朱 敏，王 琳，許默儒，錢 琨,3,4，邵紅霞,4，葉建強(qiáng),4，秦愛(ài)建,3,4,5

（1.揚(yáng)州大學(xué) 省部共建教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控

協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；5.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

干擾素是一類具有抵抗病毒感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤等多種功能的細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。干擾素包括兩類：Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）和Ⅱ型干擾素（IFN-γ），Ⅰ型干擾素由多種細(xì)胞在病毒感染時(shí)產(chǎn)生，Ⅱ型干擾素由T細(xì)胞和天然殺傷性細(xì)胞產(chǎn)生[2]。

干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulatory factor 7，IRF7）是在I型IFN基因的轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用的IRF家族成員，在誘導(dǎo)和激活抗病毒因子、誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、激活免疫細(xì)胞、炎癥反應(yīng)、凋亡、分化等方面發(fā)揮著重要的作用[3-5]。IRF7的N端是具有保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端包含多個(gè)調(diào)控結(jié)構(gòu)域：信號(hào)反應(yīng)結(jié)構(gòu)域、組成性激活結(jié)構(gòu)域、病毒激活結(jié)構(gòu)域、抑制結(jié)構(gòu)域[6,7]。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，IRF7的表達(dá)水平都非常低[8]。IRF7主要在免疫系統(tǒng)中表達(dá)，如淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，即IRF7是一種特異于淋巴組織的因子[9]。IRF7存在于細(xì)胞漿中，其表達(dá)不是組成型的，IRF7的活性主要通過(guò)蛋白水平調(diào)節(jié)，IFN、LPS或病毒感染處理細(xì)胞后可誘導(dǎo)IRF7的表達(dá)[7]。研究雞IFN信號(hào)通路，離不開(kāi)對(duì)IRF7作用的深入研究，但是由于目前尚無(wú)雞源IRF7抗體，給研究雞IFN信號(hào)通路帶來(lái)巨大瓶頸。

本研究從雞淋巴細(xì)胞中獲得IRF7基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，將原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物作為免疫原免疫小鼠，并用本實(shí)驗(yàn)室保存的真核質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG進(jìn)行鑒定，成功獲得雞IRF7多抗，為進(jìn)一步研究IRF7在誘導(dǎo)IFN信號(hào)通路中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原核表達(dá)載體pCOLDTF、真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-rIgG、pcDNA3.1-chIRF7-rIgG、大腸桿菌BL21（DE3）和DF1細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3.1-rIgG由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該質(zhì)粒是在真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中插入了兔IgG，具體兔IgG序列參考吳曉平[10]論文；BALB/c小鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.1.2 試劑 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自TaKaRa公司；總RNA小量制備試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司；膠回收試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Kpn I、EcoR I購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；轉(zhuǎn)染試劑Trans-IT1購(gòu)于Mirus公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG全分子抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG全分子抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG全分子抗體、HISTOPAQUE-1083均購(gòu)于Sigma公司；RIPA Buffer細(xì)胞裂解液購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒小提試劑盒、抗HIS標(biāo)簽鼠單克隆抗體、ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)于北京康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 雞淋巴細(xì)胞cDNA的獲得 采取2月齡SPF雞抗凝血3 mL，用PBS 1:1稀釋，將其緩慢加入到6 mL HISTOPAQUE-1083淋巴細(xì)胞分離液中，500×g離心20 min，將中間層白色絮狀物淋巴細(xì)胞吸出。根據(jù)AxyPrep總RNA小量制備試劑盒操作說(shuō)明提取雞淋巴細(xì)胞總RNA，并用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得雞淋巴細(xì)胞cDNA。

1.2.2 雞IRF7基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中公布的雞IRF7基因的序列，利用DNAStar設(shè)計(jì)合成引物。上游引物：5'-CGGGGTACCATGGCAGCACTGGA CAGCG-3' （引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-CCGGAATTCGTCTGTCTGCATGTGGTATTG CTC-3'（引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），以雞淋巴細(xì)胞cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的條帶，-20℃儲(chǔ)存。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將pCOLD-TF原核表達(dá)載體和IRF7目的片段經(jīng)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，將載體和目的片段分別進(jìn)行膠回收后按1:3的比例用T4 DNA連接酶連接過(guò)夜，將過(guò)夜后的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21，轉(zhuǎn)化后的BL21涂布含氨芐青霉素的LB平板，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落培養(yǎng)，按質(zhì)粒小提試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送南京華大基因技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pCOLD-TF-chIRF7。

1.2.4 IRF7重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot鑒定 取含pCOLD-TF-chIRF7重組質(zhì)粒和空載體的BL21陽(yáng)性菌1:100分別接種于含氨芐抗性的2YT培養(yǎng)基中，225 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，150 r/min、16℃誘導(dǎo)20 h。收集菌體加入PBS進(jìn)行超聲破碎，5000×g 離心15 min，各取100 ng上清和沉淀蛋白樣品，加ddH2O定容至20 μL，并各加入5 μL的5×SDS Loading Buffer煮沸5 min后冰浴2 min進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，分析目的蛋白的表達(dá)情況。Western blot試驗(yàn)：首先采用5%的濃縮膠和12%的分離膠，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序進(jìn)行SDS-PAGE分析。然后將分離膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上。轉(zhuǎn)印后硝酸纖維膜用5%的脫脂乳37℃封閉3 h，一抗為抗HIS標(biāo)簽鼠單克隆抗體，37℃孵育1 h ，PBST洗3次，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L），37℃孵育1 h，PBST洗4次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色后觀察結(jié)果。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)計(jì)空載體菌對(duì)照。

1.2.5 小鼠免疫 將SDS-PAGE膠中的目的蛋白（大小約107 kDa處）條帶切下并脫色，抽真空隔后加入PBS，腹腔注射5 w齡的雄性BALB/c小鼠，10 d免疫1次，第3次免疫后7 d采集小鼠尾靜脈血清進(jìn)行激光共聚焦和Western blot試驗(yàn)。

1.2.6 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DF1細(xì)胞用胰酶消化，接種于24孔細(xì)胞板中，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞板70%～90%，將質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG、pcDNA3.1-rIgG分別轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照轉(zhuǎn)染試劑Trans-IT1說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.7 激光共聚焦分析 真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞48 h后，用3%的多聚甲醛固定20 min，0.25%Triton X-100室溫作用5 min，2%BSA室溫封閉30 min，然后用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫的鼠血清（1:100）37℃孵育45 min，PBS清洗4次，再用FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1:200）37℃避光孵育40 min，PBS清洗5次，最后經(jīng)DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS清洗1次，設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.8 Western blot分析 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-IgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞48 h，用PBS清洗1次細(xì)胞，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，4℃、500×g離心5 min，用RIPA Buffer重懸細(xì)胞沉淀，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑。置于冰上充分裂解30 min，裂解后1500×g離心10 min，收集上清。取20 μL裂解蛋白上清加入5×SDS Loading Buffer煮沸5 min后冰浴2 min進(jìn)行Western blot分析。一抗為原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫的鼠血清（1:100），37℃孵育1 h ，PBS洗3次，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG（H+L），37℃孵育1 h，PBS洗4次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 雞IRF7的PCR擴(kuò)增結(jié)果 按上述方法，將雞淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，然后PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在1473 bp左右處有特異性條帶（見(jiàn)圖1），大小與預(yù)期相符合。

2.2 成功構(gòu)建chIRF7原核表達(dá)載體 將PCR產(chǎn)物直接克隆至pCOLD-TF，構(gòu)建pCOLD-TF-chIRF7重組質(zhì)粒，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在5770 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，為pCOLD-TF載體。在1473 bp處出現(xiàn)一條特異性目的條帶（見(jiàn)圖2），大小與預(yù)期相符合，測(cè)序結(jié)果證實(shí)原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 IRF7基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of IRF7 gene by PCR

圖2 pCOLD-TF-chIRF7雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Restriction enzyme analysis

2.3 chIRF7融合蛋白的表達(dá)及鑒定結(jié)果 將IPTG誘導(dǎo)的重組菌體超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，與對(duì)照組空載體相比，pCOLD-TF-chIRF7重組表達(dá)菌上清和沉淀中均出現(xiàn)目的條帶，大小約為107 kDa。而對(duì)照組上清和沉淀在107 kDa處均未出現(xiàn)目的條帶，而只在52 kDa處出現(xiàn)特異性空載體His標(biāo)簽蛋白（見(jiàn)圖3）。Western blot結(jié)果顯示，pCOLD-TF-chIRF7原核表達(dá)蛋白均能與抗His標(biāo)簽抗體反應(yīng)，且在107 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，而對(duì)照組上清和沉淀出現(xiàn)52 kDa標(biāo)簽蛋白條帶（見(jiàn)圖4）。pCOLD-TF-chIRF7原核表達(dá)蛋白主要在破碎菌體上清中表達(dá)。

圖3 pCOLD-TF-chIRF7誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Expression of pCOLD-TF-chIRF7 induced by IPT G

圖4 pCOLD-TF-chIRF7 重組蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of pCOLD-TF-chIRF7 recombinant protein by Western blot

2.4 激光共聚焦證明抗chIRF7抗體可以識(shí)別真核細(xì)胞中chIRF7表達(dá)產(chǎn)物 利用真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-chIRF7-rIgG轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，進(jìn)行激光共聚焦實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-rIgG的DF1細(xì)胞，用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的陽(yáng)性鼠抗chIRF7血清（1:100）檢測(cè)DF1細(xì)胞無(wú)綠色熒光。而轉(zhuǎn)染pcDNA-chIRF7-rIgG的DF1細(xì)胞，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（陽(yáng)性對(duì)照）和原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的鼠抗chIRF7血清（1:100）可以識(shí)別DF1細(xì)胞中的chIRF7，出現(xiàn)明顯的綠色熒光，用陰性鼠血清對(duì)照檢測(cè)，結(jié)果細(xì)胞無(wú)綠色熒光（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明用原核表達(dá)的chIRF7產(chǎn)物，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗雞IRF7多克隆抗體。

圖5 多克隆抗體與真核表達(dá)蛋白反應(yīng)的激光共聚焦鑒定Fig.5 Reaction analysis of polyclonal antibody and prokaryotic expressed protein by Confocal Laser

2.5 Western blot鑒定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-chIRF7-rIgG的DF1細(xì)胞裂解產(chǎn)物，用原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物制備的鼠血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-chIRF7-rIgG的細(xì)胞裂解產(chǎn)物在分子量約為79 kDa處呈現(xiàn)特異性條帶（見(jiàn)圖6），大小與預(yù)期相符合，鼠血清與真核表達(dá)的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證明用原核表達(dá)的chIRF7產(chǎn)物，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了抗雞IRF7多克隆抗體。

圖6 真核表達(dá)蛋白與多克隆抗體反應(yīng)的Western blot鑒定Fig.6 Reaction analysis of polyclonal antibody and prokaryotic expressed protein by Western blot

3 討論

IRFs是一類結(jié)構(gòu)特征相對(duì)保守、對(duì)IFN基因表達(dá)起調(diào)控作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與天然免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)控[11]。機(jī)體通過(guò)相關(guān)分子模式識(shí)別受體識(shí)別來(lái)自不同病原體的病原相關(guān)分子模式，將信號(hào)傳遞給下游接頭分子，引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活信號(hào)通路中的IRFs，最終產(chǎn)生細(xì)胞因子、IFN、炎癥因子，誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答[5]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)IRFs成員，IRF7是IRFs家族的重要成員，在病毒感染后誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生過(guò)程中起著重要作用。有報(bào)道稱，用病毒感染敲除IRF7基因的小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN的能力明顯減弱，由此可見(jiàn)，IRF7在病毒感染誘導(dǎo)IFN生成的過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，是宿主抵御病毒感染和機(jī)體免疫防御反應(yīng)中的一個(gè)重要因子[12-14]。IRF7在腫瘤方面也有參與，能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。近年來(lái)對(duì)IRF7在IFN信號(hào)途徑中的作用研究取得了較大進(jìn)展，但有關(guān)雞IRF7對(duì)IFN產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制、胞內(nèi)病毒識(shí)別途徑、如何激活I(lǐng)RF7等方面的研究少有報(bào)道，存在瓶頸的關(guān)鍵問(wèn)題就是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)工具的缺乏。

本研究利用分離雞淋巴細(xì)胞并獲得其cDNA，從中擴(kuò)增IRF7基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pCOLD-TF-chIRF7，將原核表達(dá)蛋白產(chǎn)物免疫小鼠制備雞IRF7多克隆抗體，通過(guò)不同方法分析鑒定，結(jié)果成功獲得抗雞IRF7多克隆抗體，為進(jìn)一步完善IRF7在干擾素通路的具體形態(tài)和了解IRF7的生物學(xué)功能提供了生物材料。