馬亮亮 王 海 萬(wàn)若鵬 周忠波1,*

( 1 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300 )( 2 新疆兵團(tuán)南疆化工資源利用工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300 )( 3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300 )

車(chē)前屬(Plantago)植物共有190余種，廣布世界溫帶及熱帶地區(qū)，我國(guó)共20個(gè)種，16種在新疆有分布，其中7種為新疆特有種[1]。車(chē)前草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有悠久的藥用歷史，以種子和全草入藥，具有清熱解毒、利水通淋、清肝明目的功效，用于治療暑熱泄瀉，痰多咳嗽，熱毒痛腫、小便不利，水腫等。2010年版的《中國(guó)藥典》[2]規(guī)定藥用車(chē)前草為車(chē)前科車(chē)前屬車(chē)前(P.asiatica)或平車(chē)前(P.depressa)的干燥全草。日本藥局方則規(guī)定車(chē)前的基源植物為車(chē)前，而歐洲市場(chǎng)廣泛使用大車(chē)前(P.major)和長(zhǎng)葉車(chē)前(P.lanceolata)。車(chē)前草中化學(xué)成分種類(lèi)多樣，主要有黃酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜及其甾體類(lèi)等[3]。其中黃酮類(lèi)化合物如黃芩素、6-羥基木犀草素、高黃芩素、木犀草素等具有很好的抗HIV病毒作用[4]，三萜與苯乙醇苷類(lèi)化合物是車(chē)前草抗炎作用的主要活性成分[4]。環(huán)烯醚萜類(lèi)成分中桃葉珊瑚苷對(duì)肝炎B病毒有抑制作用[5]，其苷元具有抑菌活性[4]。熊果酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和抑菌活性[6,7]。此外，關(guān)于車(chē)前草粗提物還有抗抑郁、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、利尿和祛痰止咳等方面的研究報(bào)道[4]。酚類(lèi)化合物是植物次生代謝物的主要類(lèi)型之一，包括類(lèi)黃酮、酚酸和單寧等三類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性[8]。新疆車(chē)前屬植物分布廣泛，但是相關(guān)的研究報(bào)道較少，作為新疆7個(gè)特有種之一的巨車(chē)前，其化學(xué)成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了充分開(kāi)發(fā)新疆車(chē)前屬植物資源，明確車(chē)前屬植物活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本文擬以巨車(chē)前全草為研究對(duì)象，采用多種色譜手段分離并結(jié)合多種波譜技術(shù)鑒定酚類(lèi)成分，為巨車(chē)前的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用做有益的鋪墊。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所需的藥材于2016年6月采于新疆伊寧，經(jīng)鑒定為車(chē)前屬(Plantago)植物巨車(chē)前(PlantagomaximaJuss.exJacq.)，憑證標(biāo)本(TLM-201601)存放于塔里木大學(xué)生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天然產(chǎn)物研究室。

大孔樹(shù)脂(D101，天津浩聚公司)，柱層析硅膠 (200-300目，青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20 (美國(guó)Pharmacia公司)，MCI gel (75 μm～150 μm，日本Mitsubishi公司)，ODS (40 μm～63 μm，日本Fuji公司)，甲醇(色譜純，美國(guó)Sigma公司)，乙腈(色譜純，美國(guó)Sigma公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

核磁共振譜儀(Bruker AV-500，德國(guó)Bruker公司)，Agilent 1100 Series LC/MSD Trap SL 質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，中壓自動(dòng)純化系統(tǒng)(Buscisepacore C 620，瑞士步琦公司)，超聲波清洗器(KQ5200E，博迅實(shí)業(yè)有限公司)，電子天平(CP224C，奧豪斯儀器(上海)有限公司)，電恒溫鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9420 MBE，上海姚氏儀器設(shè)備廠)，高效液相色譜儀(含CBM-20A控制器、SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AD泵、LabSolutions工作站，日本島津公司)，高效制備液相色譜儀(含CBM-20A控制器、SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、LC-20AR泵，日本島津公司)，Agilent HPLC色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent公司)，島津色譜柱(20.0 mm × 25 cm，5 μm，日本島津公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SY2000，上海亞榮有限公司)，循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

2 提取與分離

將巨車(chē)前全草洗凈陰干粉碎，用80%乙醇熱回流(3 × 40 L)提取3次，每次2 h，提取液濃縮得到3. 04 kg浸膏。取浸膏350 g，采用大孔樹(shù)脂柱層析分離，依次用水、30%乙醇、50%乙醇、90%乙醇、100%乙醇洗脫。50%乙醇部位減壓濃縮成浸膏后進(jìn)行硅膠柱層析，依次用CH2Cl2∶MeOH∶H2O(7∶1∶0. 1, V∶V∶V)、CH2Cl2∶MeOH∶H2O(7∶2∶0. 1, V∶V∶V)、MeOH洗脫，得到8個(gè)部分。再經(jīng)過(guò)反復(fù)硅膠柱層析、ODS中壓柱層析、凝膠柱層析，最后經(jīng)pHPLC制備得到8個(gè)化合物：化合物1(5. 1 mg)、化合物2(21. 2 mg)、化合物3(20. 5 mg)、化合物4(10. 4 mg)、化合物5(204. 2 mg)、化合物6(5. 5 mg)、化合物7(5. 4 mg)和化合物8(3. 0 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z177 [M-H]-1,1H NMR (500 MHz，MeOD)δ∶7. 62 (1H, d, J=16. 0 Hz, H-7), 7. 45 (2H, d,J=8. 5 Hz, H-2, 6), 6. 80 (2H, d,J=8. 5 Hz, H-3, 5), 6. 33 (1H, d,J=16. 0 Hz, H-8), 3. 76 (3H, s, -OCH3);13C NMR (125 MHz, MeOD)δ∶127. 1 (C-1), 131. 1 (C-2, 6), 116. 8 (C-3, 4), 161. 4 (C-4), 146. 6 (C-7), 114. 9 (C-8), 169. 8 (C-9), 52. 0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的4-甲氧基桂皮酸數(shù)據(jù)基本一致，故確定化合物1為4-甲氧基桂皮酸．

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z193 [M-H]-1,1H NMR (500 MHz, MeOD)δ∶7. 54 (1H, d,J=16. 0 Hz, H-7), 7. 03 (1H, s, H-2), 6. 93 (1H, d,J=8. 0 Hz, H-6), 6. 77 (1H, d,J=8. 0 Hz, H-5), 6. 25 (1H, d,J=16. 0 Hz, H-8), 3. 75 (3H, s, -OCH3);13C NMR (125 MHz, MeOD)δ∶127. 7 (C-1), 114. 8 (C-2), 146. 8 (C-3), 149. 6 (C-4), 115. 1 (C-5), 122. 9 (C-6), 146. 9 (C-7), 116. 5 (C-8), 169. 8 (C-9), 52. 0 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的咖啡酸甲酯基本一致，故確定化合物2為咖啡酸甲酯。

化合物3，黃色粉末，ESI-MSm/z465 [M-H]-1,1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ∶7. 42 (1H, d,J=9. 0 Hz, H-6′), 7. 41 (1H, s，H-2′), 6. 96 (1H, s, H-8), 6. 89 (1H, d,J=9. 0 Hz, H-5′), 6. 69 (1H, s, H-3), 5. 01 (1H, d,J=7. 0 Hz, H-1′′), 3. 75～3. 21 (6H, m, H-2′′ - H-6′′)；13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ∶164. 4 (C-2), 102. 4 (C-3), 182. 3 (C-4), 146. 6 (C-5), 130. 5 (C-6), 151. 3 (C-7), 94. 0 (C-8), 149. 0 (C-9), 105. 8 (C-10), 121. 4 (C-1′), 113. 4 (C-2′), 145. 9 (C-3′), 150. 2 (C-4′) 116. 0 (C-5′), 119. 0 (C-6′), 101. 0 (C-1′′) , 73. 2 (C-2′′), 77. 3 (C-3′′), 69. 7 (C-4′′), 75. 8 (C-5′′), 60. 7 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的6-羥基木犀草素-7-O-葡萄糖苷基本一致，故確定化合物3為6-羥基木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

化合物4，白色粉末，ESI-MSm/z207 [M-H]-1,1H NMR (500 MHz, MeOD)δ∶7. 61 (1H, d,J=16. 0 Hz, H-1′), 7. 17 (1H, d,J=2. 0 Hz, H-2), 7. 06 (1H, d,J=8. 0, 2. 0 Hz, H-6), 6. 80 (1H, d,J=8. 0 Hz, H-5), 6. 35 (1H, d, J = 16. 0 Hz, H-2′), 3. 89 (3H, s, 3-OCH3), 3. 76 (3H, s, 3′-OCH3);13C NMR (125 MHz, MeOD)δ∶127. 6 (C-1), 111. 7 (C-2), 149. 4 (C-3), 150. 8 (C-4), 116. 5 (C-5), 124. 1 (C-6), 146. 9 (C-1′), 115. 1 (C-2′), 169. 7 (C-3′), 56. 4 (3-OCH3), 52. 0 (3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的阿魏酸甲酯基本一致，故確定化合物4為阿魏酸甲酯。

化合物5，淡黃色無(wú)定形固體，ESI-MSm/z329 [M-H]-1,1H NMR (600 MHz, MeOD)δ∶7. 63 (1H, dd,J=8. 4, 1. 8 Hz, H-6), 7. 61 (1H, d,J=1. 8 Hz, H-2), 7. 20 (1H, d,J=8. 4 Hz, H-5), 5. 03 (1H, d,J=7. 8 Hz, H-1′), 3. 89 (3H, s, 3-OCH3), 3. 88 (1H, dd,J=12. 0, 5. 4 Hz, H-6′), 3. 70 (1H, dd,J=12. 0, 5. 4 Hz, H-6′), 3. 54 (1H, m, H-2′), 3. 49 (1H, m, H-3′), 3. 47 (1H, m, H-5′), 3. 42 (1H, m, H-4′);13C NMR (150 MHz, MeOD)δ∶126. 3 (C-1), 114. 3 (C-2), 150. 2 (C-3), 151. 8 (C-4), 116. 3 (C-5), 124. 7 (C-6), 169. 8 (C-7), 56. 6 (3-OCH3), 101. 9 (C-1′), 74. 7 (C-2′), 77. 8 (C-3′), 71. 2 (C-4′), 78. 2 (C-5′), 62. 4 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的香草酸-4-O-β-D-glucopyranoside基本一致，故確定化合物5為香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6，淡黃色粉末，ESI-MS m/z 197 [M-H]-1,1H NMR (600 MHz, MeOD)δ∶7. 33 (2H, s, H-2, 6), 3. 88 (6H, s, H-8, 9);13C NMR (150 MHz, MeOD)δ∶122. 7 (C-1), 108. 3 (C-2, 6), 148. 8 (C-3, 5), 141. 5 (C-4), 170. 5 (-COOH), 56. 8 (2 × -OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的丁香酸基本一致，故確定化合物6為丁香酸。

化合物7，無(wú)色針狀結(jié)晶，ESI-MSm/z137 [M-H]-1,1H NMR (600 MHz, MeOD)δ∶7. 87 (2H, d,J=8. 4 Hz, H-2, 6), 6.80 (2H, d,J=8. 4 Hz, H-3, 5);13C NMR (150 MHz, MeOD)δ∶123. 7 (C-1), 132. 9 (C-2, 6), 115. 9 (C-3, 5), 163. 1 (C-4), 170. 9 (-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的對(duì)羥基苯甲酸基本一致，故確定化合物7為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物8，淡黃色粉末，ESI-MSm/z463 [M-H]-1,1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ∶7. 95 (2H, d,J=8. 0 Hz, H-2′, 6′), 7. 02 (1H, s, H-8), 6. 93 (2H, d,J=8. 0 Hz, H-3′, 5′), 6. 86 (1H, s, H-3), 5. 11 (1H, d,J=6. 0 Hz, H-1′′), 3. 76 (3H, s, 6-OCH3), 3. 30～3. 73 (6H, m, H-2′′ - H-6′′);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ∶164. 4 (C-2), 102. 7 (C-3), 182. 4 (C-4), 152. 5 (C-5), 132. 5 (C-6), 60. 3 (6-OCH3), 156. 5 (C-7), 94. 4 (C-8), 152. 2 (C-9), 105. 7 (C-10), 121. 0 (C-1′), 128. 6 (C-2′, 6′), 116. 1 (C-3′, 5′), 161. 6 (C-4′), 100. 2 (C-1′′), 73. 2 (C-2′′), 77. 3 (C-3′′), 69. 6 (C-4′′), 76. 8 (C-5′′), 60. 6 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的高車(chē)前苷基本一致，故確定化合物8為高車(chē)前苷。

4 結(jié)論與討論

酚類(lèi)化合物在植物中分布廣泛，是重要的次生代謝產(chǎn)物之一。酚類(lèi)化合物含有較多的羥基，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化作用，在預(yù)防多種慢性疾病上具有一定的功效。本文從巨車(chē)前80%乙醇提取物中分離得到8個(gè)酚類(lèi)化合物，經(jīng)鑒定為4-甲氧基桂皮酸(1)、咖啡酸甲酯(2)、6-羥基木犀草素-7-O-葡萄糖苷(3)、阿魏酸甲酯(4)、香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、丁香酸(6)、對(duì)羥基苯甲酸(7)和高車(chē)前苷(8)，皆為首次從巨車(chē)前中分離得到，其中化合物1、4和5為首次從車(chē)前屬中分離得到。有研究表明，4-甲氧基桂皮酸有較好的利膽作用[17]，兼有收縮在體動(dòng)物膽囊和松馳膽道口括約肌等多種功能?？Х人峒柞ゾ哂休^好的神經(jīng)保護(hù)活性[18]。6-羥基木犀草素-7-O-葡萄糖苷具有較強(qiáng)的脂肪氧合酶抑制活性以及一定的抑制H1N1流感病毒活性[19,20]。阿魏酸甲酯是絲裂原活化磷酸激酶途徑抑制劑，具有一定的抗炎潛力[21]。香草酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有抗耐藥結(jié)核活性[22]。丁香酸則具有一定的抑菌活性[23]。高車(chē)前苷可改善棕櫚酸所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[24]，也具有一定的抑制H1N1流感病毒[20]和保肝活性[25]。綜上所述，巨車(chē)前中分得的酚類(lèi)成分多數(shù)具有一定的藥理活性，可能是巨車(chē)前的活性成分。系統(tǒng)研究巨車(chē)前化學(xué)成分，既可明確其藥效活性物質(zhì)基礎(chǔ)，又能為深入開(kāi)發(fā)利用新疆道地車(chē)前資源做有意義的探索。