王慶恒 張家煒 郝瑞娟 黃榮蓮 杜曉東

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524088)

光裸星蟲(Sipunculus nudus)又名裸體方格星蟲,為星蟲動(dòng)物門習(xí)見種, 廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶的海洋潮間帶沿岸至 30m水深的海域, 是華南地區(qū)重要的海珍品之一, 具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來,光裸星蟲已逐漸成為北部灣沿岸地區(qū)海水養(yǎng)殖新品種, 人工增養(yǎng)殖技術(shù)研究涉及繁殖周期(郭學(xué)武等,1993)、親體培育(鄒杰等, 2010)、苗種培育(蔣艷等,2010)、餌料開發(fā)(張琴等, 2012)、機(jī)械化采捕(陳振國(guó)等, 2015)等各個(gè)環(huán)節(jié)。目前, 光裸星蟲的基礎(chǔ)生物學(xué)研究相對(duì)薄弱。

配子發(fā)生是動(dòng)物繁殖生物學(xué)研究的重要內(nèi)容,對(duì)配子發(fā)生規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征的認(rèn)識(shí)有助于提高生產(chǎn)上的親體促熟與催產(chǎn)技術(shù)水平。星蟲動(dòng)物的配子發(fā)生過程比較特別, 發(fā)生早期就從生殖腺排放到體腔, 在體腔液中游離發(fā)育至成熟。星蟲動(dòng)物部分物種的卵子發(fā)生已見研究報(bào)道。Gonse(1956)、Sawada(1975)分別用光鏡和電鏡觀察了普通戈芬星蟲(Golfingia vulgaris)和戈芬星蟲(lkedai)體腔中的卵細(xì)胞發(fā)育過程, 分為6個(gè)和5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期。Rice(1974, 1988,1989); Rice等(2012)在多種星蟲動(dòng)物配子形態(tài)、胚胎發(fā)育方面做了大量工作, 并報(bào)道了光裸星蟲成熟卵子的顯微和超微結(jié)構(gòu); 研究表明, 星蟲動(dòng)物多為雌雄異體, 不同物種卵子的形態(tài)、大小、卵膜結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育過程等方面存在明顯差異。蘭國(guó)寶等(2002)報(bào)道光裸星蟲卵細(xì)胞分期成熟, 分批產(chǎn)卵, 在廣西海區(qū)的繁殖期為 4—9月, 繁殖盛期為 5—8月。王慶恒等(2005)利用石蠟切片觀察了光裸星蟲卵子發(fā)生的顯微結(jié)構(gòu), 將卵母細(xì)胞發(fā)育劃分為小生長(zhǎng)期、大生長(zhǎng)期、成熟前期和成熟期 4個(gè)階段。顧曉英等(2009)報(bào)道,可口革囊星蟲(Phascolosoma esculenta)卵子發(fā)生過程可劃分為6個(gè)階段, 卵母細(xì)胞無(wú)濾泡膜, 生發(fā)泡破裂是成熟的標(biāo)志。竺俊全等(2012)研究發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲卵母細(xì)胞的卵黃發(fā)生途徑包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器演變成卵黃粒以及吞飲作用形成卵黃粒, 卵黃膜由卵母細(xì)胞自體形成, 由纖維層、致密層、粒狀突層及外膜構(gòu)成。但是尚未有光裸星蟲卵子發(fā)生過程的超微結(jié)構(gòu)觀察的詳盡報(bào)道。本研究利用透射和掃描電鏡技術(shù)觀察了光裸星蟲卵子發(fā)育過程中的超微結(jié)構(gòu)的變化, 旨在積累光裸星蟲卵子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)資料, 為探究光裸星蟲卵子發(fā)生機(jī)制,以及生殖調(diào)控與人工繁殖技術(shù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用光裸星蟲采集自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地?；铙w帶回實(shí)驗(yàn)室后置于30L底部鋪有 8cm細(xì)沙的塑料水槽中, 在鹽度為 30的海水中,不投餌、微充氣條件下暫養(yǎng) 24h, 選擇鉆沙有力、體表無(wú)損傷的健康個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

先用過濾海水清洗光裸星蟲體表沙粒。然后用5mL無(wú)菌注射器吸取 3mL2.5%戊二醛后, 抽取 2mL星蟲體腔液并轉(zhuǎn)移至離心管中, 加入 5mL2.5%戊二醛預(yù)固定; 光學(xué)顯微鏡下鏡檢體腔液中的生殖細(xì)胞進(jìn)行雌雄鑒定; 將預(yù)固定20min后的雌性生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2.5%戊二醛中繼續(xù)固定40min; 0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌3次; 1%鋨酸固定45min, 0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌3次; 50%—100%乙醇逐級(jí)脫水后, 將沉淀細(xì)胞分為兩部分。一部分細(xì)胞以叔丁醇替代乙醇,JFD-310真空冷凍儀干燥5min, JFC-1600離子濺射儀中表面鍍膜 180s, JSM-6300 LV掃描電子顯微鏡觀察、拍照。另一部分細(xì)胞以環(huán)氧丙烷為過渡劑,Epon812包埋; Leica EM UC7超薄切片機(jī)切片; 2%醋酸雙氧鈾(15—20min)和 3.52%檸檬酸鉛(10min)雙染色; JEM-1400透射電子顯微鏡觀察、拍照。利用電鏡成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行細(xì)胞直徑、卵黃膜厚度等長(zhǎng)度測(cè)量,測(cè)量5次后取平均值。

2 結(jié)果

光裸星蟲體腔液中可見到游離發(fā)育的卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞。根據(jù)卵母細(xì)胞細(xì)胞器及細(xì)胞核的形態(tài)、卵黃發(fā)生情況、卵膜結(jié)構(gòu)變化等特征, 可將卵母細(xì)胞的發(fā)育分為卵黃形成前期、卵黃形成初期、卵黃旺盛合成期和成熟期4個(gè)階段。

2.1 卵原細(xì)胞

光裸星蟲卵原細(xì)胞呈卵圓形或近圓形, 長(zhǎng)徑約9—11μm, 短徑為 7—9μm, 表面有皺褶(圖 1a); 核質(zhì)比大, 核呈卵圓形或近圓形, 長(zhǎng)徑約 5—6μm, 短徑約 4—5μm, 核膜平滑, 核孔很少; 核內(nèi)染色質(zhì)聚集為粗大顆粒沿核膜分布或在核內(nèi)分散分布; 核仁小, 1個(gè), 中位或偏位(圖 1b)。細(xì)胞質(zhì)較少, 細(xì)胞器不發(fā)達(dá), 可見少量線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。線粒體近圓形, 嵴少, 呈空泡狀; 高爾基體不發(fā)達(dá), 膜囊數(shù)量少; 有少量囊泡狀光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖 1c)。

卵原細(xì)胞外附有1—2個(gè)濾泡細(xì)胞。濾泡細(xì)胞呈扁盤狀, 表面有大量皺褶(圖 1a); 核質(zhì)比很大, 細(xì)胞核扁盤狀, 占據(jù)細(xì)胞大部分體積, 長(zhǎng)徑約為短徑的 3倍, 核內(nèi)染色質(zhì)電子密度高, 沿核膜聚集分布; 細(xì)胞質(zhì)薄而延展, 有少量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器(圖1b、d)。濾泡細(xì)胞和卵原細(xì)胞的質(zhì)膜緊密相貼(圖1d)。

圖1 光裸星蟲卵原細(xì)胞及濾泡細(xì)胞Fig.1 The oogonium and follicular cells of S. nudus注: 子圖a: 卵原細(xì)胞, 長(zhǎng)徑和短徑分別為9.7μm和8.6μm; 濾泡細(xì)胞, 長(zhǎng)徑和短徑分別為5.9μm和1.3μm。b: 卵原細(xì)胞與濾泡細(xì)胞, 示細(xì)胞核。c: 卵原細(xì)胞局部, 示線粒體和高爾基體。d: 濾泡細(xì)胞局部, 示細(xì)胞核、線粒體、卵原細(xì)胞與濾泡細(xì)胞質(zhì)膜緊密相貼。圖中字符Cm: 細(xì)胞膜; F: 濾泡細(xì)胞; G: 高爾基體; M: 線粒體; N: 細(xì)胞核; Og: 卵原細(xì)胞

2.2 卵黃形成前期卵母細(xì)胞

卵黃形成前期卵母細(xì)胞呈圓形或近圓形, 直徑約10—25μm(圖2a), 但核質(zhì)比減小(圖2b), 細(xì)胞核圓,中位或稍偏位; 核膜平滑, 染色質(zhì)為細(xì)小顆粒狀, 分散分布在細(xì)胞核中; 具1個(gè)明顯的核仁, 偏位或中位(圖 2b); 核孔增多, 高電子密度的核仁外排物通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(圖 2c)。細(xì)胞質(zhì)中尚未明顯積累卵黃,游離核糖體較多, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體數(shù)量有所增加。

卵母細(xì)胞質(zhì)膜外開始形成卵黃膜, 分為兩層: 外層為顆粒層, 具有密集的中等電子密度的顆粒, 顆粒直徑約為 50nm, 顆粒層表面分布有電子密度很高的不連續(xù)的粒狀突; 內(nèi)層為疏松層, 呈電子密度較低的均質(zhì)結(jié)構(gòu)(圖 2d)。初始時(shí), 顆粒層先于均質(zhì)層增厚,達(dá)到 600—700nm 時(shí), 不再生長(zhǎng); 疏松層開始很薄,但在發(fā)育過程中可不斷增厚并發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。卵黃膜遍布微孔, 微孔為漏斗狀, 側(cè)壁在卵黃膜外表面一端形成樹枝狀分支連接粒狀突(圖2d)。

隨著卵母細(xì)胞的生長(zhǎng), 濾泡細(xì)胞分裂增殖, 數(shù)量逐漸增多, 包裹在卵母細(xì)胞外形成疏松的單層濾泡膜(圖2a)。濾泡細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化, 染色質(zhì)沿核膜或在核內(nèi)聚集分布(圖 2b、e)。濾泡細(xì)胞與卵黃膜間形成電子密度極低的膠質(zhì)膜(圖2d、e), 可隨卵子發(fā)育而逐漸增厚。膠質(zhì)膜有弱黏性。

圖2 光裸星蟲卵黃形成前期卵母細(xì)胞Fig.2 The oocyte in the pre-vitellogenic stage of S. nudus注: 子圖a: 卵黃形成前期卵母細(xì)胞, 直徑為20.9μm, 示濾泡細(xì)胞。b: 卵黃形成前期卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞, 示卵母細(xì)胞核、核仁。c: 卵黃形成前期卵母細(xì)胞核膜與核仁外排物。d: 卵黃膜由顆粒層和均質(zhì)層構(gòu)成; 顆粒層表面有電子密度很高的粒狀突, 卵黃膜孔側(cè)壁形成分支狀結(jié)構(gòu)連接粒狀突。e: 濾泡細(xì)胞, 示細(xì)胞核, 濾泡細(xì)胞與卵黃膜間有膠質(zhì)膜形成。圖中字符A: 分支狀連接結(jié)構(gòu); J: 膠質(zhì)膜; Nu: 核仁;NE: 核膜; NuE: 核仁外排物; Oc: 卵母細(xì)胞; P: 粒狀突; PM: 卵黃膜微孔; VM: 卵黃膜; V1: 卵黃膜外層(顆粒層); V2: 卵黃膜中層(均質(zhì)層)

2.3 卵黃形成初期卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞直徑增大至25μm左右開始進(jìn)入卵黃形成初期(圖 3a), 由于膠質(zhì)膜易于破裂, 掃描電鏡下, 卵黃膜上的微孔清晰可見(圖 3b), 卵質(zhì)中出現(xiàn)少量卵黃粒(圖 3c)。卵黃膜增厚至 1.5—4μm, 其中,顆粒層厚度基本保持不變; 均勻?qū)釉龊衩黠@(圖3d)。微孔外側(cè)開口擴(kuò)大, 使卵黃膜膜孔處的切面呈“山丘”狀, 粒狀突明顯, 膜孔側(cè)壁的分支連接結(jié)構(gòu)增粗(圖3e)。濾泡細(xì)胞仍然為單層, 細(xì)胞質(zhì)中可見少量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器。由于膠質(zhì)膜有所增厚, 濾泡細(xì)胞與卵黃膜間距離加大(圖 3d)。?

圖3 光裸星蟲卵黃形成初期卵母細(xì)胞及其卵膜Fig.3 The oocyte and envelope in the primary vitellogenic stage of S. nudus注: 子圖a: 卵黃形成初期卵母細(xì)胞, 直徑為35.5μm, 示濾泡細(xì)胞、膠質(zhì)膜和卵黃膜。b: 卵黃膜微孔, 微孔開口平均直徑300 nm。c: 卵黃形成初期卵母細(xì)胞, 示濾泡細(xì)胞、膠質(zhì)膜和卵黃膜, 胞質(zhì)內(nèi)有零星卵黃粒形成。d: 卵黃膜顆粒層厚650-700nm, 均質(zhì)層厚1000—1100nm, 示膠質(zhì)膜、濾泡細(xì)胞。e: 卵黃膜孔側(cè)壁的分支狀連接結(jié)構(gòu)增粗。圖中字符Y: 卵黃粒

卵母細(xì)胞核增大, 位于細(xì)胞中部; 核仁大, 偏位;部分染色質(zhì)形成高電子密度的團(tuán)塊散布于核內(nèi); 核膜不平整, 形成多個(gè)突起伸入細(xì)胞質(zhì)區(qū)域, 核周池明顯, 核仁外排物明顯增多(圖4a、b)。細(xì)胞質(zhì)中游離核糖體豐富, 顆粒增大, 常形成多聚核糖體; 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá), 呈囊泡狀, 上面密布核糖體; 偶見光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成不規(guī)則的多片層結(jié)構(gòu); 高爾基體膜囊和分泌泡的數(shù)量均明顯增加; 線粒體數(shù)量多, 部分線粒體嵴短少,呈空泡狀(圖4b、c); 細(xì)胞質(zhì)中常見髓樣小體(圖4e)。

根據(jù)電子密度的差異可將卵黃粒分為2種類型。其中, I型卵黃電子密度高, 有單層膜包裹, 始終保持圓形或橢圓形結(jié)構(gòu), 周圍常伴有大小不等的囊泡狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4c), 甚至被粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍(圖4d)。II型卵黃粒電子密度中等, 形態(tài)為近圓形(圖 4f)。卵黃發(fā)生初期, 卵母細(xì)胞胞質(zhì)中主要合成I型卵黃粒。

2.4 卵黃旺盛合成期的卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞直徑增大至40μm左右時(shí)開始大量積累卵黃, 進(jìn)入卵黃旺盛合成期。細(xì)胞直徑迅速擴(kuò)大, 在制樣過程中膠質(zhì)膜因脫水等操作而發(fā)生顯著的收縮并易于破裂、脫落(圖5a、b), 卵黃膜膜孔的膜外開口明顯擴(kuò)大(圖5c、d)。卵黃膜逐漸增厚至4—8μm, 超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變: 均質(zhì)層密度發(fā)生變化, 形成很多基本平行于卵子表面的纖維(圖 5e), 并逐漸加粗(圖5f)。在纖維層與卵子質(zhì)膜之間出現(xiàn)致密的卵黃膜內(nèi)層,電子密度很高, 多在膜孔末端開始形成(圖 5e), 厚度可達(dá)2—2.5μm(圖5f)。此時(shí), 卵黃膜由外向內(nèi)分為外層(顆粒層)、中層(纖維層)和內(nèi)層(致密層)。卵黃膜微孔的開口逐漸增大, 微孔通道橫切面顯示, 通道由多個(gè)低電子密度的近圓形區(qū)域圍成一圈, 構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu), 每個(gè)圓形區(qū)域中央有1個(gè)電子密度很高的核心區(qū);在環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)外兩側(cè)是卵黃膜外層顆粒(圖5g)。

卵母細(xì)胞核膜不平整, 有多個(gè)突起伸入胞質(zhì)區(qū)域, 核內(nèi)具1個(gè)粗大的核仁, 在核膜附近區(qū)域常見核仁外排物(圖6a)。高爾基體數(shù)量很多, 部分成對(duì)出現(xiàn),扁平膜囊數(shù)量多, 附近有大量分泌泡(圖 6b); 線粒體顯著增加, 常聚集在一起, 部分線粒體呈桿狀(圖6c)。

II型卵黃粒數(shù)量迅速增加, 并不斷融合為大塊的無(wú)定形卵黃塊(圖 6d); I型卵黃粒逐漸被擠壓至卵質(zhì)邊緣區(qū)域, 但不發(fā)生融合, 也不與 II型卵黃粒融合(圖 6e)。初期, 卵黃粒的分布不均勻, 近核區(qū)域卵黃粒較少(圖 6a); 隨著發(fā)育進(jìn)行, 近核區(qū)域也逐漸被卵黃粒填滿。

圖4 光裸星蟲卵黃形成初期卵母細(xì)胞的細(xì)胞器和卵黃Fig.4 The organelle and yolk of oocyte in the primary vitellogenic stage of S. nudus注: 子圖a: 卵黃形成初期卵母細(xì)胞局部, 示細(xì)胞核及核膜突起。b: 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的多片層結(jié)構(gòu)、核膜和核孔復(fù)合體。c: 細(xì)胞質(zhì)局部,示高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體和I型卵黃粒。d: 被粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包圍的I型卵黃粒。e: 髓樣小體。f: II型卵黃粒。圖中字符L: 溶酶體; MB: 髓樣小體; NPC: 核孔復(fù)合體; R: 核糖體; RER: 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng); SER: 光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng); YI: I型卵黃; YII: II型卵黃

圖5 光裸星蟲卵黃旺盛合成期卵母細(xì)胞及其卵膜Fig.5 The oocyte and envelope in the active vitellogenic stage of S. nudus注: 子圖a:卵黃旺盛合成期初期的卵母細(xì)胞, 直徑50μm, 膠質(zhì)膜發(fā)生較多破裂。b: 卵黃旺盛合成期后期的卵母細(xì)胞, 直徑130μm, 膠質(zhì)膜易于脫落。c: 圖a卵黃膜局部放大, 膜孔開口平均直徑375nm。d: 子圖b卵黃膜局部放大, 膜孔開口平均直徑1.7μm。e: 卵黃旺盛合成期中期卵母細(xì)胞, 卵黃膜中層增厚約6μm并出現(xiàn)纖維化, 開始形成高電子密度的卵黃膜內(nèi)層。f: 卵黃旺盛合成期后期卵母細(xì)胞, 卵黃膜內(nèi)層厚達(dá)2.8—4.4μm, 中層明顯纖維化, 示卵母細(xì)胞質(zhì)膜。g: 微孔通道橫切面, 有多個(gè)低電子密度的近圓形區(qū)域圍成一圈, 構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu), 每個(gè)圓形區(qū)域中央有1個(gè)電子密度很高的核心區(qū)。圖中字符V3: 卵黃膜內(nèi)層(致密層)

圖6 光裸星蟲卵黃形成初期卵母細(xì)胞的細(xì)胞器和卵黃Fig.6 The organelle and yolk of oocyte in the active vitellogenic stage of S. nudus注: 子圖a: 卵黃旺盛合成期卵母細(xì)胞局部, 示細(xì)胞核、核仁, 近核區(qū)域尚未被卵黃占據(jù)。b: 成對(duì)出現(xiàn)的高爾基體。c: 大量聚集出現(xiàn)的線粒體。d: II型卵黃粒融合為大塊的無(wú)定形卵黃塊。e: I型卵黃粒被擠壓至卵質(zhì)邊緣區(qū)域, 但不發(fā)生融合。圖中字符YB: 卵黃塊

2.5 成熟期的卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞直徑約為 160μm左右時(shí)發(fā)育成熟。成熟卵母細(xì)胞的膠質(zhì)膜可厚達(dá) 20—25μm, 但最終將和濾泡細(xì)胞一起脫落; 膠質(zhì)膜已脫落的成熟的卵母細(xì)胞經(jīng)后腎管收集, 排放到海水中可進(jìn)行受精。電鏡制樣過程中, 膠質(zhì)膜極易破裂脫落, 暴露出卵黃膜(圖7a), 卵黃膜膜孔開口可達(dá) 2—2.5μm(圖 7c)。細(xì)胞核仍然可見, 但核膜突起逐漸回縮, 核仁外排物少見(圖7b)。卵黃膜增厚至9—12μm, 中層的纖維數(shù)量增至20余條(圖7d、e), 每條纖維由大量高電子密度的短棒狀結(jié)構(gòu)平行排列而構(gòu)成(圖 7f); 內(nèi)層厚度不均,甚至局部減小(圖7d)或消失(圖7e)。

濾泡細(xì)胞核逐漸發(fā)生縊縮, 染色質(zhì)固縮并集聚在核膜下, 走向凋亡(圖7g)。

3 討論

3.1 卵子發(fā)生過程中細(xì)胞器的變化特點(diǎn)及其作用

無(wú)脊椎動(dòng)物的卵黃可分為內(nèi)源性卵黃與外源性卵黃。其中, 前者主要在卵黃發(fā)生早期, 由卵母細(xì)胞自身的細(xì)胞器合成。已有研究指出, 線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器均可以通過物質(zhì)積累轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)源性卵黃粒。顧海龍等(2013)報(bào)道泥蚶(Tegillarca granosa)卵黃合成中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最重要, 高爾基體也參與形成卵黃。朱冬發(fā)等(2006)報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是東方扁蝦最重要的內(nèi)源性卵黃合成胞器, 未觀察到高爾基體液泡參與卵黃?；蛑蔚男纬?。姜永華等(2005)認(rèn)為囊泡狀粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)卵黃合成中最主要的細(xì)胞器, 高爾基體不直接形成卵黃粒。吳明燦等(2015)則認(rèn)為高爾基體、線粒體和核糖體是糙海參(Holothuria scabra)主要的內(nèi)源性卵黃合成細(xì)胞器。

本研究發(fā)現(xiàn), 光裸星蟲卵母細(xì)胞發(fā)育過程中, 游離核糖體是最早大量增加的細(xì)胞器。從功能分析, 這些快速增加的核糖體的合成產(chǎn)物除了形成內(nèi)源性卵黃以外, 也為細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的增加奠定基礎(chǔ)。進(jìn)入卵黃形成初期后, 卵母細(xì)胞中溶酶體數(shù)量明顯增多; 而首先形成的I型卵黃粒具有單層膜包裹, 電子密度和形態(tài)均與溶酶體相似。因此, 推測(cè)I型卵黃粒由溶酶體演變形成, 是內(nèi)源性卵黃。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不直接轉(zhuǎn)變?yōu)槁腰S粒, 而是圍繞在 I型卵黃粒周圍, 為其生長(zhǎng)提供卵黃蛋白等營(yíng)養(yǎng)物。在卵黃積累過程中, 線粒體數(shù)量明顯增加, 盡管有部分線粒體呈空泡狀, 但未觀察到線粒體基質(zhì)中電子密度明顯增大、積累大量沉積物的現(xiàn)象, 因此, 光裸星蟲線粒體只是為細(xì)胞代謝提供能量, 間接參與卵黃形成, 而不直接轉(zhuǎn)變?yōu)槁腰S粒。光裸星蟲卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中沒有明顯的脂滴形成,但在卵黃旺盛合成期, 細(xì)胞中的高爾基體及其分泌囊泡數(shù)量明顯增加, 基于高爾基體功能的復(fù)雜性和多樣性, 推測(cè)高爾基體可能在多個(gè)方面參與了光裸星蟲卵母細(xì)胞發(fā)育, 包括內(nèi)膜系統(tǒng)駐留蛋白合成、膜脂合成、膜蛋白糖基化等。

本研究發(fā)現(xiàn), 光裸星蟲卵母細(xì)胞直徑達(dá)到 40μm以上時(shí), II型卵黃快速增加, 未觀察到II型卵黃與細(xì)胞器之間的密切聯(lián)系, 推測(cè) II型卵黃主要屬于外源性卵黃。光裸星蟲身體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 臟器皆浸浴在體腔液中, 僅有消化道和后腎管, 無(wú)肝胰臟等器官; 另一方面, 如后文所述, 光裸星蟲濾泡細(xì)胞缺乏物質(zhì)合成與分泌能力, 而是發(fā)揮選擇性吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)作用。因此,光裸星蟲外源性卵黃前體物質(zhì)可能由腸道分泌到體腔液中。這與雙殼類的外源性卵黃來源于消化腺(曾志南等, 1991; 應(yīng)雪萍, 2002; 顧海龍等, 2013)及甲殼類外源性卵黃可能來源于肝胰腺(堵南山等, 1999)或是濾泡細(xì)胞(洪水根, 1992)不同。操向文等(2009)利用石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn), 光裸星蟲腸壁薄, 漿膜層有大量圓形的顆粒細(xì)胞, 這些顆粒細(xì)胞在釋放了胞質(zhì)顆粒后呈空泡狀。某些類型的顆粒細(xì)胞的分泌活動(dòng)是否與外源性卵黃的合成有關(guān)值得深入研究。

與光裸星蟲不同, 可口革囊星蟲卵黃卵黃旺盛合成期卵母細(xì)胞中有大量脂滴(竺俊全等, 2012)。類似的近緣物種卵子物質(zhì)積累的差異在甲殼動(dòng)物中已有報(bào)道。楊筱珍等(2009)比較發(fā)現(xiàn), 三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)卵母細(xì)胞中存在大量脂滴, 但日本新糠蝦(Neomysis japonica)卵子中卻沒有脂滴分布。研究表明, 甲殼動(dòng)物卵母細(xì)胞的脂滴主要由中性脂構(gòu)成, 胚胎發(fā)育過程較長(zhǎng)的物種的卵母細(xì)胞含有較多中性脂(成永旭等, 1999)。在28—29°C條件下, 可口革囊星蟲胚胎發(fā)育時(shí)間為 45h30min(金春華等, 2011), 光裸星蟲胚胎發(fā)育時(shí)間為38—40h(蘭國(guó)寶等, 2003), 胚胎發(fā)育時(shí)間的差異可能與卵母細(xì)胞中脂滴(中性脂)積累存在相關(guān)性, 但需要更多研究證據(jù)。

3.2 卵子發(fā)生過程中卵膜結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)及其作用

已知的星蟲動(dòng)物卵子均具有厚而分層的卵黃膜,并有很多卵膜孔。本研究發(fā)現(xiàn), 光裸星蟲卵母細(xì)胞的卵黃膜分為三層。其中, 中層為卵黃膜的主體, 初始時(shí)為低電子密度的均質(zhì)結(jié)構(gòu), 很薄, 在卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中不斷增厚, 可達(dá) 9—12μm, 并不斷發(fā)生纖維化, 形成 20余條基本平行于卵子質(zhì)膜表面的粗大纖維。作者認(rèn)為, 這種較厚而致密的卵黃膜有助于卵母細(xì)胞緩沖機(jī)械壓力, 是星蟲動(dòng)物對(duì)卵子游離發(fā)育方式的一種保護(hù)性適應(yīng); 卵膜孔作為外源性物質(zhì)進(jìn)入卵母細(xì)胞的通道, 可解決較厚的卵黃膜與大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)跨卵黃膜運(yùn)輸?shù)拿?。竺俊全?2012)認(rèn)為可口革囊星蟲成熟卵母細(xì)胞的卵膜孔未關(guān)閉, 體腔液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)仍可通過微孔進(jìn)入卵內(nèi)。此外, 作者在胚胎發(fā)育觀察中發(fā)現(xiàn), 光裸星蟲卵膜孔與原腸胚體表纖毛形成存在相關(guān)性(另文發(fā)表)。

與大多數(shù)星蟲卵母細(xì)胞卵黃膜裸露不同, 光裸星蟲卵黃膜外具有一層透明的膠質(zhì)膜。蘭國(guó)寶等(2002)顯微觀察認(rèn)為, 光裸星蟲卵細(xì)胞直徑在 70μm以上時(shí), 膠質(zhì)膜開始形成。本研究超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)膜在卵母細(xì)胞卵黃形成前(小于 25μm)已經(jīng)開始形成, 研究手段分辨率的顯著差異是造成本研究與上述報(bào)道結(jié)果不一致的主要原因。正常卵母細(xì)胞的膠質(zhì)膜可厚達(dá) 20—25μm, 電子密度極低, 呈完全的“透明”狀, 沒有可見的精細(xì)結(jié)構(gòu), 顯然這同樣在增強(qiáng)對(duì)卵子物理保護(hù)的同時(shí)利于物質(zhì)的運(yùn)輸。另一方面, 膠質(zhì)膜具有黏性, 推測(cè)含有較多的粘多糖, 是否存在對(duì)卵母細(xì)胞的化學(xué)保護(hù)功能還有待深入研究。

水生生物卵母細(xì)胞外常見濾泡細(xì)胞, 這些濾泡細(xì)胞(或其分化細(xì)胞)大多具有分泌功能。例如, 哲羅魚(Hucho taimen)部分濾泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育到IV時(shí)相分化為顆粒細(xì)胞, 胞內(nèi)密集分布著大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和分泌顆粒(張永泉等, 2013)。東方扁蝦的濾泡細(xì)胞富含游離核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,合成活性較強(qiáng)(朱冬發(fā)等, 2006)。本研究顯示, 光裸星蟲卵母細(xì)胞外包圍著疏松排列的單層濾泡細(xì)胞, 在卵子發(fā)育過程中, 濾泡細(xì)胞數(shù)量有所增加, 但形態(tài)結(jié)構(gòu)變化小, 細(xì)胞質(zhì)很薄, 核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器少。顯然, 這些濾泡細(xì)胞缺乏物質(zhì)合成與分泌的能力, 難以滿足卵母細(xì)胞發(fā)育對(duì)卵黃積累的需求?？煽诟锬倚窍x和革囊星蟲(agassizii)的卵母細(xì)胞外均沒有濾泡細(xì)胞, 普通戈芬星蟲的濾泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育早期階段即消失(Rice, 1989; 竺俊全等, 2012),說明這些星蟲動(dòng)物的濾泡細(xì)胞不參與合成卵黃前體物質(zhì)。成永旭等(2002)認(rèn)為鋸緣青蟹(Scylla serrata)卵泡細(xì)胞沒有合成與分泌的作用, 而是類似于“過濾器”, 允許血淋巴中的卵黃前體物質(zhì)或卵黃脂蛋白通過卵泡細(xì)胞而進(jìn)入卵母細(xì)胞。作者認(rèn)為, 光裸星蟲的濾泡細(xì)胞不是外源性卵黃的合成部位, 而是與鋸緣青蟹卵泡細(xì)胞類似, 起著選擇性吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。

本研究發(fā)現(xiàn), 采集自湛江遂溪的光裸星蟲成熟卵的膠質(zhì)膜厚約 20—25μm, 卵黃膜厚 9—12μm, 卵黃膜纖維多達(dá)20余條; Rice(1989)報(bào)道光裸星蟲波多黎各群體成熟卵的膠質(zhì)膜為 12—13μm, 卵黃膜平均厚度為 5μm, 卵黃膜纖維僅 3—4條。兩個(gè)群體成熟卵的卵膜結(jié)構(gòu)存在較大差異。光裸星蟲不同地理群體的成熟卵卵徑也存在明顯差異: 光裸星蟲坦帕灣群體(Rice, 1988)、波多黎各群體(Rice, 1989)、廈門群體(郭學(xué)武, 1993)成熟卵的平均直徑分別為120、178和170μm。地理隔離造成的群體遺傳結(jié)構(gòu)差異可能是導(dǎo)致卵徑大小和卵膜結(jié)構(gòu)差異的主要原因, 現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)光裸星蟲群體間存在明顯的遺傳分化: 王慶恒等(2008)報(bào)道了光裸星蟲湛江群體與沖繩群體的染色體數(shù)目相同, 但染色體組型明顯不同; RAPD分析(王慶恒等, 2006)、16S rRNA(Du et al, 2008)和COI(Du et al, 2009)基因序列比較均顯示, 光裸星蟲多態(tài)位點(diǎn)比例和遺傳多樣性指數(shù)較高, 群體間分化明顯。

Rice(1989)將星蟲胚胎發(fā)育分為 3種類型(D型:無(wú)幼蟲直接發(fā)育; L型: 具有完全依賴卵黃營(yíng)養(yǎng)的幼蟲期; P型: 具有以浮游生物為營(yíng)養(yǎng)的幼蟲期), 并統(tǒng)計(jì)了23種星蟲動(dòng)物的成體規(guī)格、成熟卵形狀、卵徑、卵色與胚胎發(fā)育類型之間的相關(guān)性, 結(jié)果顯示, 只有卵徑與發(fā)育類型間存在顯著相關(guān)(P＜0.05), 即D型星蟲的卵徑最大(135—280μm), L型星蟲的卵徑次之(125—175μm), P 型星蟲卵徑最小(＜125μm)?？煽诟锬倚窍x和光裸星蟲均需要經(jīng)過擔(dān)輪幼蟲、海球幼體及變態(tài)等發(fā)育階段才能發(fā)育為稚蟲, 為典型的 P型星蟲。其中, 可口革囊星蟲成熟卵卵徑約為115—140μm(顧曉英等, 2009), 與 Rice的分析結(jié)果基本一致; 但光裸星蟲波多黎各(Rice, 1989)、廈門(郭學(xué)武等,1993)、北海(蘭國(guó)寶等, 2002)、湛江群體(王慶恒等,2005)的成熟卵卵徑均達(dá)到 160μm 以上, 不符合上述規(guī)律。

4 結(jié)論

光裸星蟲卵子在體腔液中游離發(fā)育, 卵外有濾泡細(xì)胞。發(fā)育過程中, 細(xì)胞器數(shù)量、細(xì)胞核形態(tài)、卵黃發(fā)生情況、卵膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)等發(fā)生復(fù)雜變化, 可將卵母細(xì)胞的發(fā)育劃分為卵黃形成前期、卵黃形成初期、卵黃旺盛合成期和成熟期4個(gè)階段。

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