796作進(jìn)一步分析(表4)。

表4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中類黃酮代謝相關(guān)基因的表達(dá)

在表中出現(xiàn)同一基因的2個(gè)表達(dá), 例如:基因?yàn)楹? 實(shí)際上和序列均與擬南芥庫中的同一個(gè)基因相似, 這種現(xiàn)象是由比對(duì)到序列部位不同而導(dǎo)致, 但其表達(dá)趨勢(shì)均類似。因此后續(xù)基因分析過程中統(tǒng)一用代表。

The same gene has two forms, for example,gene is displayed asand, in fact,andare similar to the same sequence of TAIR, this phenomenon is caused by different parts of a sequence alignment. But its expression trends are similar. So in the following gene analysis process unified the display for.

接菌后, 類黃酮代謝途徑中6個(gè)關(guān)鍵基因(、、、、和)在抗病親本及RIL高抗, 超抗材料中均顯著上調(diào)表達(dá)(表2)?；蛟诳共∮H本及RIL超抗材料中上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)分別為15.81和23.90, 比感病親本及RIL感病材料高出7倍和11倍。在抗病親本及RIL超抗材料中的表達(dá)量高出感病親本及RIL感病材料6倍之多。,基因在接菌前后表達(dá)量差異倍數(shù)的高低同棉花的抗性相一致,為RIL10893 (8.35) >RIL10895 (1.38) > RIL10897 (1.18) > RIL10796 (1.46),為RIL10893 (9.12) > RIL10895 (3.23) > RIL10897 (1.74) > RIL10796 (1.25);: RIL10893 (4.97) > RIL10895 (2.04) > RIL10897 (1.29) > RIL10796 (0.94)。暗示類黃酮代謝途徑相關(guān)基因可能與海島棉不同抗性表型的產(chǎn)生關(guān)系密切。

2.2 qRT-PCR結(jié)果分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證類黃酮代謝途徑相關(guān)基因與海島棉枯萎病抗性的關(guān)系, 選取7個(gè)抗性表現(xiàn)不同的資源材料對(duì)類黃酮代謝通路中的8個(gè)基因進(jìn)一步研究表明在接菌后18 h、40 h抗病材料的(花青素還原酶)表達(dá)量顯著高于感病材料, 且在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn), 感病材料的變異系數(shù)大于抗病材料, 說明該基因在感病材料之間的表達(dá)量有差異(圖1和表5)。除海92-3外, 另外2個(gè)感病材料在4、10和28 h、40 h的表達(dá)量均上調(diào), 且4 h和10 h上升幅度明顯大于28 h和40 h, 在40 h所有材料的表達(dá)量均上調(diào), 但是抗病材料的表達(dá)量顯著高于感病材料。推測(cè)該基因的表達(dá)量在感病材料中前期上調(diào)明顯, 在抗病材料中后期上調(diào)明顯。

(肉桂酸-4-羥化酶)(圖1和表5), 在接菌后40 h, 在抗病材料中的表達(dá)量顯著高于感病材料, 在感病材料中表達(dá)量的變異系數(shù)大于抗病材料, 說明在40 h感病材料之間的表達(dá)量也存在較大差異。感病材料中除了在4 h有上調(diào)表達(dá)外, 在其余接菌時(shí)間段均無明顯上調(diào)。抗病材料除DJ-07-136外, 都在40 h擁有最大值。該基因在接菌后40 h抗病材料的瞬時(shí)表達(dá)量增加明顯。

(二氫黃酮醇還原酶)(圖1和表5), 在接菌脅迫后, 在抗病材料中的表達(dá)量均顯著或極顯著高于感病材料。除10 h外, 抗病材料在各時(shí)期表達(dá)量的變異系數(shù)均小于感病材料, 說明該基因的表達(dá)量在感病材料之間也存在差異。在感病材料中, 該基因的表達(dá)量除埃及棉424在4 h有少量上調(diào)外, 其余均為下調(diào)。而在抗病材料中, 該基因的表達(dá)量在4 h均上調(diào)表達(dá), 并且在10 h持續(xù)上升, 在18 h全部下調(diào), 在28 h除06-146外其余無明顯上調(diào)。該基因的表達(dá)量在抗病材料和感病材料中有顯著差異。在抗病材料中除DJ-07-136外, 其余均有上升下降在上升的趨勢(shì), 且均在接菌后期(28 h和40 h)達(dá)到峰值, 推測(cè)該基因可能在海島棉抗枯萎病中起著重要作用。

(類黃酮3’羥化酶)(圖1和表5), 接菌脅迫后18、28和40 h在抗病材料中的表達(dá)量顯著高于感病材料, 在28 h和40 h的變異系數(shù)小于感病材料, 說明在這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)該基因的表達(dá)量在感病材料之間也存在較大差異。從圖1可知, 除DJ-07-136外該基因的表達(dá)量在4~18 h均無明顯上調(diào)。在28 h, 新海14 (感病)、06-146 (抗病)、DJ-07-136 (抗病)、埃棉2號(hào)(抗病)表達(dá)量有大幅上升, 但新海14 (感病)的表達(dá)量顯著低于另外3種抗病材料, 且在這3個(gè)抗病材料中, 該基因的表達(dá)量在此時(shí)有最大值。該基因在感病材料中無明顯變化, 在抗病材料中后期明顯上調(diào)表達(dá)。

(查爾酮異構(gòu)酶)(圖1和表5), 接菌脅迫后10、18、28和40 h, 在抗病材料中的表達(dá)量顯著高于感病材料, 但其變異系數(shù)小于感病材料。說明在感病材料之間該基因的表達(dá)水平有差異。抗病材料DJ-07-136和5917的表達(dá)量在18 h擁有最大值, 抗病材料06-146, 埃棉2號(hào)的表達(dá)量在40 h擁有最大值。該基因在感病材料中無明顯上調(diào)表達(dá)。推測(cè)該基因可能與海島棉抗枯萎病有關(guān)。

(查爾酮合成酶)(圖1和表5), 在接菌后18 h和40 h抗病材料的表達(dá)量顯著高于感病材料, 變異系數(shù)小于感病材料, 可能該基因的表達(dá)量在感病材料之間也存在差異。除06-146外, 該基因在抗病材料中4 h和10 h的表達(dá)量較18 h和28 h更加活躍。除埃棉2號(hào)外, 該基因在抗病材料中的表達(dá)量均有上升下降再上升的趨勢(shì), 且第1個(gè)表達(dá)峰值出現(xiàn)在10 h, 第2個(gè)表達(dá)峰值在40 h。

(花色素合成酶)(圖1和表5), 在接菌后10、28和40 h抗病材料的表達(dá)量顯著高于感病材料, 且在28 h和40 h抗病材料表達(dá)量的變異系數(shù)小于感病材料, 說明該基因在接菌后28 h和40 h, 感病品種之間的表達(dá)水平也有差異。該基因在抗病材料中4 h和10 h的表達(dá)量較18 h和28 h更加活躍。在抗病材料中該基因的表達(dá)量均有上升下降再上升的趨勢(shì), 第1個(gè)表達(dá)峰值在4 h和10 h, 第2個(gè)表達(dá)峰值在40 h。推測(cè)該基因在抗病材料中的表達(dá)趨勢(shì)可能是一個(gè)達(dá)到峰值后逐漸降低又回升的過程, 在感病材料中沒有這種趨勢(shì)。

(黃酮醇合成酶)(圖1和表5), 在接菌后10、28和40 h抗病材料的表達(dá)量顯著高于感病材料, 而其變異系數(shù)小于感病材料, 說明該基因的表達(dá)量在感病材料之間也存在差異。在接菌后該基因的表達(dá)量在感病材料中均有下調(diào)的趨勢(shì)。除DJ-07-136外, 抗病材料相對(duì)表達(dá)量的變化均有上升下降, 再上升的趨勢(shì)。

這8個(gè)基因在4個(gè)抗病材料中的表達(dá)量較感病材料上調(diào)更加明顯, 尤其是在40 h。除4 h外,基因在抗病材料中各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均顯著高于感病材料基因在抗病材料中各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于感病材料。的基因表達(dá)量在感病材料中無明顯變化, 在抗病材料中后期明顯上調(diào)表達(dá)。、、和在抗病材料中4 h和10 h的相對(duì)表達(dá)量高于18 h和28 h。和的表達(dá)量在抗病材料中均有上調(diào)后下調(diào)又回升的趨勢(shì), 但在感病材料中并無這種趨勢(shì)。、和基因在感病材料接菌后4 h的表達(dá)量有明顯上調(diào), 但是在4 h之后表達(dá)量上調(diào)不如抗病材料明顯。

2.3 抗、感材料間基因表達(dá)量方差分析

接菌40 h后, 8個(gè)基因在抗、感材料間均有極顯著差異(表6)。在除接菌后4 h以外的時(shí)期,基因的表達(dá)量在抗、感材料間均呈極顯著差異?；虻谋磉_(dá)量在抗、感材料之間, 除在4 h和28 h有顯著差異外, 在其他時(shí)期均有極顯著差異。在抗、感材料之間,基因的表達(dá)量在28 h和40 h有極顯著差異。在方差分析中發(fā)現(xiàn)抗病材料內(nèi)部以及感病材料內(nèi)部基因表達(dá)量的變異系數(shù)較大, 但是仍然發(fā)現(xiàn)抗、感材料之間的基因表達(dá)量有顯著差異, 說明抗、感材料之間的差異極顯著。

圖1 類黃酮代謝通路相關(guān)基因表達(dá)水平

表5 類黃酮代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量在抗感材料之間的差異

表6 抗、感材料間基因表達(dá)量方差分析

*和**分別表示在<0.05和<0.01水平抗、感材料間差異顯著。

*and**indicate significant difference between resistant and susceptible genotypes at<0.05 and<0.01, respectively.

從表6可看出, 盡管在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的DEG分析中未檢測(cè)出和基因, 但是在接菌后40 h時(shí)8個(gè)基因的表達(dá)量在抗、感材料之間均差異極顯著, 這說明類黃酮途徑中的關(guān)鍵基因與海島棉枯萎病抗性關(guān)系密切。從表6還可看出, 在接菌后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和基因的表達(dá)量在抗、感材料之間均差異顯著。

2.4 海島棉病情指數(shù)與類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

將抗、感共7份材料2014—2015年的病情指數(shù)與類黃酮代謝通路相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析(表7)表明, 在接菌40 h后,,基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān),和基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。接菌28 h后,與基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。接菌10 h后基因表達(dá)量與病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。從表7可以看出和基因分別在2個(gè)時(shí)期都被檢測(cè)出的基因表達(dá)量與病情指數(shù)之間顯著負(fù)相關(guān), 說明這2個(gè)基因可能在海島棉枯萎病抗性中起著重要的作用。

表7 海島棉病情指數(shù)與類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)

*和**分別表示在<0.05和<0.01水平差異顯著。

*and**indicate significant difference at<0.05 and<0.01, respectively.

3 討論

因?yàn)槊藁S萎病菌孢子萌發(fā)并滲透植物表皮細(xì)胞的過程發(fā)生在真菌感染后的前12 h[19]。復(fù)雜的病菌感染反應(yīng)以及信號(hào)的傳導(dǎo)和交換通常發(fā)生在真菌感染12~40 h[20-21]。所以本研究選取接菌后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、4、10、18、28和40 h)進(jìn)行熒光定量分析。由于棉花在接菌40 h后會(huì)激發(fā)細(xì)胞凋亡等生理生化反應(yīng)[22]。為了避免凋亡基因等影響對(duì)抗病基因的判斷, 本研究不對(duì)40 h以后的材料進(jìn)行分析。

改良海島棉抗枯萎病性是提高新疆海島棉生產(chǎn)的根本途徑。通過揭示海島棉的抗病機(jī)制可以快速培育抗病品種。體外施加類黃酮化合物可顯著提高植物的抗病性[23-24]。研究者們已通過RNA-seq的方法證實(shí)類黃酮代謝相關(guān)基因與馬鈴薯、油棕和向日葵抗病有關(guān)[25-27]。前人對(duì)于棉花類黃酮的研究也主要集中在棉纖維顏色方面[28]。而對(duì)于類黃酮與海島棉枯萎病抗性的關(guān)系研究甚少。Sun等[29]在對(duì)接種黃萎病菌前后陸地棉及海島棉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后指出, 在海島棉中苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。苯丙烷代謝通路在棉花抵抗病原菌方面的積極作用已被許多研究所證實(shí)[11,30-32]。類黃酮代謝途徑(圖2)[9]是苯丙烷代謝途徑通過查爾酮合成酶()延伸的另一個(gè)重要分支[13]。本研究RNA-seq分析表明, 在接菌后40 h, 類黃酮代謝途徑6個(gè)關(guān)鍵基因(和)的表達(dá)量在抗感材料之間差異顯著。其中和基因在抗病親本接菌前后表達(dá)量的差異倍數(shù)高達(dá)15.81、12.99、13.30和11.54。說明類黃酮代謝途徑與海島棉抗病性存在密切聯(lián)系。

雖然研究者們通過多種方法證明類黃酮代謝途徑與植物抗病有關(guān), 且關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子以及調(diào)控基因也在多種植物中被克隆, 但由于類黃酮代謝途徑比較復(fù)雜, 相關(guān)基因大多數(shù)為多基因家族。本研究在RNA-seq的基礎(chǔ)上進(jìn)行DEG分析, 檢測(cè)到類黃酮代謝通路相關(guān)基因與海島棉枯萎病抗性密切相關(guān), 利用熒光定量的方法對(duì)不同抗性資源材料進(jìn)一步分析表明, 接菌40 h后這些基因在抗病材料中的表達(dá)量顯著高于感病材料。進(jìn)一步證實(shí)類黃酮代謝通路對(duì)海島棉抵抗枯萎病起積極的作用。

在除40 h外的其他時(shí)間點(diǎn),和基因的表達(dá)量在抗、感材料間也存在顯著或極顯著差異,和基因在接菌后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與病情指數(shù)有顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。其中基因的表達(dá)量在接菌后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有極顯著差異?；蚴穷慄S酮代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶, 在轉(zhuǎn)基因煙草中活性與總黃酮含量呈正相關(guān)[33]。推測(cè)在抗病材料中基因受病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量上調(diào), 使黃酮含量增加, 而類黃酮化合物與相關(guān)酚類物質(zhì)能夠保護(hù)植物免受微生物浸染[34], 所以黃酮含量的增加可以導(dǎo)致棉花獲得抗性。在接菌后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)基因的表達(dá)量在抗感材料之間均有顯著或者極顯著差異。根據(jù)馬春雷等[35]的研究結(jié)果可知,和基因的表達(dá)量與茶樹兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈一定的正相關(guān)?；虻母弑磉_(dá)可能會(huì)導(dǎo)致兒茶素含量增加。前人研究發(fā)現(xiàn), 在枯萎病菌浸染后棉苗組織中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高, 且在抗病品種棉苗組織中的兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于感病品種, 另外還發(fā)現(xiàn)棉花體內(nèi)的兒茶素可抑制產(chǎn)孢及孢子的萌發(fā)[36]。兒茶素的增加可能會(huì)抑制枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)。以上兩基因CHI后續(xù)可通過沉默該基因后測(cè)定黃酮含量來探究該基因的抗病機(jī)制。后續(xù)可以結(jié)合兒茶素含量測(cè)定或者將正反義基因轉(zhuǎn)入棉花進(jìn)一步研究基因的功能。

圖2 棉花中的類黃酮途徑

Phenylalanine: 苯丙氨酸; Cinnamate: 肉桂酸;-Cinnamate: 對(duì)香豆酸;-Cinnamate-CoA: 香豆酸輔酶A; Chalcone: 查爾酮; Flavanone: 黃烷酮; Isoflavones: 異黃酮; Isoflavanones: 二氫異黃酮類; Dihydro flavonols: 二氫黃酮醇; Flavonols: 黃酮醇; Anthocyanins: 花青素; Anthocyanins: 花青素類; Procyanidins: 原花青素; Flavan-4-ols: 黃烷-4-醇; Flavones: 黃酮類; PAL: phenylalanine ammonia-lyase, 苯丙氨酸解氨酶; C4H: cinnamate 4-hydroxylase, 肉桂酸羥化酶; 4CL: 4-coumarate:CoA ligase, 4-香豆酸: 輔酶A連接酶; CHS: chalcone synthase, 查爾酮合酶; CHI: chalcone isomerase, 查爾酮異構(gòu)酶; IFS: isoflavone synthase, 異黃酮合酶; IFR: isoflavone reductase, 異黃酮還原酶; F3’H: lavanone 3’-hydroxylase, 類黃酮3’羥化酶; FLS: flavonol synthase, 黃酮醇合酶; DFR: dihydroflavonol-4-reductase, 二氫黃酮醇還原酶; ANS: anthocyanidin synthase, 花青素合酶; ANR: anthocyanidin reductase, 花青素還原酶; UFGT, UDP-flavonoid glucosyltransferase, UDP類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶。粗體字示本文所研究的基因。Bold is the gene studied in this article.

Shih等[37]在研究高粱的抗病機(jī)制時(shí)認(rèn)為,基因在接菌后24 h表達(dá)量開始上調(diào), 在接菌后72 h表達(dá)量達(dá)到最大值。本研究與其類似的是基因的表達(dá)量均在接菌后期上調(diào)明顯。另外研究結(jié)果還指出在接菌后期,基因在抗病材料中的表達(dá)量顯著高于感病材料。這個(gè)表達(dá)量差異說明其與抗病密切相關(guān)。轉(zhuǎn)煙草與正常煙草相比苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-lyase, PAL)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性增加, 可減輕病原微生物對(duì)煙草自身產(chǎn)生的傷害[38]。另外,基因的過量表達(dá)可以導(dǎo)致具有抗氧化和抗菌活性的類黃酮化合物槲皮素(Quercetin)的含量增加[23-24]。因此推測(cè)在抗病材料中的高表達(dá)可能導(dǎo)致PAL和 POD活性增加或者槲皮素含量增加, 從而提高海島棉枯萎病抗性。

關(guān)于類黃酮代謝途徑相關(guān)基因與植物抗病性的關(guān)系, 前人的研究主要集中在陸地棉中。Deshika等[39]研究證明棉花在接種枯萎病菌后24 h基因的表達(dá)量與對(duì)照并無差異。本研究證實(shí)基因在接菌后40 h表達(dá)量上調(diào)明顯, 而在28 h大多數(shù)品種并無明顯上調(diào)表達(dá)。該基因在海島棉和陸地棉中的差異表達(dá)暗示海島棉抗枯萎病機(jī)制不同。Xu等[9]以接種黃萎病菌前后的海7124為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 并利用qPCR的方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)抗病材料中基因和基因在接菌后各個(gè)時(shí)期(4、12、24和48 h)的表達(dá)量均高于感病材料, 且基因的表達(dá)量要明顯高于基因的表達(dá)量。另外Xu等[9]還發(fā)現(xiàn)和基因的表達(dá)量均在在接菌后24 h達(dá)峰值, 在48 h表達(dá)量有少量下降。而本研究中這2個(gè)基因的表達(dá)量都在40 h有最大值。在接種黃萎病菌和枯萎病病菌后和基因的差異表達(dá)說明枯萎病與黃萎病的抗性機(jī)制也存在差異。

4 結(jié)論

抗病材料中類黃酮代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)量顯著高于感病材料。在接菌后40 h, 類黃酮代謝途徑8個(gè)基因在抗病材料中的表達(dá)量均顯著高于感病材料。其中、在抗病材料中其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量也顯著高于感病材料。在接菌后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),和基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。在接菌后40 h,基因的表達(dá)量與病情指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。推測(cè)、和可能與海島棉抗枯萎病有關(guān)。

[1] 孔慶平. 我國(guó)海島棉生產(chǎn)概況及比較優(yōu)勢(shì)分析. 中國(guó)棉花, 2002, 12: 19–23 Kong Q P. Production situation and comparative advantage analysis ofin China., 2002, 12: 19–23 (in Chinese with English abstract)

[2] 徐秋華, 張獻(xiàn)龍, 聶以春, 馮純大. 我國(guó)棉花抗枯萎病品種的遺傳多樣性分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 35: 272–276 Xu Q H, Zhang X L, Nie Y C, Feng C D. Genetic diversity evaluation of cultivars (L.) resistant to fusarium wilt by RAPD markers., 2002, 35: 272–276 (in Chinese with English abstract)

[3] 彭姜龍, 曲延英, 王莉萍, 王聰, 郝維維, 汪鋮亮. 不同溫度條件下接種棉花枯萎病菌海島棉和陸地棉抗病性研究. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 50: 89–93 Peng J L, Qu Y Y, Wang L P, Wang C, Hao W W, Wang C L. A study on properties of resistance to Fusarium wilt in leaves of sea island cotton () and upland cotton (L.) under different temperature conditions., 2013, 50: 89–93 (in Chinese with English abstract)

[4] 校百才. 陸地棉抗枯、黃萎病性狀配合力、遺傳力的初步研究. 作物學(xué)報(bào), 1985, 11: 267–273 Xiao B C. Preliminary study on cotton Fusarium and Verticillium wilt resistance traits, combining ability and heritability., 1985, 11: 267–273 (in Chinese with English abstract)

[5] Smith A L, Dick J B. Inheritance of resistance to Fusarium wilt in upland and sea island cottons as complicated by nematodes under field conditions., 1960, 50: 44–48

[6] Yang J, Ma Q, Zhang Y, Wang X F, Zhang G Y, Ma Z Y. Molecular cloning and functional analysis of GbRVd, a gene inthat plays an important role in conferring resistance to Verticillium wilt., 2016, 575: 687–694

[7] Gao X Q, Wheeler T, Li Z H, Charles M K, He P, Shan L B. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromises cotton resistance to Verticillium wilt., 2011, 66: 293–375

[8] Snyder M. RNA-seq: a revolutionary tool for transcriptomics., 2009, 10: 57–63

[9] Xu L, Zhu L F, Tu L L, Liu L L, Yuan D J, Jin L, Long L, Zhang X L. Lignin metabolism has a central role in the resistance of cotton to the wilt fungusas revealed by RNA-Seq-dependent transcriptional analysis and histochemistry., 2011, 62: 5607–5621

[10] 王春暉. 陸地棉抗病自交系在黃萎病菌誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文, 北京, 2013 Wang C H. Study on Transcriptome Sequencing of Cotton (L.) Resistant Inbred Line Induced by Verticillium. MS Thesis of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China, 2013 (in Chinese with English abstract)

[11] Hichri I, Barrieu F, Bogs J, Kappel C, Delrot S, Lauvergeat V. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway., 2011, 62: 2465–2483

[12] Malhotra B, Onyilagha J C, Bohm B A, Towers G H N, James D, Harborne J B, French C J. Inhibition ofby flavonoids., 1996, 43: 1271–1276

[13] 賈振華. 植物黃酮類化合物槲皮素與轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)和調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)的研究. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 江蘇南京, 2010 Jia Z H. Study on the Effects of Quercetin and Transcription Factoron Plant Defense Response. PhD Dissertation of Nanjing Agricultural University, Nanjing, China, 2010 (in Chinese with English abstract)

[14] Anna K P, Edward F. S, Jaroslav P. Effect of flavonoids on mycelial growth of., 1995, 23: 683–693

[15] 左濤, 趙樹堂, 盧孟柱, 孫愛東, 王延偉, 賀偉. 楊樹二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)的克隆及反義表達(dá)對(duì)兒茶素合成的影響. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 10: 49–55 Zuo T, Zhao S T, Lu M Z, Sun A D, Wang Y W, He W. Cloning dihydroflavonol-4-reductase gene (DFR) of poplar and its antisense expression effects on catechin synthesis., 2016, 10: 49–55 (in Chinese with English abstract)

[16] 馬銀平, 王付欣, 楊淳淋, 沈法富, 夏桂先. 海島棉幾丁質(zhì)酶基因的克隆與功能分析. 遺傳, 2012, 34: 240–247 Ma Y P, Wang F X, Yang C L, Shen F F, Xia G X. Cloning and functional analysis of chitinase genefrom sea-island cotton ().(Beijing), 2012, 34: 240–247 (in Chinese with English abstract)

[17] Leslie A W, Li G Q, Doreen W, Imre E S, Keith R D. The phenylalanine ammonialyase gene family in., 1995, 27: 327–338

[18] Wajad N, Abdul L T, Saghir A, Khalid M, Abid M, Zhou B L. Evaluation of cotton leaf curl virus resistance in BC1, BC2, and BC3progenies from an interspecific cross betweenand., 2014, 9: e111861

[19] Emilie F F, Bart P H J T. Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused byand., 2006, 7: 71–86

[20] Zhang S, Klessig D F. MAPK cascades in plant defense signaling., 2001, 6: 520–527

[21] Kunkel B N, Brooks D M. Cross talk between signaling pathways in pathogen defense., 2002, 5: 325–331

[22] Patil M A, Pierce M L, Phillips A L, Venters B J, Essenberg M. Identification of genes up-regulated in bacterial-blight-resistant upland cotton in response to inoculation withpv.., 2005, 67: 319–335

[23] Atsushi N, Chikara M, Mineo S, Hideyuki M, Atsushi K, Hong J S, Keisuke K, Jun A, Akira K. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing., 2007, 5: 778–790

[24] Boots A W, Haenen G R M M, Bast A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical., 2008, 585: 325–337

[25] 包改紅, 畢陽, 李永才, 王毅, 王婷, 唐瑛, 馬朝玲, 白小東. 硫色鐮刀菌接種對(duì)抗病/易感品種馬鈴薯塊莖苯丙烷代謝的影響比較. 食品科學(xué), 2015, 36: 251–256 Bao G H, Bi Y, Li Y C, Wang Y, Wang T, Tang Y, Ma Z L, Bai X D. Comparison of phenylpropanoid pathway metabolism in slices of susceptible and resistant potato cultivars inoculated with., 2015, 36: 251–256 (in Chinese with English abstract)

[26] Guo S, Zuo Y, Zhang Y, Wu C, Su W, Jin W, Yu H, An Y, Li Q. Large-scale transcriptome comparison of sunflower genes responsive to., 2017, 18: 42

[27] Tan B A, Daim L D J, Ithnin N, Ooi T E K, Md-Noh N, Mohamed M, Mohd-Yusof H, Appleton D R, Kulaveerasingam H. Expression of phenylpropanoid and flavonoid pathway genes in oil palm roots during infection by., 2016, 7: 11–20

[28] Sun W G, Xu Y. Study on the composition of the pigments in the nature colored cotton., 2009, 23: 119–124

[29] Sun Q, Jiang H Z, Zhu X Y, Wang W N, He X H, Shi Y Z,Yuan Y L, Du X M, Cai Y F. Analysis of sea-island cotton and upland cotton in response toinfection by RNA sequencing., 2013, 14: 852

[30] Federico P, Marta N, María A B, Fuencisla M, Barceló A R. Changes in stem lignins (monomer composition and crosslinking) and peroxidase are related with the maintenance of leaf photosynthetic integrity during Verticillium wilt in., 2004, 163: 111–123

[31] Gayoso C, Pomar F, Novo-Uzal E, Merino F, Martínez D I O. The Ve-mediated resistance response of the tomato toinvolves H2O2, peroxidase and lignins and drivesgene expression., 2010, 10: 1–19

[32] Irina O V, Robert T R, Jane E G. David J R, Kent A M, Nicholi V. Characterization of flavonols inpowder., 2003, 52: 188–195

[33] Li F, Jin Z, Qu W, Zhao D, Ma F. Cloning of a cDNA encoding thechalcone isomerase and its expression in transgenic tobacco., 2006, 44: 455–461

[34] Fawe A, Abou Z M, Menzies J G, Belanger R R. Silicon-mediated accumulation of flavonoid phytoalexins in cucumber., 1998, 88: 396–401

[35] 馬春雷, 喬小燕, 陳亮. 茶樹無色花色素還原酶基因克隆及表達(dá)分析. 茶葉科學(xué), 2010, 30: 27–36 Ma C L, Qiao X Y, Chen L. Cloning and expression analysis ofreducase gene of tea plant ()., 2010, 30: 27–36 (in Chinese with English abstract)

[36] 宋鳳鳴, 鄭重, 童賢明, 葛秀春. 兒茶素對(duì)棉枯萎病菌胞壁降解酶的抑制及在棉花抗病性中的作用. 真菌學(xué)報(bào), 1996, 4: 297–303 Song F M, Zheng Z, Tong X M, Ge X C. Inhibition of tea catechins on cell wall degrading enzymes of cottonwilt and its role in disease resistance of cotton., 1996, 4: 297–303 (in Chinese with English abstract)

[37] Shih C H, ChuI K, Yip W K, Lo C. Differential expression of two flavonoid 3’-hydroxylase cDNAs involved in biosynthesis of anthocyanin pigments and 3’-deoxyanthocyanidin phytoalexins in sorghum., 2006, 47: 1412–1419

[38] 張松煥, 李春奇, 郭惠明, 裴熙祥, 程紅梅. 過量表達(dá)紫莖澤蘭類黃酮3’-羥化酶基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草POD、PAL活性的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2009, 11(3): 98–101 Zhang S H, Li C Q, Guo H M, Pei X X, Cheng H M. Effects of eupatorium adenophorum flavonoid 3'-hydroxylase overexpression on pod and pal activity in transgenic tobacco., 2009, 11(3): 98–101 (in Chinese with English abstract)

[39] Kohli D, Joshi G, Deokar A A, Bhardwaj A R, Agarwal M, Katiyar-Agarwal S, Srinivasan R, Jain P K. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing., 2014; 9: e108851

Correlation between Fusarium wilt Resistance and Expression Levels of Genes Involved in Flavonoid Metabolism Pathway inL.

HUANG Qi-Xiu, QU Yan-Ying, YAO Zheng-Pei, LI Meng-Yu, and CHEN Quan-Jia*

College of Agronomy / Key Laboratory of Agriculture Biological Technology, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China

Fusarium wilt is one of the important factors threatening the production of island cotton (L.). Understand the molecular mechanism of Fusarium wilt resistance will facilitate cotton breeding against Fusarium wilt and therefore alleviate the problem in cotton production. On the basis of RNA-seq results in previous studies, differentially expressed genes (DEG) were further analyzed in this study. After inoculating the pathogenic fungus for 0–40 hours, the DEGs expression levels of seven varieties in different wilt resistance were studied using qRT-PCR method. The correlation between gene expression level and disease index was analyzed. The flavonoid biosynthetic pathway genes were found to be related to Fusarium wilt resistance. The qRT-PCR result indicated the significantly higher expression levels of flavonoid metabolic pathway genes in resistant genotypes than those susceptible genotypes. The expression levels of,, and, the key genes in flavonoid metabolic pathways, were significantly higher in resistant genotypes than in susceptible genotypes (< 0.05 or< 0.01) at several time points after inoculation. Particularly, the expression levels ofandwere negatively correlated with disease index. Therefore, we conclude that the flavonoid metabolic pathway related genes might be involved in the resistance to Fusarium wilt in cotton, among which,, andare the key genes.

; Fusarium wilt; Flavonoids; Expression analysis; RNA-seq

10.3724/SP.J.1006.2017.01791

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560409)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31560409).

陳全家, E-mail: chqjia@126.com第一作者聯(lián)系方式: E-mail: 13899525177@163.com, Tel: 13899525177

2017-03-09; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-08-10.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170810.1616.010.html