任曉梅，王小蘭，韓文龍，張雪梅,2，陳宗超，李 濤，丁 鏟，于圣青

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036）

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎為主要臨床特征的急性、敗血性、接觸性傳染病，部分慢性感染會(huì)伴隨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和生長(zhǎng)障礙。RA可感染鵝、鴨、火雞、天鵝等[1,2]，在自然狀態(tài)下家鴨最易感。自1904年Riemer首次報(bào)道了此病，隨后世界各國(guó)相繼出現(xiàn)了本病的報(bào)道，我國(guó)自郭玉璞等[3]在北京郊區(qū)鴨場(chǎng)首次分離到血清1型RA，現(xiàn)已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)重大細(xì)菌性傳染病之一。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)RA感染呈現(xiàn)發(fā)病率和死亡率均上升的趨勢(shì)[4,5]。目前，鴨疫里默氏桿菌病的防治大多依靠藥物，而抗生素的濫用導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn)和動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留，因此，疫苗免疫是控制本病發(fā)生與傳播最有效的手段。本研究旨在通過(guò)對(duì)廣東省、山東省和江蘇省地區(qū)疑似患鴨疫里默氏桿菌病的動(dòng)物病料進(jìn)行分離鑒定，測(cè)定其血清型和耐藥情況，為鴨疫里默氏桿菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購(gòu)自BD公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，2×Taq PCR Master Mix 購(gòu)自北京康潤(rùn)科技有限公司；DNA Marker （DL2000）購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；1日齡健康非免疫櫻桃谷鴨和麻鴨，購(gòu)自無(wú)錫某種鴨場(chǎng)，自由采食，籠養(yǎng)至18日齡用于細(xì)菌毒力測(cè)定。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，取經(jīng)臨床觀(guān)察和病理剖檢可疑感染RA病鴨的心臟、肝臟和腦組織，分別接種于含2%胎牛血清胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀(guān)察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況和菌落特征。選取可疑單菌落經(jīng)TSA培養(yǎng)基進(jìn)一步純化后，用TSB進(jìn)行增菌培養(yǎng)。

1.3 生化鑒定 取TSA培養(yǎng)基上純化的單個(gè)菌落分別接種于微量生化發(fā)酵管，具體操作步驟參考生化反應(yīng)管說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，觀(guān)察和記錄結(jié)果。

1.4 PCR鑒定 按照本實(shí)驗(yàn)室建立的RA三重PCR方法，對(duì)臨床分離株進(jìn)行保守基因16S rRNA、ompA和groEL的擴(kuò)增。根據(jù)生化試驗(yàn)和三重PCR鑒定結(jié)果，將RA陽(yáng)性分離株轉(zhuǎn)接于TSA平板培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后冷凍保存。

1.5 血清學(xué)鑒定 將各RA分離株菌液用滅菌PBS稀釋至5×109CFU/mL，取5 μL抗原分別與等體積的血清1型、2型、10型和15型RA單特異性血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，觀(guān)察記錄結(jié)果。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)RA分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.7 動(dòng)物回歸致病性試驗(yàn) 選取鑒定后凍存的12株RA分離株分別接種于TSA平板并傳代培養(yǎng)，取第3代新鮮菌體經(jīng)無(wú)菌PBS洗滌2次后，稀釋菌液至含菌量為2.0×108CFU/mL，腿部肌肉注射18日齡的櫻桃谷鴨或麻鴨，0.5 mL/羽，每組3只，于攻毒后觀(guān)察動(dòng)物發(fā)病、死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定及血清型檢測(cè) 從臨床病料中共分離出46株RA，分離株在普通瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在TSA培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)圓形、微突起、表面光滑的奶油狀小菌落。革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)革蘭陰性短桿菌，多數(shù)呈單個(gè)狀態(tài)，少數(shù)成對(duì)或短鏈排列。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：46株RA分離株均不發(fā)酵乳糖和半乳糖，部分菌株可發(fā)酵葡萄糖（26株）和蔗糖（9株）；甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、硝酸鹽還原和枸櫞酸鹽試驗(yàn)均為陰性；31株分離株可液化明膠，32株分離株可分解尿素；46株RA分離株氧化酶、觸酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性。采用三重PCR方法對(duì)46株RA分離株進(jìn)一步鑒定，所有待檢菌株均可擴(kuò)增出RA 16S rRNA、ompA和groEL基因片段，與預(yù)期大小一致。采用玻片凝集法對(duì)46株RA分離株進(jìn)行血清學(xué)鑒定，其中，血清1型菌株9株，血清2型菌株25株，血清10型和15型菌株各1株，與標(biāo)準(zhǔn)血清1型、2型、10型和15型抗體均不發(fā)生凝集反應(yīng)的分離株10株，暫定為未定血清型菌株，表明血清2型為RA新臨床分離株的優(yōu)勢(shì)血清型（表1）。

表1 RA臨床分離株的分離與鑒定Table 1 Isolation and identification of the RA isolates

2.2 分離株的藥敏試驗(yàn) 結(jié)果顯示，RA臨床分離株呈現(xiàn)廣譜的耐藥性，普遍對(duì)林可霉素、多粘菌素、諾氟沙星耐藥，多數(shù)對(duì)新霉素（89.1%）、紅霉素（89.1%）、鏈霉素（89.1%）和氨芐西林（80.4%）耐藥，僅對(duì)氟苯尼考和頭孢唑肟有較強(qiáng)的敏感性，適合臨床使用。并且，RA分離株的耐藥情況呈現(xiàn)一定的區(qū)域性差異：青霉素類(lèi)，河南省、廣東省、山東省地區(qū)的RA分離株普遍耐藥，而江蘇省地區(qū)的分離株則敏感；大觀(guān)霉素和多西環(huán)素，廣東省和江蘇省地區(qū)的RA分離株普遍敏感。

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) RA分離株以1×108CFU/羽感染18日齡櫻桃谷鴨或麻鴨，感染的櫻桃谷鴨于24 h開(kāi)始出現(xiàn)精神委頓，食欲廢絕，行動(dòng)不便等癥狀；48 h后部分毒株感染鴨出現(xiàn)死亡；第96 h達(dá)到死亡高峰期。剖檢可見(jiàn)胸腔積液，心包增大變厚，出現(xiàn)明顯的纖維素樣滲出，與胸腔內(nèi)膜粘連；肝臟表面包裹著一層淡黃色的纖維素樣薄膜，邊緣鈍圓；脾臟出現(xiàn)大理石樣花紋（圖1A）。RA分離株感染麻鴨后，48 h開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀，72 h出現(xiàn)死亡。剖檢可見(jiàn)典型的纖維素性心包炎和脾腫大呈大理石樣（圖1B）。對(duì)照組櫻桃谷鴨和麻鴨食欲、精神狀態(tài)均正常。各組試驗(yàn)鴨感染RA分離株均不同程度地發(fā)病，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 RA分離株對(duì)抗菌藥物的耐藥情況Table 2 Susceptibility of isolates to antibiotics

圖1 RA分離株感染櫻桃谷鴨（A）和麻鴨（B）病理剖解圖Fig.1 Clinical pathological features of cherry valley ducks(A) and sheldrake (B) infected with RA isolates

3 討論

本研究對(duì)廣東省、山東省、江蘇省地區(qū)的病死鴨分離到的可疑RA菌株進(jìn)行了鑒定、血清型分型以及藥敏試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，共鑒定到46株RA菌株，血清型分布主要集中在1型和2型，同時(shí)也包含其他血清型。本研究分離到的RA菌株能感染櫻桃谷鴨和麻鴨出現(xiàn)典型的臨床癥狀及病理變化，且櫻桃谷鴨感染后病理變化較麻鴨強(qiáng)，與送檢鴨臨床病理特征一致。

表3 RA分離株的動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Determination of the bacterial virulence to ducklings

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，國(guó)際上已報(bào)道了21種血清型[6-8]。而我國(guó)關(guān)于鴨疫里默氏桿菌血清型的報(bào)道：1997年前僅發(fā)現(xiàn)血清1型RA；1997年后，蘇敬良等[9]、張大丙等[10]從北京不同鴨場(chǎng)分離到2、6、10、11、13、14型和其他未知血清型RA菌株。2002年程安春對(duì)分離到的1842株RA進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)1型、2型為優(yōu)勢(shì)血清型，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了3、4、5、8血清型分布；2007年張小峰等[11]對(duì)珠三角地區(qū)分離到的RA進(jìn)行血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，血清1型為優(yōu)勢(shì)血清型。本研究結(jié)果顯示血清2型是山東省、廣東省、江蘇省地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型。由于RA各血清型間不存在交叉保護(hù)，臨床上選用對(duì)應(yīng)血清型的疫苗是本病防控的關(guān)鍵。

目前，鴨疫里默氏桿菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，部分地區(qū)的鴨疫里默氏桿菌多重耐藥現(xiàn)象也越來(lái)越普遍。本研究對(duì)46株RA分離株的藥物敏感性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，分離株對(duì)常見(jiàn)的抗菌素均有不同程度的耐藥。可能的原因是RA中存在天然耐藥基因，2007年蔡秀磊等[12]檢測(cè)了來(lái)自浙江的22株RA發(fā)現(xiàn)全部含有介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的Ⅰ型整合子系統(tǒng)，可介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類(lèi)、氯霉素耐藥基因，隨后Zheng等[13]也報(bào)道了在47株鴨疫里默氏桿菌中46株存在Ⅰ型整合子系統(tǒng)；更為重要的原因是抗生素的濫用，飼料中任意添加，出現(xiàn)疫病隨意加大劑量，使RA對(duì)原本敏感的抗生素逐漸變得耐藥，早期報(bào)道90%以上的鴨疫里默氏桿菌對(duì)紅霉素、青霉素、新霉素等高度敏感[14]，而本研究結(jié)果顯示RA對(duì)以前敏感的抗生素均出現(xiàn)了不同程度的耐藥，抗菌譜逐漸擴(kuò)大。科學(xué)用藥，合理用藥才能避免耐藥的產(chǎn)生，為疫病防控打好基礎(chǔ)。