劉超，景贊，黃志勇

(樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000)

納他霉素作為一種天然、廣譜、高效、安全的食品防腐劑被廣泛用于糕點、肉制品、果蔬汁、發(fā)酵酒等食品[1]，美國食品及藥物管理局于1982年正式批準(zhǔn)納他霉素作為食品添加劑使用[2]，1996年我國專業(yè)人士對納他霉素進(jìn)行評價并建議批準(zhǔn)使用，現(xiàn)已列入食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)。GB 2760-2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定納他霉素在醬油中不得使用。

現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道及國家標(biāo)準(zhǔn)顯示納他霉素的檢測方法主要有分光光度法[3]、液相色譜法[4-8]等。分光光度法靈敏度低、特異性差，很難滿足殘留量的測定，液相色譜法是食品中納他霉素的國標(biāo)方法，但由于食品的復(fù)雜性，該方法往往很難消除基質(zhì)干擾。同時，現(xiàn)有的方法多采用甲醇或乙酸水溶液提取直接分析，雜質(zhì)較多，容易假陽性且易污染儀器。本實驗優(yōu)化了納他霉素的提取方法并建立了靈敏度高、特異性強的液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法檢測醬油中納他霉素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇：色譜純，批號：67-56-1，Dikma提供；乙酸：色譜純，批號：20140421，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；乙酸銨：優(yōu)級純，批號：50166，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司提供；亞鐵氰化鉀：分析純，批號：2015072501；乙酸鋅：分析純，批號：2014111201；無水硫酸鎂：分析純，批號：2014092001，成都市科隆化工試劑廠提供；PSA粒度，批號：S07-1102；C18粉末粒度：40～70 μm，批號：01-00100，WELTECH(WUHAN)CO.,LTD.提供。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

鈉他霉素：批號：C16208400，純度：89.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH提供。

1.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱3.9 mm×150 mm；流動相：(A)：甲醇、(B)：10 mmol/L甲酸銨；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫表

1.4 質(zhì)譜條件

DGU20A-API3200質(zhì)譜儀，質(zhì)譜參數(shù)：ESI負(fù)離子模式。離子源參數(shù)見表2，多反應(yīng)檢測(MRM)見表3。

表2 離子源參數(shù)

表3 多反應(yīng)檢測(MRM)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備(1 mg/mL)

精密稱取10 mg納他霉素到10 mL容量瓶中，用0.2%乙酸-甲醇溶液定容至刻度，避光，-20 ℃儲存。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備(5 μg/mL)

吸取125 μL的儲備液到25 mL容量瓶中，用0.2%乙酸-甲醇溶液定容至刻度。

1.5.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，精密加入0，50，100，200，400，500，1000 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 g)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。配成0，10，20，40，80，100，200 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 樣品制備

1.6.1 提取

精密稱取樣品2 g于25 mL容量瓶中，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。

1.6.2 凈化

稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。

1.7 檢出限與定量限

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。凈化：稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析，作為空白溶液。用空白樣品溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。根據(jù)色譜圖測得信噪比，按S/N=3∶1，計算檢出限和定量限。

1.8 方法的準(zhǔn)確性

低濃度加標(biāo)回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成10 ng/mL的質(zhì)控樣品。

中濃度加標(biāo)回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成20 ng/mL的質(zhì)控樣品。

高濃度加標(biāo)回收溶液：稱取2 g空白樣品于25 mL容量瓶中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后按樣品制備方法操作，配制成40 ng/mL的質(zhì)控樣品。

1.9 精密度和重復(fù)性

稱取3份2 g空白樣品于3個25 mL容量瓶中，每瓶加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液75,150,300 μL，然后按樣品制備方法操作，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣3針，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

取濃度為15,30,60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各3份經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 納他霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，精密加入0,50,100,200,400,500,1000 μL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入0.2%乙酸-甲醇溶液10 mL，依次加入渦旋60 s后，超聲提取5 min(功率：700 W)，冷卻至室溫后，依次加入2 mL 0.22%亞鐵氰化鉀，搖勻，再加入2 mL 0.106%乙酸鋅溶液，搖勻，用甲醇定容至刻度。4000 r/min離心10 min。稱取50 mg(±5 mg)PSA，100 mg(±5 mg)無水硫酸鎂，100 mg(±5 mg)C18粉末置于2 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取2 mL上述上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，10000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，濾液待上機分析。配成0,10,20,40,80,100,200 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并列出標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)方程和線性范圍。

由圖1可知，納他霉素在濃度0～200 ng/mL的濃度范圍內(nèi)R值=0.9999≥0.99，納他霉素在上述線性范圍內(nèi)良好。選取0～200 ng/mL為本實驗的線性范圍。

2.2 專屬性、檢出限和定量限

目標(biāo)化合物出峰處無干擾，一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖應(yīng)清晰可見，見圖2～圖4。

圖2 納他霉素一級質(zhì)譜圖

圖3 納他霉素二級質(zhì)譜圖

圖4 納他霉素對照品色譜圖

采用空白樣品加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測定，精密稱取空白樣品2 g于25 mL容量瓶中，按上述方法進(jìn)行前處理，得空白樣品溶液，用空白樣品溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋至產(chǎn)生3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)。納他霉素的方法的檢出限為5.14 μg/kg，定量限為15.7 μg/kg。

由圖2～圖4可知，納他霉素色譜圖周圍無雜質(zhì)峰干擾，一級、二級質(zhì)譜圖清晰可見，選擇664.1為納他霉素母離子，選擇碎片離子中豐度較高的3個碎片離子137.1，155.0，162.1作為定性和定量離子。此方法可有效避免誤判。

2.3 方法的準(zhǔn)確性

采用空白樣品加標(biāo)準(zhǔn)回收法測定[9-13]，取濃度分別為10，20，40 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品3份經(jīng)前處理進(jìn)樣分析，每種濃度平行進(jìn)樣3針，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度，除以理論加入濃度，獲得方法回收率，即準(zhǔn)確度結(jié)果。

表4 不同質(zhì)量濃度下的納他霉素回收率結(jié)果(n=3)

由表4可知，納他霉素在高、中、低3個水平回收率均在79.4%～93.1%之間。低濃度回收率略低，隨著濃度的增大，回收率接近100%，這是因為在低水平時，系統(tǒng)誤差較大，隨著濃度的增加，系統(tǒng)誤差逐漸變小。

2.4 方法的重復(fù)性

取濃度為15，30，60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各3份經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度及其RSD，獲得重復(fù)性結(jié)果。

表5 不同質(zhì)量濃度下的納他霉素重復(fù)性測定結(jié)果

由表5可知，重復(fù)性RSD<5%。表明方法重復(fù)性良好。

2.5 方法的精密度

取濃度為15，30，60 ng/mL的質(zhì)控(QC)樣品各1份連續(xù)測定3次。測得納他霉素的峰面積代入隨行的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度。

表6 不同質(zhì)量濃度下納他霉素精密度測定結(jié)果

由表6可知，納他霉素精密度<3%，表明儀器精密度良好，在此范圍內(nèi)，可取得良好精密度。

3 結(jié)論

本實驗針對醬油中納他霉素建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，優(yōu)化了前處理方法。著重考察了該方法的檢出限、定量限、專屬性、線性范圍、方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度等指標(biāo)。結(jié)果顯示：該方法在0～200 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性；納他霉素方法的檢出限為5.14 μg/kg；添加濃度在10，20，40 ng/mL 3個水平條件下的平均回收率在79.4%～93.1%之間；3個水平下重復(fù)性<5%，精密度<3%。該方法具有操作簡單、干擾少、靈敏度高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確等特點，適用于醬油中納他霉素的測定。

[1]GB 2760-2014，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2]李東，杜連祥，路福平，等.納他霉素的抑菌譜及最小抑菌濃度[J].食品工業(yè)科技，2004(7):143-144.

[3]王志強，胡國媛，李志勇，等.微生物抑制法快速檢測鮮奶中多種抗生素殘留[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2008,20(2)：139-141.

[4]Vallvey C.Rapid ultraviolet spectrophotometric and liquid chromatographic methods for the determination of natamycin inLactoserummatrix[J].J AOAC Int,2000,83(4):802-808.

[5]王克利，張宣義，劉醇，等.HPLC法測定沙拉醬和干酪中納他霉素含量方法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，1998(6)：380-381.

[6]駱健美，金志華，岑沛霖.RP-HPLC法測定發(fā)酵液中納他霉素含量[J].中國抗生素雜志，2004，29(11)：653-656.

[7]陳永艷，李彩瑞，楊秀敏，等.高效液相色譜測定果醬中的納他霉素[J].中國食品學(xué)報，2008,8(1)：115-118.

[8]周玉虎，趙慧芬.導(dǎo)數(shù)光譜法測定酸奶中的納他霉素[J].中國乳品工業(yè)，2008,36(8)：54-55.

[9]申國華，董培智，裴社強，等.HPLC-MS-MS法測定降糖類中成藥中非法添加物格列波脲[J].中成藥，2014,36(6)：1213-1217.

[10]林芳，李濤，耿慶光，等.超高效液相色譜-二級管陣列檢測器法快速測定保健食品中違法添加的14種性功能藥物[J].食品科學(xué)，2014,35(4)：163-169.

[11]朱峰，阮麗萍，馬永健，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測降糖類和減肥類保健品中20種非法添加的化學(xué)降糖藥物[J].色譜，2014,32(1)：13-20.

[12]沈國芳,朱建,裘一靜.UPLC-MS-MS檢測減肥類保健食品中的西布曲明及其甲基衍生物[J].中國藥學(xué)雜志，2011，46(20)：1609-1611.

[13]吳楊，張圓，閔春艷，等.輔助降血糖類保健食品非法添加化學(xué)物質(zhì)檢測方法研究[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2014,11(10)：11-14.