謝潔玲 翀史曉 史姣霞 于 彤 李八方 趙 雪①

(1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003)

從海帶中提取出來的巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan)是一種水溶性的雜多糖, 硫酸酯化的 α-L-巖藻糖殘基是大多數(shù)分子的基本組成成分, 其具備的抗血栓、抗凝血、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫的活性已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可(Pomin et al, 2008; 陳安進(jìn)等, 2012;Wijesinghe et al, 2012)?？诜煌肿恿烤厶橇蛩狨ケ憩F(xiàn)出很好的提高免疫力活性(李芳等, 2012) 。而巖藻聚糖硫酸酯作為一種非淀粉大分子硫酸多糖, 結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜, 由于人體自身缺乏與之相關(guān)的消化酶,無法在上消化道被降解利用, 幾乎全進(jìn)入大腸中, 所以高分子量巖藻聚糖硫酸酯是無法被直接吸收轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)的。而口服巖藻聚糖硫酸酯如何發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性, 是一個(gè)未知的難題。因此研究巖藻聚糖硫酸酯的消化吸收對其生物活性的研究具有重要的意義。有研究報(bào)道結(jié)腸特別是盲腸中的微生物可以降解非淀粉多糖, 胃和小腸則不能(Barthe et al, 2004), 原因是非淀粉多糖不能被人類自身的酶系所消化(Buddington et al, 2002), 所以非淀粉多糖不易被胃腸消化吸收, 幾乎全部進(jìn)入大腸。人體腸道中的微生物種類超過1000種, 菌總數(shù)高達(dá)1014。Gill等(2006)通過基因測序并構(gòu)建元基因文庫, 發(fā)現(xiàn)腸道微生物的基因庫中富含參與多糖代謝的基因。日本的Czjzek課題組發(fā)現(xiàn)在其本國人的腸道微生物的宏基因組中存在瓊膠和紫菜多糖水解酶的基因(Hehemann et al,2010)。經(jīng)過更深入的研究, 該課題組還發(fā)現(xiàn) Z.galactanovorans中含有褐藻膠降解基因的操縱子(Thomas et al, 2012)。Li從中國人的糞便微生物中分離出能夠降解瓊膠和卡拉膠的菌株(李苗苗, 2014; Li et al, 2014)。研究證明人腸道微生物可以降解這些海洋硫酸多糖, 并對腸道有益菌有促進(jìn)作用。研究表明,腸道微生物在人體的營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中起著重要作用, 其中酵解多糖的代謝終產(chǎn)物—短鏈脂肪酸(SCFAs), 主要是乙酸、丙酸、丁酸, 不僅能為宿主和腸道微生物本身的生長繁殖提供能量, 且具有抗病原微生物、改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等重要作用(陳燕等, 2006)。但是支鏈脂肪酸(BCFAs)如異丁酸和異戊酸, 只能由支鏈氨基酸發(fā)酵產(chǎn)生。由于人體內(nèi)的酶不能降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生支鏈脂肪酸, 所以腸道中的支鏈脂肪酸主要是由腸道微生物對蛋白質(zhì)進(jìn)行厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的, 蛋白質(zhì)的發(fā)酵還會(huì)產(chǎn)生氨類、酚類、吲哚等對人體有害的物質(zhì), 這與大腸癌、潰瘍結(jié)膜炎等密切相關(guān), 因此這個(gè)過程總體上被認(rèn)為是對人體健康不利的(周中凱等, 2014)。

海帶巖藻聚糖硫酸酯是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的海洋硫酸多糖, 主要含有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和葡萄糖, 還含有微量的氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖和木糖, 糖鏈上還含有大量的半乳糖和巖藻糖支鏈。人腸道微生物是否能夠降解利用復(fù)雜的巖藻聚糖硫酸酯, 目前還沒有研究報(bào)道。本文利用體外發(fā)酵模型, 研究了人體腸道微生物對高、低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的降解, 并對降解產(chǎn)物中的多糖組成和短鏈脂肪酸進(jìn)行分析, 為更深一步地探究巖藻多糖與腸道微生物的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海帶巖藻聚糖是本實(shí)驗(yàn)室從威海產(chǎn)海帶中, 采用酸浸泡、水提取和醇沉法獲得, 采用10kDa透析袋透析脫鹽, 凍干后得到高分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯(HMWF)。

1.2 試劑

單糖標(biāo)準(zhǔn)品甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和乳糖購自美國 Sigma 公司; 6種短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸)和二乙基丁酸購自阿拉丁工業(yè)公司。

1.3 儀器

MLS-3750 高溫高壓滅菌鍋, 日本SANYO株式會(huì)社; Agilent 1100型高效液相色譜儀, 美國安捷倫公司; DYY-6C型電泳儀, 北京市六一儀器廠; Agilent 1260型高效液相色譜儀, 美國安捷倫公司; 電噴霧LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜, 美國 thermo公司; Agilent 6890型氣相色譜儀, 美國安捷倫公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備 稱取1.0g巖藻聚糖多糖和0.08g醋酸銅溶于15mL蒸餾水中, 用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.5, 以 3mL/h的速度加入4.5%H2O2, 60°C水浴反應(yīng)4h(pH為7.5—8.0),反應(yīng)結(jié)束后用Chelex 100 樹脂除去Cu2+。用500Da透析袋透析除鹽, 濃縮, 凍干后得到低分子量巖藻聚糖硫酸酯(LMWF)(趙雪等, 2011)。

1.4.2 培養(yǎng)基的配制 在無碳源培養(yǎng)基(蛋白胨、胰蛋白胨、粘液素、3#膽鹽、血紅素、L-半胱氨酸、微量元素、混合維生素)中分別加入 5g/L HMWF或LMWF為唯一碳源, 調(diào)節(jié)pH至6.4—6.5。各自取5mL分裝至 25mL厭氧瓶, 充氮?dú)夂竺芊? 高壓滅菌鍋115°C 滅菌 40min。

1.4.3 人糞便樣品的收集和接種 提供實(shí)驗(yàn)樣本的 5位志愿者(編號(hào)為 Nos.1—5)身體健康, 采樣前 2個(gè)月內(nèi)無服用益生元、抗生素記錄。取志愿者糞便,用0.1mol/L滅菌的磷酸緩沖液(pH 7.0)配成20%(w/v)的懸浮液, 充分混勻后離心去殘?jiān)?。?.5mL糞便菌懸液, 分別接種至HMWF和LMWF培養(yǎng)基中, 置于厭氧培養(yǎng)箱中, 37°C培養(yǎng) 48h, 并于 0h和 48h取樣1mL。

1.4.4 低分子量巖藻聚糖硫酸酯分子量的測定低分子量巖藻聚糖硫酸酯用 0.2mol/L NaCl配成10mg/mL溶液, 用高效凝膠色譜來確定分子量的大小。色譜儀: Agilent 1100高效液相色譜儀; 色譜柱:TSK-gel G2500 PWxl色譜柱(7.8cm×30cm); 檢測器:示差檢測器(G1362A RID); 流動(dòng)相: 0.2mol/L NaCl;流速: 0.5mL/min; 柱溫: 40°C; 標(biāo)準(zhǔn)品: 分子量為1kDa的葡聚糖、巖藻糖(MW164.16)和分子量為5000Da、6000—10000Da的硫酸葡聚糖, 分子量為180Da、2500Da、4600Da、7100aD 和 10000Da的右旋糖酐。Agilent GPC軟件計(jì)算樣品洗脫峰的重均分子量和分散系數(shù)。

1.4.5 薄層層析法(TLC)檢測降解情況 所取樣品在12000r/min離心10min, 然后取上清液, 在硅膠板上點(diǎn)樣1.2μL, 以反應(yīng)0h的樣品作對照, 放置于甲酸:正丁醇:水=6:4:1(v:v:v)的展開劑中展開兩次后, 吹干,用苯胺-二苯胺顯色劑(0.2mL苯胺、0.1mL HCl 、0.2g

二苯胺和1mL 85%磷酸溶于10mL 丙酮中)浸潤后吹干, 在電爐上加熱顯色(焦廣玲等, 2007)。

1.4.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測降解情況所取樣品在 12000r/min離心 10min, 然后取上清液10μL, 與50%蔗糖1∶1混勻。采用5%的濃縮膠和15%的分離膠來進(jìn)行電泳分析, 電壓200V, 時(shí)間30min。將膠放入 5%(w/v)的阿利新藍(lán)溶液中(2%乙酸配制)染色1h, 再用2%乙酸脫色兩次(郭峰君等, 2014)。

1.4.7 高效液相色譜法(HPLC)分析巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成 所取樣品在 12000r/min離心 10min,取0.4mL上清液于5mL安瓿瓶中, 加2mL 2mol/L三氟乙酸后充N2封瓶, 110°C消化8h, 冷卻后空氣吹干, 加甲醇吹干, 重復(fù) 3次以確保除盡三氟乙酸, 然后用100μL超純水溶解, 再用0.3mol/L NaOH調(diào)成中性, 定容至 200μL, 6000r/min離心 10min后取 90μL上清液和10μL 20mmol/L 乳糖內(nèi)標(biāo)至干凈離心管中,另外, 10種濃度均為 20mmol/L的單糖標(biāo)準(zhǔn)品各加10μL至另一干凈離心管中, 在相同條件下進(jìn)行 PMP衍生。色譜柱: EC-C18分離柱(4.6mm×150mm, 5μm);檢測器: 紫外檢測器(245nm); 流速: 0.3mL/min; 柱溫: 30°C; 流動(dòng)相: 流動(dòng)相A: 磷酸緩沖液(pH為 6.7的0.1mol/L KH2PO4):乙腈=82:18, 流動(dòng)相B: 磷酸緩沖液(pH為 6.7的0.1mol/L KH2PO4):乙腈=65:35; 時(shí)間梯度: 0—40min; 濃度梯度: 5%—50%; 進(jìn)樣量10μL(尹利昂等, 2009)。

1.4.8 氣相色譜法(GC)測定短鏈脂肪酸 取 2mL培養(yǎng)液12000r/min離心10min, 取上清液, 加入1/10體積 50% H2SO4, 再加入 3倍體積乙醚, 振蕩混勻

35min, 12000r/min離心 10min, 收集乙醚層, 濃縮,用于氣相色譜分析(Zhang et al, 2012)。氣相色譜條件:載氣: N2; 分流比: 20∶1; 流速: 3mL/min; 色譜柱:HP-INNOWAS; 升溫程序: 80°C保持0.5min, 以8°C /min 升到 150°C, 保持 1min, 再以 20°C/min 升到200°C, 保持 5min; 進(jìn)樣口溫度: 250°C; 進(jìn)樣量: 1μL;檢測器: FID; 檢測器溫度: 250°C。

1.4.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用 Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(X±S)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻聚糖硫酸酯化學(xué)性質(zhì)的比較

海帶巖藻聚糖硫酸酯的分子量很高, 大于500kDa, 經(jīng)過自由基氧化降解, 多糖的分子量顯著下降。圖1為高效凝膠色譜法測定低分子量巖藻聚糖硫酸酯分子量的色譜圖。采用系列分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算得到低分子量巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量為 7.74kDa, 分散系數(shù)為 1.02。在自由基氧化降解過程中, 糖鏈上硫酸根含量低的葡萄糖醛酸、甘露糖、半乳糖容易被 降解成單糖和寡糖, 在用500Da的透析袋透析的過程中, 部分寡糖和單糖損失, 因此, 造成高分子量和低分子量巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成之間存在差異。

圖1 低分子量巖藻聚糖硫酸酯分子量測定的高效液相色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram showing the molecular weight of LMWF注: 5000Da: 5000Da的硫酸葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品; 6000—10000Da:6000—10000Da的硫酸葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品

2.2 人體腸道微生物對巖藻聚糖硫酸酯的降解利用

高分子量和低分子量巖藻聚糖硫酸酯經(jīng)不同人的腸道微生物發(fā)酵培養(yǎng)后, 采用TLC和PAGE分析巖藻聚糖硫酸酯的降解情況。

圖2為TLC分析不同分子量巖藻聚糖硫酸酯在腸道微生物酵解前后其寡糖含量的變化。圖 2a中TLC分析表明, 低分子量巖藻聚糖硫酸酯中含有較多單糖、寡糖和多糖。 被腸道微生物酵解48h之后,No.1、No.2 和No.5中的寡糖幾乎是完全降解, No.3和No.4中的寡糖被部分降解。而圖2b中TLC分析表明, 高分子量巖藻聚糖硫酸酯中不含寡糖, 但是酵解48h后, 可以看到有少量的寡糖生成, 多糖部分降解程度很低, 這說明只有少量高分子量巖藻聚糖硫酸酯被腸道微生物降解利用。比較發(fā)現(xiàn), 巖藻聚糖硫酸酯寡糖更容易被腸道微生物降解利用, 而高分子量巖藻聚糖硫酸酯很難被腸道微生物降解利用。

圖2 TLC分析Nos.1—5人腸道微生物降解低分子量和高分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯Fig.2 TLC analysis on the LMWF and HMWF after being degraded by Nos.1—5 human gut microbiota注: 1: 巖藻糖單糖; 2: 硫酸軟骨素酶解產(chǎn)物; Nos.1—5: 依次為Nos.1—5志愿者的腸道微生物對高、低巖藻聚糖硫酸酯的降解

圖3 PAGE 分析Nos.1—5腸道微生物降解低分子量和高分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯Fig.3 PAGE analysis on the LMWF and HMWF after being degraded by Nos.1—5 human gut microbiota注: 1: 40kDa的葡聚糖; 2: 10kDa的葡聚糖; 3: 硫酸軟骨素酶解產(chǎn)物; a-4: 低分子量巖藻聚糖原糖; b-4: 高分子量巖藻聚糖原糖; 5—9: 依次為Nos.1—5志愿者的腸道微生物對低分子量巖藻聚糖硫酸酯或高分子量巖藻聚糖硫酸酯的酵解產(chǎn)物

圖 3為 PAGE分析不同分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯在腸道微生物酵解前后高分子量部分的降解情況, 分子量采用10kDa和40kDa的硫酸葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)對照。圖3a PAGE分析表明, 酵解48h后, 低分子量巖藻聚糖硫酸酯分子量分布在 10—20kDa之間的組分顯著減少, 說明分子量在10—20kDa的低分子量巖藻聚糖硫酸酯也能夠被腸道菌群降解利用。圖 3b PAGE分析表明, 高分子量巖藻聚糖硫酸酯分子量大于20kDa, 酵解48h后, 高分子量組分的含量有所下降, 說明高分子量巖藻聚糖硫酸酯有少量能被腸道微生物降解。

結(jié)合TLC與PAGE的結(jié)果表明, 腸道微生物對高分子量巖藻聚糖硫酸酯利用度很低, 當(dāng)巖藻聚糖硫酸酯被自由基降解產(chǎn)生寡糖和 10—20kDa的低分子量多糖時(shí), 才能很好地被腸道微生物降解利用。

2.3 發(fā)酵前后單糖組成的變化

表 1為巖藻聚糖硫酸酯經(jīng)人腸道微生物酵解前后的單糖組成比較。高分子量巖藻聚糖硫酸酯中單糖組成復(fù)雜, 主要含有巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和葡萄糖, 還含有微量的氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖和木糖。酵解48h后, 發(fā)酵體系中, 高分子量巖藻聚糖硫酸酯中巖藻糖的含量明顯升高,半乳糖和甘露糖的含量有所降低, 說明人體腸道生物對高分子量巖藻聚糖硫酸酯中的半乳糖和甘露糖成分利用較多。低分子量巖藻聚糖硫酸酯主要是由巖藻糖和半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成。發(fā)酵48h后, 發(fā)酵體系中剩余的低分子量巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成基本不變。結(jié)合TLC和PAGE分析結(jié)果表明, 腸道微生物能夠很好地降解利用低分子量巖藻聚糖硫酸酯, 但是對低分子量巖藻聚糖硫酸酯的利用沒有選擇性, 剩余組分的單糖仍然保留原糖的結(jié)構(gòu)組成。

由表1可看出, 高分子量和低分子量巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成之間存在差異, 這是由于高分子量藻聚糖硫酸酯在自由基降解制備低分子量巖藻聚糖硫酸酯時(shí), 糖鏈上硫酸根含量低的葡萄糖醛酸、甘露糖、半乳糖容易被降解成單糖和寡糖, 這些單糖和寡糖有可能在透析除鹽的過程中部分損失。

2.4 發(fā)酵前后短鏈脂肪酸的測定結(jié)果

表 2為人腸道微生物厭氧酵解后巖藻聚糖硫酸酯發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的變化。腸道微生物在低分子量巖藻聚糖硫酸酯培養(yǎng)基中發(fā)酵48h后, 發(fā)酵液中主要產(chǎn)生乙酸和丙酸, 還有少量的丁酸, 說明腸道微生物能將低分子量巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)一步降解為乙酸、丙酸和丁酸。而腸道微生物在高分子量巖藻聚糖硫酸酯培養(yǎng)基中發(fā)酵48h后, 乙酸、丙酸、丁酸的含量有明顯增加, 說明腸道微生物也能將高分子量巖藻聚糖硫酸酯降解為乙酸、丙酸和丁酸, 但同時(shí)產(chǎn)生了少量的異丁酸、異戊酸、戊酸, 說明腸道微生物對蛋白質(zhì)進(jìn)行了無氧酵解(周中凱等, 2014)。由此可見, 低分子量巖藻聚糖硫酸酯和高分子量巖藻聚糖硫酸酯均能被腸道微生物降解生成短鏈脂肪酸, 但是低分子量巖藻聚糖硫酸酯可以特異性地抑制腸道微生物對蛋白質(zhì)的無氧酵解。

表1 人腸道菌群酵解對巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成的影響Tab.1 Changes in monosaccharide composition of fucoidan of different molecular weights after human gut microbial degradation

表2 人腸道微生物厭氧酵解巖藻聚糖硫酸酯后短鏈脂肪酸的變化Tab.2 The contents of short-chain fatty acids in fucoidan medium after human gut microbiota fermentation in anaerobic culture systemin vitro

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別用五個(gè)志愿者的腸道微生物降解高分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯和低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯, 發(fā)現(xiàn)低分子量巖藻聚糖硫酸酯中的寡糖基本被消耗殆盡, 且低分子量巖藻聚糖硫酸酯組分中10—20kDa的巖藻聚糖也部分被消耗, 但是發(fā)酵體系中剩余的巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成基本不變,這說明腸道微生物能夠很好地降解利用低分子量巖藻聚糖硫酸酯, 對巖藻聚糖硫酸酯中各種單糖的利用沒有選擇性。推斷腸道微生物產(chǎn)生的多糖降解酶種類很多, 不僅能降解巖藻糖苷鍵, 而且能降解甘露糖、半乳糖、葡萄糖和糖醛酸等。然而, 只有少量分子量大于 20kDa的高分子量巖藻聚糖硫酸酯被降解成為寡糖, 且其單糖成分中的半乳糖和甘露糖被利用得較多, 這說明腸道微生物對巖藻聚糖硫酸酯降解利用的難易程度與其分子量的大小有關(guān)。研究結(jié)果與Li(李苗苗, 2014; Li et al, 2014)研究腸道微生物降解瓊膠和卡拉膠結(jié)果類似, 腸道微生物只能降解利用瓊膠和卡拉膠寡糖, 而對高分子量瓊膠和卡拉膠降解能力很低, 腸道微生物中產(chǎn)生了β-瓊膠酶和κ-卡拉膠酶。本研究中腸道微生物對復(fù)雜的巖藻聚糖硫酸酯的降解進(jìn)一步證明, 腸道微生物也能夠產(chǎn)生降解巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和糖醛酸的糖苷鍵的酶。

低分子量巖藻聚糖硫酸酯培養(yǎng)基在被腸道微生物酵解之后產(chǎn)生了乙酸、丙酸、丁酸, 研究證明短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)主要是由厭氧菌對不消化的碳水化合物酵解產(chǎn)生的, 其不僅為腸道微生物生長繁殖和結(jié)腸粘膜提供能量, 而且還能維護(hù)粘膜免疫細(xì)胞, 減少促炎癥因子生成, 修復(fù)粘膜炎癥, 有利于人體的健康(許勤等, 1999)。然而高分子量巖藻聚糖硫酸酯發(fā)酵液中不僅產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸, 還生成了少量異丁酸和異戊酸, 這些支鏈脂肪酸(異丁酸、異戊酸)并不是糖酵解的產(chǎn)物, 而是由支鏈氨基酸厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的, 支鏈氨基酸厭氧發(fā)酵還會(huì)產(chǎn)生氨類、酚類、吲哚等對人體有害的物質(zhì)(周中凱等, 2014)。

4 結(jié)論

人體腸道微生物能夠很好地降解利用低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯, 同時(shí)經(jīng)人體腸道微生物發(fā)酵后只產(chǎn)生了乙酸、丙酸、丁酸, 抑制了蛋白質(zhì)的厭氧酵解, 說明低分子量巖藻聚糖硫酸酯比高分子量巖藻聚糖硫酸酯更有利于人體腸道的健康, 為更深一步地探究巖藻多糖與腸道微生物的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

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