高永勝， 閆少春， 賈小娥△， 邵 國(guó)△

(1包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心， 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院， 神經(jīng)科學(xué)研究所， 內(nèi)蒙古 包頭 014060； 2包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014030； 3內(nèi)蒙古低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 包頭 014060； 4低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院， 北京 100053)

腎臟腫瘤的發(fā)病率在人類泌尿系統(tǒng)腫瘤中排名第3，約占惡性腫瘤的3%，發(fā)病年齡主要在50～70歲，每年導(dǎo)致90 000多例患者死亡，且呈遞增趨勢(shì)[1]。腎癌的具體發(fā)病機(jī)制不詳，除遺傳因素外，吸煙、肥胖、污染和輻射等也是重要因素。大多數(shù)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)患者在早期無(wú)任何癥狀，20%～30%患者在診斷時(shí)已發(fā)展或轉(zhuǎn)移[2]，故預(yù)后較差；患者出現(xiàn)諸如血尿和腰痛等典型癥狀時(shí)，已失去最佳的治療機(jī)會(huì)。目前，ccRCC發(fā)生機(jī)理和機(jī)制尚未完全清楚。近年來(lái)對(duì)ccRCC病因及發(fā)病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，許多表觀遺傳學(xué)的改變，尤其是DNA甲基化(DNA methylation)異常、組蛋白修飾及非編碼RNA調(diào)節(jié)可能是ccRCC發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制，主要涉及DNA、蛋白質(zhì)和RNA等水平調(diào)控基因的表達(dá)。這些都為ccRCC的病因研究及診斷、治療和預(yù)后提供了新的理念與途徑。

1 ccRCC中的異常DNA甲基化

DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA me-thyltransferases， DNMTs)作用下，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體到胞嘧啶的碳5位置形成共價(jià)鍵。大多數(shù)胞嘧啶甲基化發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(cytosine-phosphoric acid-guanine，CpG)二核苷酸序列中，但也有研究稱其可能發(fā)生在含有腺嘧啶和胸腺嘧啶的二核苷酸序列[3]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，需通過(guò)重新合成DNMTs來(lái)完成，磷酸化是DNA從頭甲基化功能的調(diào)控模式[4]。DNA甲基化異常與身體各器官部位癌癥發(fā)生率具有高度一致性。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子由于高甲基化而轉(zhuǎn)錄失活，最終導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。有研究顯示，異常DNA甲基化是ccRCC發(fā)病機(jī)制之一[5]。有15%的ccRCC患者腫瘤抑制基因Von Hippel-Lindau(VHL)啟動(dòng)子由于甲基化而失活[6]。DNA低甲基化是指如衛(wèi)星DNA等DNA重復(fù)序列的甲基化程度降低而使染色體穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致染色體重排，或?qū)е罗D(zhuǎn)錄激活和增加癌基因表達(dá)。非CpG島基因座在基因調(diào)控中也非常重要。此外，較新的高分辨率測(cè)定顯示，基因體甲基化可能在基因調(diào)控中比啟動(dòng)子甲基化更為重要[7]。

2 ccRCC中抑癌基因的DNA甲基化異常

已有大量研究表明，DNA異常甲基化在ccRCC發(fā)生發(fā)展中起到重要調(diào)控作用，其中，RASSF1A、VHL和p16等抑癌基因表達(dá)的下調(diào)或沉默可導(dǎo)致周期蛋白的異常累積，最終導(dǎo)致腎癌發(fā)生。抑癌基因在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用，在ccRCC中，抑癌基因的變化較為常見(jiàn)，而腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一就是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化直接抑制了啟動(dòng)子的活性。

2.1抑癌基因RASSF1A2000年，RASSF1A基因從肺癌細(xì)胞中被克隆，位于人染色體3p21.3上，編碼RASSF1A蛋白，其主要功能是通過(guò)參與Rb家族細(xì)胞周期檢查點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和分化來(lái)抑制腫瘤發(fā)生。研究表明，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，RASSF1A失活涉及啟動(dòng)子區(qū)甲基化和染色體缺失等，RASSF1A的甲基化水平與ccRCC預(yù)后相關(guān)。通過(guò)對(duì)179名接受過(guò)根治性或部分腎切除術(shù)后的日本患者進(jìn)行研究，使用限制性分析和亞硫酸氫鹽測(cè)序來(lái)評(píng)估RASSF1A中5’CpG島的甲基化水平，結(jié)果顯示，相比于1級(jí)和2級(jí)腫瘤，RASSF1A啟動(dòng)子在3級(jí)腫瘤中的甲基化水平更高也更頻繁；與Ⅱ期患者相比，Ⅲ期患者和Ⅳ期患者甲基化水平也更高；與低甲基化患者相比，高甲基化患者預(yù)后顯著較差，故高甲基化水平與不良預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果表明，定量分析RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化水平可能是預(yù)測(cè)ccRCC預(yù)后的有效標(biāo)志物[8]。通過(guò)分析RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平發(fā)現(xiàn)，其高甲基化可引起RASSF1A基因沉默并減少mRNA的表達(dá)，表明RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平可以間接反映RASSF1A的基因表達(dá)水平[9]。RASSF1A基因參與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，并作為腎細(xì)胞癌早期檢測(cè)及預(yù)后的生物標(biāo)志物，其mRNA表達(dá)水平的測(cè)定可作為ccRCC新的預(yù)后因子[10]。

2.2抑癌基因VHLVHL基因是重要的腫瘤抑制基因，其失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件。ccRCC的發(fā)生和3號(hào)染色體短臂3p25上的VHL基因失活密切相關(guān)。VHL綜合征所伴發(fā)的ccRCC(遺傳性RCC)均伴有VHL基因的突變，其原因是因?yàn)?p25-26染色體缺失[11]。83.4%～90%的散發(fā)性ccRCC存在VHL基因的突變，8.3%～15%存在VHL基因啟動(dòng)子甲基化，90%存在3號(hào)染色體短臂(3p)缺失，從而造成該基因雙等位基因失活[12]。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定的ccRCC細(xì)胞與體外壽命小于10代的細(xì)胞株相比，包括SLC34A2、SEPP1、sult1c4和VHL等基因表達(dá)的差異可能由甲基化和去甲基化引起。另外，有研究表明，VHL基因的功能障礙導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)的積累以及ccRCC的血管生成和發(fā)病幾率的增加[13-14]。因此，VHL基因在ccRCC細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

2.3抑癌基因p16p16基因位于人第9號(hào)染色體短臂(9p21)上，全長(zhǎng)8.5 kb，包含3個(gè)外顯子。p16基因編碼的產(chǎn)物為16 kD的蛋白質(zhì)，是周期蛋白依賴性激酶4抑制因子，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂。p16基因已經(jīng)在腎癌、肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)純合子缺失以及無(wú)義、錯(cuò)義及移碼突變，表明該基因以缺失和突變方式廣泛參與腫瘤形成。與正常組織相比，腎腫瘤組織中P16蛋白表達(dá)低或缺失[15]。

研究表明，ccRCC基因組中130個(gè)位點(diǎn)的CpG島處于甲基化狀態(tài)，即在腎特異性增強(qiáng)子區(qū)域， 異常甲基化特別豐富，這些異常甲基化區(qū)域?yàn)锳p2a、AHR、HAIRY、ARNT和HIF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，可引起ccRCC中缺氧信號(hào)通路的失調(diào)[16]。此外，除遺傳因素外，所有類型的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)DNA甲基化改變，包括ccRCC[17-18]。腫瘤發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制尚不明確。研究表明，在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中，表觀遺傳及遺傳變化之間存在因果關(guān)系[19]，可是這些變化又彼此獨(dú)立發(fā)生[20]，故了解腫瘤類型中存在的異常表觀遺傳學(xué)變化具有重要的臨床前景。核小體占有率已被認(rèn)為是基因表達(dá)的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子[19]。目前，一些新方法可幫助識(shí)別DNA甲基化之外的潛在的表觀遺傳學(xué)驅(qū)動(dòng)基因，包括如個(gè)性化醫(yī)學(xué)在內(nèi)的ccRCC治療策略的新的治療靶點(diǎn)[21]，這些都為ccRCC診療及預(yù)后提供了廣闊的前景。

3 組蛋白修飾(histone modification)與ccRCC

研究顯示，DNA甲基化和組蛋白修飾彼此連接，組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)可能與DNMTs共同維持腫瘤抑制基因沉默[22]。

染色質(zhì)由組蛋白、DNA、非組蛋白及少量RNA構(gòu)成，其中組蛋白是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白，其N末端可通過(guò)共價(jià)鍵修飾作用發(fā)生乙?；?、甲基化及磷酸化等翻譯后修飾。乙酰化為最重要的修飾方式，它的完成依賴于HDAC與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶配合。乙?；c去乙?；膭?dòng)態(tài)平衡對(duì)于基因的正常表達(dá)具有積極意義，任何一方失衡均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。通常情況下，乙?；鸹钚赞D(zhuǎn)錄并與更開放的染色質(zhì)構(gòu)象相關(guān)，而甲基化的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)取決于受影響的殘基及甲基化程度。HDACs、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫甲基酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵酶，如細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控及低氧相關(guān)作用等。對(duì)于這些酶，如果逆轉(zhuǎn)其表觀遺傳修飾就會(huì)具有重新激活腫瘤抑制基因或抑制癌基因潛力，因此可以影響ccRCC的發(fā)生發(fā)展[23]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是涉及腫瘤活動(dòng)和入侵的關(guān)鍵過(guò)程，被認(rèn)為在ccRCC以及許多其它癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。HDACs抑制劑可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)的腎近端小管上皮細(xì)胞的EMT過(guò)程[24]，表明HDACs抑制劑在ccRCC進(jìn)展期間具有逆轉(zhuǎn)EMT的潛在作用；另外，HDACs抑制劑在某些ccRCC細(xì)胞類型的異種移植物中還具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[25]，這些都有待于進(jìn)一步探索。

4 微小RNA(microRNA)與ccRCC

MicroRNA是由大約22個(gè)核苷酸序列組成的非編碼RNA。異常microRNA的表達(dá)與ccRCC的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

MicroRNA-17-5p、microRNA-224、microRNA-200家族、microRNA106a/b、microRNA-21、microRNA-221、microRNA-199a和microRNA-214均被認(rèn)為對(duì)ccRCC的發(fā)生起著重要的作用[23]。MicroRNA-21在ccRCC中過(guò)表達(dá)，并有助于ccRCC的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。MicroRNA可從受損或凋亡的細(xì)胞中釋放入血，并且在血漿、血清以及其它體液中含量豐富且穩(wěn)定，因此有望通過(guò)檢測(cè)外周microRNA作為無(wú)創(chuàng)方式檢測(cè)癌癥。近來(lái)研究表明，microRNA-210是早期診斷ccRCC的潛在生物標(biāo)志物[27]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞瘤(renal cell carcinoma，RCC)患者血清中miR-378水平升高，miR-451水平降低，這2個(gè)microRNA聯(lián)合應(yīng)用可使RCC的鑒定具有81 %的敏感性和83 %的特異性[28]。

目前研究者試圖分析microRNA與ccRCC預(yù)后之間的關(guān)系。有研究表明，microRNA-126的上調(diào)與延長(zhǎng)RCC患者的生存率密切相關(guān)[29]。血漿中高水平microRNA-221的患者存活率明顯低于低microRNA-221表達(dá)水平的患者，揭示了microRNA可以作為ccRCC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。在早期ccRCC及轉(zhuǎn)移性ccRCC患者中發(fā)現(xiàn)，microRNA-122在早期ccRCC患者上調(diào)、在轉(zhuǎn)移性ccRCC患者下調(diào)，microRNA-514在早期ccRCC患者和轉(zhuǎn)移性ccRCC患者均下調(diào)，且轉(zhuǎn)移性ccRCC患者下調(diào)更明顯，這些microRNA的改變與ccRCC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[30]。

5 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在ccRCC中的變化

DNMTs催化DNA甲基化的發(fā)生，該家族至少包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b 4個(gè)成員[31]。其中，DNMT1起著維持甲基化的重要作用，DNMT2的功能尚不清楚，DNMT3a和DNMT3b主要參與從頭甲基化。DNMTs基因表達(dá)上調(diào)先于甲基化變化，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中尤為突出。據(jù)報(bào)道，在多種腫瘤細(xì)胞中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b高度表達(dá)，并與包括膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌和子宮癌等不良預(yù)后相關(guān)，主要原因可能是由于DNMT1的維持甲基化作用和DNMT3b的從頭甲基化作用。為了評(píng)估DNMTs在ccRCC中的表達(dá)模式及預(yù)后價(jià)值，Li[32]等共收集RCC患者標(biāo)本組織97例和無(wú)腫瘤組織52例，進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白在ccRCC、乳頭狀RCC和腎嫌色細(xì)胞癌組織中的表達(dá)均高于無(wú)腫瘤組織，且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤病理分期、組織病理學(xué)分級(jí)和血管浸潤(rùn)相關(guān)；Kaplan-Meier生存分析顯示，DNMTs蛋白在ccRCC中的表達(dá)與所有短期存活和無(wú)病存活呈顯著相關(guān)，多變量分析顯示DNMT1的表達(dá)是總體生存的獨(dú)立預(yù)后因子，DNMT3a或DNMT3b的表達(dá)是患者無(wú)病生存的獨(dú)立預(yù)后因素[32]。DNMT3B4表達(dá)增加可能與整體甲基化降低及ccRCC的發(fā)生有密切關(guān)系[33]。DNMTs調(diào)控DNA甲基化，故DNMTs在ccRCC整體甲基化中扮演重要角色，可以作為ccRCC患者預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶標(biāo)。

6 展望

ccRCC的病因及發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，表觀遺傳的改變可調(diào)控ccRCC的形成和進(jìn)展，隨著對(duì)ccRCC特征性基因組的進(jìn)一步研究，特別是抑制HDACs和逆轉(zhuǎn)啟動(dòng)子甲基化的ccRCC腫瘤抑制基因的研究以及表觀遺傳路徑改變的進(jìn)一步研究，使新型微創(chuàng)診斷和預(yù)后手段的出現(xiàn)成為可能，ccRCC的診斷診療會(huì)達(dá)到新的水準(zhǔn)。

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