何志海，杜春紅

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理 671000；2.云南省地方病防治所，大理 671000）

伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi sensu lato）為萊姆病（Lyme disease）的病原體，在微生物分類中屬原核生物，非光能原核生物界（Scotobacteria）、螺旋體綱（Spirochaetales）、螺旋體目（Spirochaetaleslxt）、螺旋體科（Spirochaetaceae）、疏螺旋體屬（Borrelia）、伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）。該菌貯存宿主為一些哺乳動物和鳥類，經(jīng)硬蜱叮咬吸血時傳染給人體，可侵害人體多系統(tǒng)多臟器而呈現(xiàn)復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，在北半球廣泛分布，已經(jīng)構(gòu)成嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題。

伯氏疏螺旋體為稀疏而不規(guī)則的左旋螺旋體，常用BSK Ⅱ培養(yǎng)基培養(yǎng)，吉姆薩染色和萊特染色效果好，其分裂繁殖一代需要12～18 h。迄今全球發(fā)現(xiàn)21種不同的伯氏疏螺旋體基因型[1,2]。不同的伯氏疏螺旋體基因型引起的臨床表征各異，對抗原的免疫原性和疫苗的預(yù)防效果有重大影響。分析不同的伯氏疏螺旋體基因型有利于研究伯氏疏螺旋體的地理環(huán)境分布、媒介種類和遺傳多樣性等，并有助于了解萊姆病的發(fā)展趨勢和預(yù)防治療。

血清學(xué)分型和分子生物學(xué)分型是目前伯氏疏螺旋體主要分型方法。伯氏疏螺旋體表面蛋白A和表面蛋白C的異質(zhì)性為血清學(xué)分型提供了依據(jù)。分子生物學(xué)分型方法主要有基因分型和其他分子學(xué)分型方法。常用的基因分型方法有核糖體限制性酶切分型、基因間隔區(qū)酶切分型、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）、特異基因PCR、多位點序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA）、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple-locus variable number tandem repeat analysis，MLVA）等[3]。其他分子學(xué)分型方法主要有表面等離子體共振技術(shù)（surface plasomon resonance，SPR）、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（a loopmediated isothermal amplification，LAMP ）和脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）等。

1 血清學(xué)分型

血清學(xué)分型方法主要依據(jù)伯氏疏螺旋體表面蛋白A和表面蛋白C的多態(tài)性而設(shè)立[4,5]。OspA和OspC在臨床上常作為檢測抗原，通過ELISA方法和免疫印跡法可檢測特異的IgM和IgG抗體，但特異的抗螺旋體抗體一般在疾病二期和三期才出現(xiàn)，不利于疾病早期診斷。OspA是位于伯氏疏螺旋體外膜的一類脂蛋白，已有11種OspA血清型被發(fā)現(xiàn)，OspA疫苗在臨床1期和2期試驗顯示其具有良好耐受性和安全性，能引起大多致病基因型的抗體反應(yīng)[6]。Wilske等[5]對36株從腦脊液分離的菌株進行血清學(xué)分型，發(fā)現(xiàn)8個OspA血清型，并發(fā)現(xiàn)成人和兒童中OspA血清型分布不同。另外OspA血清6型常見于感染B.garinii的蜱，在人感染者中少見，OspA血清2型是引起萊姆病皮膚損傷的主要血清型。有研究表明OspA在媒介蜱體內(nèi)表達較高，而在動物宿主體內(nèi)表達較少，提示OspA血清學(xué)分型不適合用于臨床診斷，而適合于調(diào)查媒介蜱攜帶的病原體。OspC是伯氏疏螺旋體的主要抗原之一。OspA僅將B.afzelii分出一種血清型，而OspC可以將B.aferlii分為4個血清型，可見OspC分型能力比OspA更強。2016年Norek[7]把18株菌株分為3種基因型，其中OspC血清型的G2，G4和G5屬于B.garinii，OspC血清型的A3和A8屬于B.afzelii。血清學(xué)分型有助于萊姆病疫苗的研發(fā)、相關(guān)臨床癥狀的診斷和螺旋體媒介宿主的分析。但血清學(xué)分型的種間區(qū)分能力較差，需要耗費大量時間去培養(yǎng)、觀察病原體，不利于開展大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。OspA和OspC基因多樣性受媒介和宿主免疫反應(yīng)影響[8]，另外蛋白質(zhì)表達的缺失、反常和菌株傳代的突變等原因?qū)е略摲椒y以應(yīng)用于實際[9]。由于新的伯氏疏螺旋體基因型被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)分型方法已難以滿足目前伯氏疏螺旋體分型的需求。

2 單基因位點分型

2.1 基因型特異性PCR 設(shè)計針對某個靶序列的特異引物，PCR后如果出現(xiàn)特異性擴增帶, 則可利用基因序列測序技術(shù)進一步確定其基因型。該方法具有特異度高、方便快捷的優(yōu)點，主要包括5S～23S rRNA基因間隔區(qū)特異性PCR、16S rRNA基因型特異性PCR、Fla基因型特異性PCR等。

2.1.1 5S～23S rRNA基因間隔區(qū)特異性PCR 該方法是目前國內(nèi)外公認的常用的伯氏疏螺旋體單基因位點分型技術(shù)，常用于菌株的初篩和臨床診斷。Vanbik等[10]應(yīng)用該方法對48株菌株進行初篩，首次發(fā)現(xiàn)B.afzelii基因型存在于韓國的二棘血蜱；Wang等[11]采用5S～23S rRNA基因間隔區(qū)特異性PCR發(fā)現(xiàn)中國新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱、刻點血蜱、邊緣革蜱、圖蘭扇頭蜱中存在B.Burgdorferi sensu stricto，而B.b.s.s能夠?qū)е氯R姆病關(guān)節(jié)炎。說明該方法有助于診斷疾病、研究螺旋體從蜱傳染到動物和人的過程、螺旋體在媒介生物的分布和適應(yīng)性。5S～23S rRNA基因間隔區(qū)位于伯氏疏螺旋體基因組唯一的1個rRNA基因操縱子，該操縱子由雙拷貝的23S及5S和單拷貝的16S基因組成，具有高保守性，使得該方法具有高特異度，高靈敏度。但是由于5S～23S rRNA基因間隔區(qū)序列長度較短且具有高變異區(qū)域，使得其不適合系統(tǒng)發(fā)育樹的分析研究[10]。

2.1.2 16S rRNA 基因型特異性PCR 16S rRNA 基因型特異性PCR技術(shù)已被多篇文獻報道用于鑒定伯氏疏螺旋體[12,13]。Lee[14]報道了運用PCR對16S rRNA基因進行擴增，對擴增產(chǎn)物進行DNA序列分析，發(fā)現(xiàn)了一種新基因型。Fu等[15]采用熒光實時定量PCR對16S rRNA 基因進行分析，發(fā)現(xiàn)該方法能特異性地區(qū)分出Borrelia burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii，并且與泰勒蟲、巴貝斯蟲、無形體、絲狀支原體亞種和鸚鵡熱衣原體無交叉反應(yīng)。Borrelia burgdorferi sensu stricto、B.garinii和B.afzelii均可導(dǎo)致人類萊姆病[16]，其中B.b.s.s主要導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎，B.garinii主要導(dǎo)致神經(jīng)萊姆病，B.afzelii主要導(dǎo)致慢性皮炎。因此16S rRNA 基因型特異性PCR不僅可以探索新的螺旋體基因型，還可早期對臨床表現(xiàn)作出診斷。

2.1.3 FlaB基因特異性PCR 伯氏疏螺旋體的Fla基因是高度保守的，有研究表明FlaB基因比起OspA 基因、5S～23S rRNA基因、P66基因有更高敏感性[17]。Norek等[7]基于FlaB基因?qū).garinii，B.afzelii和B.valaisiana進行分型鑒定，與RFLP鑒定結(jié)果一致?；貧w熱螺旋體表達的FlaB與伯氏疏螺旋體表達FlaB存在差異，使得FlaB基因進行系統(tǒng)進化樹分析時，可有效地把伯氏疏螺旋體與回歸熱螺旋體區(qū)分開來，從而有助于疾病的鑒別診斷、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和流行病學(xué)調(diào)查。

2.1.4 OspA 基因型特異性PCR OspA基因位于伯氏疏螺旋體的線狀質(zhì)粒，是引起萊姆病關(guān)節(jié)炎的重要因素，另外OspA是螺旋體在硬蜱腸道中定植的重要因素。Potkonjak等[18]基于OspA 基因建立了巢式PCR對4種基因型分型，其中B.afzelii、B.valaisiana和B.garinii為致病基因型。Wang等[11]采用OspA 基因型特異性PCR發(fā)現(xiàn)中國新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱、刻點血蜱、邊緣革蜱、圖蘭扇頭蜱中存在B. burgdorferi reference B31 strain。由于OspA常作為檢測抗原，所以該方法優(yōu)點是有助于研發(fā)疫苗和早期診斷臨床癥狀。

2.1.5 OspC 基因型特異性PCR OspC基因位于伯氏疏螺旋體的環(huán)狀質(zhì)粒，由于OspC是螺旋體具有侵襲性的重要因素，所以O(shè)spC 基因型特異性PCR 有助于判斷疾病是否會進一步惡化。蔡婧[19]基于 OspC基因建立實時熒光定量 PCR 方法對3種基因型菌株分型。由于OspC常作為檢測抗原，所以該方法的優(yōu)點是有助于研發(fā)疫苗、操作簡便，不必電泳檢測，靈敏度和特異度高。缺點是無法判斷病人的臨床分期。

2.2 基因間隔區(qū)酶切分型 先采用PCR技術(shù)將特定DNA片段擴增出來，再對擴增片段進行酶切, 酶切后的DNA片段用瓊脂糖凝膠電泳分析，直接比較電泳條帶進行分型，目前較少應(yīng)用。用于這種分型的特定DNA片段包括16S～23S rRNA基因間隔區(qū)、5S～23S rRNA基因間隔區(qū)。其中5S～23S rRNA基因間隔區(qū)最為常用。

2.2.1 16S～23S rRNA 基因間隔區(qū) Liveris等[20,21]將93株B.burgdorferi sensu stricto菌株分為3型。16S～23S rRNA 基因間隔區(qū)的缺點是多樣性不足，目前只能夠?qū)?種基因型進行分型鑒定。

2.2.2 5S～23S rRNA 基因間隔區(qū) Seunghgun等[22]運用PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（RCRRFLP）對5S～23S rRNA基因間隔區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)了一種新基因。5S～23S rRNA基因間隔區(qū)RFLP分析具有快速簡便、成本低的優(yōu)點。缺點是無法鑒定未知帶型的菌株，且其結(jié)果與測序分型結(jié)果的常常不相符[23]。

2.3 核糖體限制性酶切分型 染色體DNA被限制性內(nèi)切酶酶切后進行瓊脂糖電泳后Southern轉(zhuǎn)印，最后用標記的高度保守的rRNA探針進行雜交的技術(shù)，目前較少應(yīng)用。染色體DNA包括16S rRNA 基因、23S rRNA基因，其中16S+23S rRNA基因最為常用。史翠霞等[24]對67株菌株運用16S+23S rRNA基因限制性酶切分析，得到5個基因型。與5S～23S rRNA基因間隔區(qū)RFLP分析對比，帶型IX對應(yīng)5S～23S rRNA基因間隔區(qū)RFLP的Group GS1，帶型V對應(yīng)5S～23S rRNA基因間隔區(qū)RFLP的B.garinii。該方法缺點是只對B.garinii有較好分型能力，并且需要參照標準菌株圖譜。

3 多基因位點分型

3.1 多位點序列分析（multilocus sequence analysis，MLSA） 與單基因位點分型技術(shù)相比，多基因位點分型技術(shù)目前更為常用，其表現(xiàn)出更高的分辨率，更有利于疾病的流行病學(xué)研究以及物種進化分析。有研究表明，多位點分型可以糾正單一位點分型造成的潛在分型和進化關(guān)系分析的錯誤。其中最為常用的是多位點序列分析（MLSA）。MLSA為目前國內(nèi)外最常用的公認的多基因位點分型技術(shù)，對于單基因位點無法確定分型結(jié)果的菌株，常增加基因位點數(shù)目，采用MLSA對菌株進行分型。Richter等[25]建立了7個位點的序列分析方法，從多個位點提供整個基因組信息。該方法可較全面地對伯氏疏螺旋體遺傳多樣性進行分析，其鑒定伯氏疏螺旋體的效力和細菌全基因組DNA-DNA雜交相當。Margos等[26]采用多位點序列分析，選用管家基因（housekeeping genes）clpA、clpX、nifS、pepX、pyrG、recG、rplB和uvrA共8個位點，系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)一種新致病的基因型Borrelia bavariensis sp. nov.。Nataliia等[27]采用多位點序列分析，選用16S rRNA、the 5S～23S（rrf-rrl）intergenic spacer region、the flagellin、ospA和p66共5個位點，發(fā)現(xiàn)一種新基因型Borrelia carolinensis sp. nov.，該基因型宿主為棉鼠和林鼠。Ivanova等[28]采用多位點序列分析，選用16SrRNA、23SrRNA、5S～23SrRNA spacer、FlaB、Osp共5個位點，通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)一種新基因型Borrelia chilensis，該基因型出現(xiàn)在南半球的智利，媒介生物是斯氏硬蜱，宿主是普度鹿和長尾小稻鼠，但其致病性尚未清楚[29]。MLSA綜合了多個基因位點的優(yōu)點，分型效果明顯，能發(fā)現(xiàn)未知的菌株，并且結(jié)果更有說服力。MLSA缺點是實驗步驟較單基因位點分型技術(shù)繁瑣，耗時較長，不能區(qū)別不同基因型的混合感染[30]。另外選取的基因需要高保守性，否則分型結(jié)果將不準確[8]。

3.2 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiplelocus variable number tandem repeat analysis，MLVA） 多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)是一種利用每個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat, VNTR）位點在不同菌株中拷貝數(shù)的差異形成VNTR分辨率，通過VNTR分辨率的可疊加性對菌株分析的基因分型方法。Farlow等[31]于2002年首次將MLVA技術(shù)應(yīng)用于伯氏疏螺旋體鑒定。2013年周鑫等[32]運用MLVA方法將31株萊姆病螺旋體分為4簇，分型結(jié)果與多位點序列分析（MLSA）相比，MLSA有3個步長值小于50%，對于部分有爭議的菌株，MLVA與MLSA聯(lián)用可有效對伯氏疏螺旋體進行分型。

3.3 單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP） SSCP是一種能迅速鑒定短片段中單個堿基變異的技術(shù)。SSCP結(jié)合PCR可以發(fā)現(xiàn)不同伯氏疏螺旋體基因型之間單個堿基的變異[33]。另外PCR-SSCP可以容易辨別伯氏疏螺旋的混合感染[34]。Krakowetz等[35]運用SSCP聯(lián)合16S rRNA基因測序，檢測出19個單體型，其中8個尚未在美國被報道。SSCP通過產(chǎn)生特殊帶型來體現(xiàn)單個堿基的變異。在缺乏類似于GenBank數(shù)據(jù)庫的情況下，SSCP復(fù)雜的帶型導(dǎo)致其難以對未知基因型進行分析。

4 其他分子生物學(xué)分型方法

4.1 全基因組測序分析 全基因組測序技術(shù)是目前最為有效的分型技術(shù)，常作為最后的參考標準。蔣寶貴等[36]對B.afzelii HLJ01和B.garinii NMJW1進行了全基因組測序，吳瓊[37]對B.garinii SZ進行了全基因組測序，研究發(fā)現(xiàn)B.garinii SZ基因型有致病性，與B.garinii JW1基因型相比病變表現(xiàn)不一致，與B.burgdorferi B31相比有不同的組織嗜性[38]。Kingry等[1]運用全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)一種新基因型Borrelia mayonii，研究表明該基因型為致病基因型，感染該基因型的病人有更高水平的螺旋體菌血癥，所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)和其他基因型不同[39]，從若蜱進入宿主所需時間和B.burgdorferi類似[40]，媒介生物是黑腿蜱，宿主是白足鼠和美國紅松鼠[41]。全基因組測序作為最有力的分型技術(shù)，其優(yōu)點是能夠提供伯氏疏螺旋體基因組信息，研究種內(nèi)種間差異及進化規(guī)律，闡述伯氏疏螺旋體在分類學(xué)上的關(guān)系，有利于發(fā)現(xiàn)新的表面蛋白和研制新型疫苗，從而有利于萊姆病的預(yù)防、診斷和治療。但其缺點在于需要從媒介或人類標本中分離和培養(yǎng)螺旋體菌株，該過程需要耗費大量時間，不利于臨床早期診斷和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

4.2 多位點酶電泳法（multilocus enzyme electrophoresis，MLEE） 多位點酶電泳法（MLEE）是一種根據(jù)酶電泳型差異，將菌株代謝酶進行電泳的分型技術(shù)。Balmelli等[42]運用MELL方法將54株菌株分為5個基因型，分別為B.burgdorferi sensu stricto，B.garinii， B.afzelii，B.japonica和Borrelia andersoni。該方法缺點是需要培養(yǎng)大量菌株以獲得充足的溶菌產(chǎn)物供分析使用，耗時較長。

4.3 實時熒光qPCR Tm溫度分型 Ferdin等[43]基于hbb基因?qū)T-PCR結(jié)合Tm解鏈溫度分型方法運用于伯氏疏螺旋體的分型，發(fā)現(xiàn)該方法可以對大多數(shù)基因型進行分型，并分別將B.garinii和B.lusitaniae分成2個基因簇，但是無法區(qū)分B.spielmanii和B.valaisiana。與MluI-LRFP、MseI-LRFP進行比較，其優(yōu)點是易于操作，快速簡便，能在數(shù)小時內(nèi)得到結(jié)果。仝彩玲[44]通過熒光定量PCR熔解曲線上的Tm解鏈溫度較好地反應(yīng)出recA基因在伯氏疏螺旋體進化過程中GC含量的改變，據(jù)此對B.garinii和B.afzelii進行分型。PCR實時熒光定量Tm溫度分型優(yōu)點是快速簡便，可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測分型。

4.4 表面等離子體共振技術(shù)（surface plasomon resonance，SPR） SPR利用金屬膜和液面界面光的全反射引起的物理光學(xué)現(xiàn)象來分析分子相互作用，利用SPR傳感系統(tǒng)可以得到生物分子相互作用的信號。于東冬[45]運用該方法對2種基因型菌株分型。SPR 技術(shù)優(yōu)點是能夠?qū)崟r監(jiān)測反應(yīng)過程、不必純化和標記樣品。

4.5 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（a loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP）的原理是DNA恒溫擴增。楊吉飛[46]基于伯氏疏螺旋體OspA基因，運用LAMP對3種伯氏疏螺旋體基因型進行鑒定。該方法優(yōu)點是簡單方便，特異度較高，缺點是溫度不好掌握、靈敏度較低。

4.6 脈沖場凝膠電泳分型（pulse-field gel electrophoresis，PFGE） PFGE 技術(shù)原理是將菌體完全包埋在瓊脂糖中，然后加入十二烷基肌氨酸鈉、蛋白酶K等化學(xué)試劑，將菌體的蛋白質(zhì)成分完全溶解消化，用限制性內(nèi)切酶對DNA進行酶切，對酶切產(chǎn)物進行電泳從而對菌株進行分型。耿震等[47]運用PFGE方法對B.burgdorferi s.s.，B.garinii，B.afzelii，B.valaisiana和B.andersonii進行分型，證明PFGE與MLSA和PCR-RFLP有高度一致性。PFGE優(yōu)點是具有重復(fù)性和高分辨能力，能較全面反映伯氏疏螺旋體基因組信息。缺點是需要培養(yǎng)大量菌株以獲得充足的溶菌產(chǎn)物供分析使用，處理樣本通量低，需要時間長，不利于大規(guī)模菌株鑒定分型和流行病學(xué)調(diào)查。

4.7 多基因位點-電噴霧電離質(zhì)譜分型 Crowder等[30]運用PCR對gryB、rpoC、rplB、leuS、flab、ospC和hbb共7個位點進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）鑒定后分為5個基因型，分別為B.afzelii，B.garinii，B.lusitaniae，B.spielmanii和B.valaisiana，證明該方法比OspC分型技術(shù)分辨程度更好。多位點基因分型結(jié)合電噴霧電離質(zhì)譜分型的方法比起傳統(tǒng)的多位點基因分型方法，優(yōu)點是可以鑒定單個蜱是否混合感染。

4.8 反向線狀印跡雜交技術(shù)（reverse line blot，RLB） 反向線狀印跡雜交技術(shù)的原理是PCR產(chǎn)物與固定在Biodyne C薄膜上的特異性探針進行雜交，通過分析所擴序列的差異片段進行鑒定，多個樣品通過線性路徑對應(yīng)多個探針，從而實現(xiàn)同時檢測多種病原。Tappe等[48]運用反向線狀印跡雜交技術(shù)和雙脫氧測序技術(shù)對7個基因型進行鑒定，分別是B.afzelii，B.garinii，B.burgdorferi s.s.，B.bissettii，B.lusitaniae，B.spielmanii和B.valaisiana，RLB缺點是無法鑒別B.garinii和B.bavariensis，需要雙脫氧測序技術(shù)進一步鑒定。

5 小結(jié)

目前伯氏疏螺旋體分型方法較多，優(yōu)缺點各異，常需聯(lián)合數(shù)種方法對菌株進行分型。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于PCR的各種基因分型技術(shù)由于較高的靈敏度和特異度，簡便快捷的優(yōu)點得到廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外公認可用的方法是單基因位點技術(shù)、多位點基因分型方法和全基因組測序技術(shù)。單基因位點技術(shù)一般用于菌株初篩，多位點基因分型方法一般與系統(tǒng)發(fā)育樹聯(lián)用對菌株進行分型[49,50]。全基因組測序是分型能力最強的分型技術(shù)，但其缺點是需要耗費大量時間分離和培養(yǎng)菌株，一般在證據(jù)充分的情況下采用以最終證明結(jié)論。血清學(xué)分型方法主要用于疫苗研制，較少用于發(fā)現(xiàn)新菌株?；蜷g隔區(qū)酶切分型和核糖體基因酶切分型目前已較少采用，其他分子生物學(xué)技術(shù)，如多位點酶電泳法、表面等離子體共振技術(shù)、脈沖場凝膠電泳分型等由于各自均有明顯缺點也較少采用。全基因組DNA-DNA雜交被認為是細菌分類的金標準，一般認為當DNA同源性大于70%，ΔTm小于5℃時可以確定兩菌株為同種。但由于全基因組DNA-DNA雜交需要已知物種的參考菌株，不適用于培養(yǎng)困難和生長速度緩慢的細菌，另外其結(jié)果的重復(fù)性難以保證，使得全基因組DNA-DNA雜交運用較少?；蚍中图夹g(shù)的缺點是需要選擇特定的基因位點，不同的基因位點對基因分型結(jié)果的準確性有著不同的影響作用，另外單基因和多基因分型技術(shù)只能說明存在新基因型菌株，對新的基因型菌株還需要進行全基因組測序，以了解其表達的蛋白質(zhì)與其他基因型有何異同，從而為疫苗研發(fā)、致病機制等方面作貢獻?；蚍中图夹g(shù)未來應(yīng)盡量尋找和選擇高保守性的高特異性的基因位點，如cp26和lp54，以便在系統(tǒng)發(fā)育樹的幫助下體現(xiàn)不同基因型之間的區(qū)別。另外隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，使得伯氏疏螺旋體在蛋白質(zhì)層面分型成為可能，如通過質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的大小，通過核磁共振技術(shù)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等，從而更直觀更全面地認識該病原體，更有利于相關(guān)疫苗的研發(fā)和相關(guān)致病機制的研究。不同的伯氏疏螺旋體基因型具有不同遺傳特性和抗原性[51]，不同的伯氏疏螺旋體基因型與臨床表現(xiàn)、地理分布、傳播媒介、診斷抗原的選擇、萊姆病的流行狀況和萊姆病的預(yù)防治療等有密切關(guān)系。因此在現(xiàn)有分型方法的基礎(chǔ)上，今后仍需要尋找一種快速、高效、便捷的伯氏疏螺旋體分型方法，有效指導(dǎo)伯氏疏螺旋體的預(yù)防控制和診斷治療。