萬 江 張海燕 劉義紅 李新濤 涂勝英 吳麗敏

髓母細胞瘤(MB)是一種好發(fā)于兒童的顱內惡性腫瘤，占兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的 10%～20%，發(fā)病高峰在7歲左右，病情進展迅速，治療棘手[1,2]。常采用外科手術切除后輔助放化療，療效不理想[3,4]。MB的病因及發(fā)病機制迄今尚不明了，可能與多條細胞信號轉導通路的異常有關，其中Wnt信號轉導通路是調控細胞增殖和分化的重要途徑，腫瘤中普遍存在Wnt信號轉導通路中關鍵效應物β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的異常激活[5,6]。本研究通過構建靶向干擾β-catenin基因的shRNA的慢病毒載體，感染兒童MB細胞株DOAY，建立穩(wěn)定抑制β-catenin基因表達的細胞株，觀察β-catenin對其增殖、凋亡、侵襲和遷移等的影響。

1 方法

1.1 實驗材料 慢病毒載體包裝系統(tǒng)購自美國System Biosciences公司，其中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP質粒包含綠色熒光蛋白(GFP)基因，pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G質粒包含病毒包裝所需元件；DAOY購自中國科學院上海細胞庫；DNA凝膠回收試劑盒、BamH I和EcoR I內切酶、DNA連接試劑盒購自日本TaKaRa公司；Opti-DMEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000脂質體和TRIzol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國ABI公司；兔抗人β-catenin一抗、HRP標記的羊抗兔IgG二抗和ECL顯色試劑盒購自美國Santa Cruz公司；Annexin V/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自德國Bender公司。

1.2 靶向β-catenin的shRNA慢病毒載體的構建與包裝

1.2.1 shRNA寡核苷酸鏈的設計合成 參照文獻[7]、根據(jù)β-catenin miRNA序列(NM-BC053065.1)設計shRNA 1、2、3和陰性對照(NC)，每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結構TTCAAGAGA，正、反義鏈的5'端分別引入GATCC和AATTC，分別與BamH I和EcoR I酶切后的粘性末端互補，序列見表1，經(jīng)Blast比對與人類其他基因編碼序列無同源性，委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

表1 靶向β-catenin的shRNA寡核苷酸鏈序列

1.2.2 pCDH-shRNA慢病毒質粒構建 用BamH I和EcoR I對pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒質粒進行雙酶切， 將shRNA寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA并與雙酶切后的質粒連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽性克隆后委托上海吉瑪制藥技術有限公司測序驗證。

1.2.3 Lentivirus-shRNA慢病毒包裝和滴度測定 293T細胞用RM1640 [含10﹪胎牛血清(FBS)、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素]培養(yǎng)，接種于6孔板。通過Lipofectamine 2000介導慢病毒載體包裝系統(tǒng)的質粒共轉染293T細胞。轉染后收集含有慢病毒顆粒的細胞上清液，經(jīng)0.45 μm的過濾器過濾后獲得慢病毒純化液，通過實時熒光定量PCR測定病毒滴度。

1.3 靶向β-catenin的shRNA慢病毒的篩選 ①DOAY細胞株用RM1640(含10﹪FBS、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，細胞生長至85%融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板。②共分為5組(每組6孔)，Lentivirus(LV)-shRNA 1、2、3和NC組分別用包裝好的Lentivirus-shRNA 1、2、3和NC感染細胞，每孔加入100 μL病毒液，同時設置未用病毒感染的空白對照組(Blank)。6 h后更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。③感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況，首先在白光視野下計數(shù)細胞的總數(shù)目，再在熒光視野下計數(shù)表達熒光的細胞數(shù)目，轉染效率=(熒光表達細胞數(shù)目/白光視野細胞總數(shù))×100%，取10個視野，計算其平均值。④感染后培養(yǎng)96 h，收集各組細胞。 ⑤RT-PCR檢測細胞中β-catenin mRNA表達：細胞總RNA的提取和逆轉錄按照試劑盒的說明書進行操作，A260/A280比值1.8～2.0提示樣品RNA滿足實驗要求。以cDNA作為模板進行PCR擴增，引物系由上海吉瑪制藥技術有限公司設計和合成。β-catenin引物F：5’-GTGCTGAAGGTG-CTATCTGTCTGC-3’，

R：5’-TGAACAAGACGTTGACTTGGATCTG-3’；GAPDH引物F：5’-CATGAGAAGTAT-GACAACAGCCT-3’，R：5’-AGTCCTTCC-ACGATACCAAAGT-3’。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad分析系統(tǒng)掃描分析，目的基因相對表達量=目的基因光密度值/GAPDH光密度值。⑥Western Blot檢測細胞中β-catenin蛋白表達：提取細胞總蛋白并用BCA法測定濃度，以80 μg總蛋白上樣，采用10%的SDS-PAGE膠、PVDF膜，β-catenin兔抗人一抗工作液(1∶100)4 ℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔二抗工作液(1∶100)37 ℃孵育1 h，ECL顯色，用Bio-Rad分析系統(tǒng)掃描分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

1.4 穩(wěn)定細胞株的篩選 ①取對數(shù)生長期DOAY細胞接種于6孔板，加入不同濃度(1、2、3、4和5 μg·mL-1)的嘌呤霉素，選擇在10～14 d內讓全部細胞死亡的最低濃度為最佳篩選濃度。②用1.3篩選實驗中對β-catenin抑制效果最佳的LV-shRNA感染DOAY細胞，之后將細胞接種于6孔板，孵育24 h后加入嘌呤霉素，使之達到①中最佳篩選濃度。每隔2 d更換新的含嘌呤霉素(最佳篩選濃度)的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。收集抗性細胞，獲得穩(wěn)定抑制β-catenin表達的DOAY細胞株。以相同方法用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染LV-NC的DOAY細胞株。

1.5 干擾β-catenin對細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響 分3組，LV-shRNA 組：1.4中篩選得到的穩(wěn)定抑制β-catenin表達的DOAY細胞株；LV-NC組：1.4中篩選得到的穩(wěn)定感染Lentivirus-NC的DOAY細胞株；Blank組：未感染病毒的DOAY細胞株。

1.5.1 MTT檢測細胞增殖能力 將細胞接種于96孔板，于接種后24、48、72、96、120 h每孔加20 μL 的MTT溶液(5 mg·μL-1)。繼續(xù)孵育4 h后，去掉原培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振搖15 min，酶標儀測定各組OD(570)值并繪制曲線。

1.5.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板，孵育48 h后收集，按Annexin V/PI雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。

1.5.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 使用無血清的RM1640培養(yǎng)液將細胞接種于自帶基質膠的Transwell小室上室，下室加入RM1640+10%FBS。孵育48 h后，擦去靠近基底膜內室的細胞，另一面細胞經(jīng)10%甲醇固定，PBS洗滌，結晶紫染色，PBS洗滌，顯微鏡下觀察細胞并記數(shù)。

1.5.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 細胞接種于6孔板，生長至90%融合時，于6孔板底部沿直線劃痕，并更換為無血清的RM1640培養(yǎng)液。孵育48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，Gimesa染色，觀察細胞遷移情況。細胞相對遷移能力=0 h劃痕距離-48 h劃痕距離。

2 結果

2.1 慢病毒感染和穩(wěn)定細胞株篩選 圖1顯示，感染72 h后，Blank組細胞未見GFP表達，LV-shRNA 1、 2、3和NC 組細胞感染效率分別為(91.2±3.1)%、(93.2±2.9)%、(90.6±3.2)%和(89.9±2.1)%，經(jīng)方差分析各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2A中RT-PCR檢測顯示，各LV-shRNA組β-catenin mRNA表達均低于LV-NC組(0.95±0.21)和Blank組(0.89±0.23)，LV-shRNA 1組(0.24±0.09)低于LV-shRNA 2組(0.47±0.15)和LV-shRNA 3 組(0.53±0.13)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；圖2B Western Blot顯示，各LV-shRNA組β-catenin蛋白表達均低于LV-NC組(0.89±0.19)和Blank組(0.81±0.20)，LV-shRNA 1組(0.15±0.07)低于LV-shRNA 2組(0.38±0.14)和LV-shRNA 3組(0.41±0.14)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組DOAY細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達情況

圖2各組DOAY細胞中β-catenin的mRNA(A)和蛋白(B)表達情況，LV-shRNA1對DOAY細胞增殖的影響(C)

注 M：Marker，1、2、3、NC和B分別為LV-shRNA 1、2、3、NC組和Blank組

綜合病毒感染效率和LV-shRNA干擾效率，LV-shRNA 1對β-catenin抑制效果最好，以4 μg·mL-1嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達LV-shRNA 1的DOAY細胞株。

2.2 LV-shRNA 1對DOAY細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響 ①增殖：MTT細胞生長曲線(圖2C)顯示，LV-shRNA 1組第12、24、36、48、72 h時OD(570)值低于LV-NC組和Blank組(P<0.05)。②凋亡：雙變量流式細胞儀散點圖(圖3)顯示，LV-shRNA 1組細胞總凋亡率[(31.3±4.2)%]高于LV-NC組[(13.3±3.3)%]和Blank組[(17.4±3.1)%]，P<0.05。③侵襲：Transwell實驗(圖4)顯示，LV-shRNA 1組穿膜細胞數(shù)目(23.4±8.3)少于LV-NC組(69.8±14.7)和Blank組(74.2±16.7)，P<0.05。④遷移：細胞劃痕實驗(圖5)顯示，LV-shRNA 1組細胞遷移距離[(314.6±47.1)μm]小于LV-NC組 [(689.4±73.6)μm]和Blank組[(701.5±79.0)μm]，P<0.05。

圖3AnnexinV/PI雙染色流式細胞術檢測DOAY細胞凋亡情況

注 Q1：中晚期凋亡細胞；Q2：壞死細胞；Q3：存活細胞；Q4：早期凋亡細胞

圖4 Transwell實驗檢測DOAY細胞的侵襲能力(×100)

圖5細胞劃痕實驗檢測DOAY細胞的遷移能力

3 討論

研究顯示，Wnt信號轉導通路在調控細胞增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用，且與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關[8]。此外，還參與神經(jīng)細胞的發(fā)育、分化和成熟，對原始神經(jīng)干細胞的分化和成熟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關重要[9]。β-catenin是Wnt信號轉導通路中的關鍵效應因子，β-catenin的異常激活可使神經(jīng)干細胞向腫瘤干細胞分化，從而參與MB的發(fā)生和發(fā)展[10]。當Wnt信號轉導通路失活時，胞漿中的β-catenin主要與細胞膜上的E-鈣黏蛋白結合，部分與胞漿中的 APC蛋白、Axin蛋白、糖原合成酶激酶-3 (GSK-3β)和酪蛋白激酶-1(CK-1)相互作用，形成β-catenin降解復合體。磷酸化的β-catenin降解復合體泛素化，經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)降解，從而使細胞內β-catenin含量維持在正常水平[11，12]。當Wnt信號轉導通路激活時，

β-catenin降解復合體解散，磷酸化與泛素化過程受阻，胞質內β-catenin不斷蓄積，并通過核孔轉運進細胞核，作為轉錄啟動子與T細胞因子/淋巴增強子(TCF/LEFs) 等轉錄因子家族結合，從而激活細胞周期蛋白-1(Cyclin D-1)和C-myc等癌基因的轉錄和表達，導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11,12]。馬俊艷等[13]證實，β-catenin在人腦干神經(jīng)膠質瘤中的表達隨腫瘤分級的增加而增加，推測其可能與腦干神經(jīng)膠質瘤的惡性程度有關。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)， β-catenin 在MB組織中的陽性表達率高于正常組織(66.7%vs10.0%，P<0.05)，推測其可能參與MB的發(fā)生和發(fā)展。因而，深入探索β-catenin與MB的關系，從分子生物學水平尋求特異性治療靶點，將為MB的防治提供新的思路。

RNA干擾技術(RNAi)是近年來廣泛用于調控生物基因表達與功能的技術，通過體外轉錄或體內表達的小干擾RNA(siRNA)誘導序列特異的目的基因沉默，該技術目前已成為研究基因功能和實現(xiàn)基因治療的熱點。如何將siRNA完整地送入靶細胞是目前制約RNAi技術廣泛應用的關鍵。目前常用的載體主要有質粒和病毒，不同的表達載體在合成過程、轉染效率和轉染效果方面各有優(yōu)缺點。質粒載體的制備較簡單，但是導入效率低，且無法長期穩(wěn)定表達。病毒載體主要有腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒等，其中慢病毒載體既能轉染分裂期細胞又能轉染非分裂期細胞，能夠將siRNA整合至靶細胞中實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達，而且轉導效率高、免疫反應小[15]。在本次實驗中我們構建了小發(fā)卡RNA(shRNA)，以克服siRNA半衰期短和無法持久表達等缺點，進一步加工成shRNA的慢病毒載體，從而將shRNA高效導入細胞并穩(wěn)定表達。在shRNA慢病毒載體加工的過程中，對于靶基因位點的選擇十分關鍵，因此對shRNA編碼序列的選擇尤為重要。應盡量避免5'和3'非編碼區(qū)和起始密碼子區(qū)等調節(jié)蛋白結合位點區(qū)域，在本研究中我們選擇了編碼區(qū)起始密碼子下游433、769、1 181和2 348共4個位點作為干擾靶點，有效避免了某一位點不能干擾β-catenin表達的情況，同時還設置了陰性對照序列，從而排除了轉染序列本身對β-catenin表達的影響。

本研究結果發(fā)現(xiàn)， LV-shRNA 1對β-catenin抑制效果最好，通過嘌呤霉素篩選，獲得了穩(wěn)定抑制β-catenin表達的DOAY細胞株。細胞接觸生長抑制性喪失是惡性腫瘤的重要特點，本研究觀察了抑制β-catenin表達對細胞增殖和凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)，LV-shRNA 1組第12、24、36、48、72 h時的OD值減小，細胞總凋亡率升高，說明抑制β-catenin表達能夠顯著抑制DOAY細胞增殖并促進其凋亡。MB腫瘤細胞有沿腦脊液產(chǎn)生播散性種植的傾向，本研究進一步觀察了抑制β-catenin表達對DOAY細胞侵襲和遷移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)，LV-shRNA 1組穿膜細胞數(shù)目減少，細胞遷移距離縮短，說明抑制β-catenin表達減弱了腫瘤細胞的侵襲、遷移能力。其原因可能為：抑制β-catenin表達，一方面阻礙Wnt信號轉導通路下游Cyclin D1和C-myc等癌基因的表達；另一方面增加了腫瘤細胞間的黏附作用，使癌細胞浸潤性和分散性生長受阻。

綜上所述，穩(wěn)定抑制β-catenin表達可抑制DOAY細胞的增殖，降低其侵襲和遷移能力，促進其凋亡，β-catenin有潛力成為治療MB的新靶點。

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