趙小文 白雪嶺 張 鵬 張東鋒 穆 林

1(深圳市艾科賽龍科技股份有限公司 深圳 518053)

2(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

松質(zhì)骨由大量骨小梁相互交織構(gòu)成，呈海綿狀，排列方向與骨所承受的壓力和張力的方向一致，遵循用最小的骨量達(dá)到最大的骨強(qiáng)度的原則，起到支持、減輕重量、緩沖、容納骨髓以及應(yīng)對(duì)形變、適應(yīng)形變等功能[1,2]。骨小梁在人體內(nèi)分布廣，雖然松質(zhì)骨僅占人體骨量的 20%，但構(gòu)成 80% 的骨表面，包含有膠原、礦物質(zhì)以及骨組織細(xì)胞等各種不同的結(jié)構(gòu)，是多種代謝發(fā)生的場(chǎng)所，也是血液系統(tǒng)的重要發(fā)源地。

骨缺損是臨床上常見(jiàn)的疾病，也是骨科臨床治療的難題之一。目前，治療骨缺損的方法有自體骨和異體骨移植、組織工程技術(shù)和基因治療法及生長(zhǎng)因子、物理治療法的輔助治療等。利用3D 打印技術(shù)構(gòu)建多孔支架[3]是骨缺損修復(fù)的發(fā)展趨勢(shì)之一，已廣泛地應(yīng)用于因創(chuàng)傷、骨腫瘤、感染、先天性骨病等所致的骨缺損[4]。多孔支架的修復(fù)缺損過(guò)程主要依靠其提供的細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境[5]，傳導(dǎo)力學(xué)刺激實(shí)現(xiàn)成骨，同時(shí)復(fù)合生物材料的骨誘導(dǎo)性能發(fā)揮積極作用[6-8]。然而，傳統(tǒng)骨骼缺損修復(fù)體大多采用均勻、規(guī)則的幾何體，只保證了孔徑和孔隙率[9,10]，雖然可以滿足少部分松質(zhì)骨的生物力學(xué)特性和生理微環(huán)境特征，但與真實(shí)的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)和生理功能還有很大的差距，甚至?xí)斐伤狼唬蔀樾碌闹委燂L(fēng)險(xiǎn)。

本研究首先采用 Micro CT 掃描兔股骨近端松質(zhì)骨，并分別應(yīng)用 Mimics 和 Rhino 軟件構(gòu)建三維[11]松質(zhì)骨模型并分析其幾何特征；然后，基于斯特林公式對(duì)松質(zhì)骨模型進(jìn)行仿生建模[12-15]，構(gòu)建仿生骨小梁并進(jìn)行 3D 打?。蛔詈?，通過(guò)幾何相似性分析對(duì)比和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證仿生骨小梁的有效性。骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法，可為動(dòng)物骨骼的修復(fù)與重建提供建模的參考方法，對(duì)人體組織工程學(xué)的發(fā)展提供參考和方法依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

(1)樣本：遴選 10 例活體兔的后肢股骨，骨齡 3 歲，骨骼發(fā)育正常、完整。

(2)硬件：Micro CT 機(jī)；圖形工作站：CPU E5-2609 1.9 G，內(nèi)存 128 G。

(3)軟件：Mimics 19，Rhino5.0。

(4)3D 打印材料：羥基磷灰石(HA)納米材料 100 g，聚己內(nèi)酯(PCL)材料 100 g 等。

(5)艾科賽龍生物打印機(jī) 1 臺(tái)。

2.2 松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)解析

(1)Micro CT 掃描兔活體后肢股骨，掃描斷層與后肢骨長(zhǎng)軸垂直[16]。掃描參數(shù)[17]：層厚為0.013 872mm；電流 100 mA；電壓 69 kV；共622 幅(1 000×1 000)斷層圖像，如圖1所示。

圖1 兔股松質(zhì)骨顯微 CT 圖像Fig. 1 Micro CT image of cancellous bone of rabbit proximal femur

(2)應(yīng)用 Mimics 三維重建軟件，截取松質(zhì)骨廣泛均勻分布的關(guān)節(jié)頭區(qū)域，重建三維兔后肢股骨圖像，輸出為 stl 文件(一種 3D 模型文件格式)，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 兔股骨關(guān)節(jié)頭區(qū)域松質(zhì)骨 stl 三維模型Fig. 2 3D stl model of cancellous bone of rabbit proximal femur

(3)將文件導(dǎo)入 Rhino 軟件，對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量，分析骨小梁的空間直徑等幾何特征，并做統(tǒng)計(jì)分析[18,19]。

圖3 容積比(V骨小梁/V立方體)Fig. 3 Volume ratio(trabecular bones/cube)

根據(jù)測(cè)量結(jié)果，對(duì)松質(zhì)骨內(nèi)的骨小梁性狀可以總結(jié)以下幾點(diǎn)：精確測(cè)量一組骨小梁的外徑數(shù)據(jù)范圍分布在 0.12～0.06mm，平均值為0.086mm；骨小梁之間的匯集交點(diǎn)在空間以隨機(jī)的形態(tài)分布；骨小梁在空間基本呈現(xiàn)均勻狀態(tài)分布；容積比(V骨小梁/V立方體)在 0.4～0.5，平均值為0.433，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)構(gòu)建

(1)取單位體積(1mm×1mm×1mm)的松質(zhì)骨樣品，測(cè)量骨小梁的總體積(體積0.505mm3)，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 松質(zhì)骨樣品Fig. 4 Cancellous bone sample

(2)仿真數(shù)學(xué)算法模型。計(jì)算和優(yōu)化各項(xiàng)空間向量指標(biāo)，獲得富含骨小梁微結(jié)構(gòu)的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，算法如下：

松質(zhì)骨由海量不規(guī)則的多維球體單元(點(diǎn))構(gòu)成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，每個(gè)單元為n維，將斯特林公式作為n! 的近似值(n約為 1023)。設(shè)r為半徑，Kn(r)代表n維球，中心在原點(diǎn)，滿足以下公式：

對(duì)Kn(r)的體積Vn和表面積On，滿足雅可比公式：

由賦予屬性的各單元組成完整的空間結(jié)構(gòu)，從橫截面(自上而下)截取m個(gè)斷層，得到斷層面為三維結(jié)構(gòu)的斷層面積，相應(yīng)算法為：

設(shè)定一個(gè)與天然骨小梁等體積等結(jié)構(gòu)的空間正方體(1mm×1mm×1mm)(圖5(a))，將多維度的空間點(diǎn)陣裝入此空間，多次疊加(圖5(b))，產(chǎn)生空間多維度連線(圖5(c))[20]，構(gòu)建外徑0.09mm 的仿生骨小梁體，應(yīng)用仿真數(shù)學(xué)算法，通過(guò)容積逼近空間邊際極限，最終達(dá)到二者體積相等，完成仿生松質(zhì)骨構(gòu)建(圖5(d))。

圖5 骨小梁仿真過(guò)程Fig. 5 Simulation process of trabecular bone

3 結(jié) 果

3.1 松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

首先，對(duì)松質(zhì)骨樣本和仿生松質(zhì)骨進(jìn)行 0.1mm等距切割骨小梁面積對(duì)比，結(jié)果如圖6 所示。仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨具有很高的相似度，其中仿生松質(zhì)骨骨小梁外徑為 0.09mm。表1 為在x、y、z三維度做0.1mm 的等距切割對(duì)比數(shù)據(jù)。從表1 可見(jiàn)，松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨在x、y、z三個(gè)方向 0.1mm 的等距切割骨小梁面積分別為 0.500mm2vs 0.516mm2、0.507mm2vs 0.515mm2、0.497mm2vs 0.504mm2。統(tǒng)計(jì)分析顯示，二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明本文構(gòu)建的仿生松質(zhì)骨與真實(shí)松質(zhì)骨樣本模型在x、y、z三個(gè)方向 0.1mm 等距切割的骨小梁面積極其接近。

圖6 松質(zhì)骨樣本等距切割對(duì)比Fig. 6 Comparison of cancellous bone sample

表1 松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨 x、y、z 方向 0.1mm 的等距切割骨小梁面積對(duì)比Table 1 Comparison of trabeculae area between cancellous bone samples and bionic cancellous bone in x, y, and z directions under 0.1mm equidistant cutting

表2 松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨 x、y、z 方向隨機(jī)不等距切割骨小梁面積對(duì)比Table 2 Comparison of trabeculae area between cancellous bone samples and bionic cancellous bone in x, y, and z directions under unequidistant cutting

其次，對(duì)松質(zhì)骨樣本和仿生松質(zhì)骨進(jìn)行隨機(jī)不等距切割[21]，結(jié)果如圖7所示。從橫截面(自上而下)截取m個(gè)斷層，得到斷層面積計(jì)算方法如公式(5)所示。表2 為松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨在x、y、z三維度隨機(jī)不等距切割骨小梁面積對(duì)比數(shù)據(jù)。從表2 可見(jiàn)，松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨在x、y、z三個(gè)方向0.1mm 的不等距切割骨小梁面積分別為 0.505mm2vs 0.543mm2、0.476mm2vs 0.534mm2、0.507mm2vs 0.491mm2。統(tǒng)計(jì)分析顯示，二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明本文構(gòu)建的仿生松質(zhì)骨與真實(shí)松質(zhì)骨樣本模型的x、y、z三個(gè)方向隨機(jī)不等距切割的骨小梁面積極其接近。

圖7 隨機(jī)不等距切割示意圖Fig. 7 Random unequidistant cutting

最后，對(duì)松質(zhì)骨樣本和仿生松質(zhì)骨進(jìn)行相似性分析。

設(shè)計(jì)定量數(shù)據(jù)和定性數(shù)據(jù)的距離計(jì)算函數(shù)是常用的度量數(shù)據(jù)對(duì)象之間相似關(guān)系的方式。以下是根據(jù)解剖學(xué)的復(fù)雜程度更具針對(duì)性建立的相似性數(shù)學(xué)模型[22]。

為了計(jì)算松質(zhì)骨樣本和仿生松質(zhì)骨的相似度，構(gòu)建特征矩陣打分比較：

公式(6)表示(i，j)兩點(diǎn)之間的距離之和，構(gòu)建曲線上兩點(diǎn)在x、y軸上歐氏距離與圖論距離之比。

公式(7)表示(i，j)兩點(diǎn)之間的距離之和，構(gòu)建曲線上兩點(diǎn)在z軸上歐氏距離與圖論距離之比。

整體空間距離為：

如果兩個(gè)對(duì)比向量具有相似性，則其歐氏距離最小。三維向量參數(shù)(γ/N)可以比較相似性分析上的差異，N為空間點(diǎn)的數(shù)量，則不同曲線正則化參數(shù)的向量之間的歐氏距離為：

根據(jù)公式(6)～(9)，可以構(gòu)建松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨相似性數(shù)學(xué)模型，距離函數(shù)Da,b描述兩數(shù)據(jù)對(duì)象之間的關(guān)系。如果a和b越相似，則兩者距離Da,b的值越小。表3 為松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨在x、y、z方向歐氏距離相似性比較結(jié)果。從表3 可知，松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨在x、y、z方向歐氏距離Da,b為 0.007～0.058。統(tǒng)計(jì)分析顯示，二者無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。相似性分析表明，仿生松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨樣本的生理結(jié)構(gòu)具有極高的相似度。

骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法通過(guò)容積逼近構(gòu)建與天然松質(zhì)骨骨小梁體積相等的仿生松質(zhì)骨(也即是說(shuō)仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨具有同樣的孔隙率)，并且仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)達(dá)到很高的相似度(可達(dá) 95% 以上，見(jiàn)表1～3)。

3.2 3D 打印仿生松質(zhì)骨

以羥基磷灰石(HA)為主要基質(zhì) 3D 打印[23,24]尺寸為 20mm×10mm×10mm(長(zhǎng)×寬×高)仿生松質(zhì)骨，結(jié)果如圖8所示。實(shí)驗(yàn)需要打印的骨小梁直徑為 0.4～0.9mm、孔徑為 300～500 μm，而艾科賽龍生物打印機(jī) Nozzle 擠出材料的最小線徑為 0.02mm、精度為 0.05mm，完全滿足了打印仿生松質(zhì)骨細(xì)微結(jié)構(gòu)的要求。

表3 松質(zhì)骨樣本與仿生松質(zhì)骨 x、y、z 方向歐氏距離相似性比較Table 3 Comparison of Euclidean distance similarity between cancellous bone samples and bionic cancellous bone in x, y, and z directions

3.3 體外實(shí)驗(yàn)

3.3.1 小鼠成骨細(xì)胞在仿生骨小梁結(jié)構(gòu)中增殖變化

首先，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)，選用 10% FBS (胎牛血清)＋DMEM 培養(yǎng)基作為細(xì)胞培養(yǎng)液。將 100 μL 濃度為 8 000～10 000 個(gè)/孔的細(xì)胞懸液種植到仿生骨小梁結(jié)構(gòu)中，置于 37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，每隔兩天更換培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。其次，分別在培養(yǎng)時(shí)間的第 1、3、5 和 7天，吸去上清液，加入 20 μL MTT(噻唑藍(lán))溶液(5 mg/mL，即 0.5% MTT)繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后吸掉上清，每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。最后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔 490 nm 吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。圖9 為小鼠成骨細(xì)胞在仿生骨小梁結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞分布。從圖9 可見(jiàn)，成骨細(xì)胞沿仿生松質(zhì)骨的骨小梁結(jié)構(gòu)分布且隨時(shí)間的增加而迅速增殖(見(jiàn)圖10)。

圖9 小鼠成骨細(xì)胞在仿生骨小梁結(jié)構(gòu)中細(xì)胞分布Fig. 9 Cell distribution of MC3T3-E1 osteoblasts in bionic trabecular structure

圖10 小鼠成骨細(xì)胞在仿生骨小梁結(jié)構(gòu)中增殖變化Fig. 10 The proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts in bionic trabecular structure

3.3.2 仿生骨小梁區(qū)域成骨細(xì)胞聚集效應(yīng)及其再生微結(jié)構(gòu)功能化驗(yàn)證

用抗 iNOS 和抗 RANKL 抗體染色觀察[25]發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)骨形成的一氧化氮合酶陽(yáng)性細(xì)胞在骨小梁結(jié)構(gòu)區(qū)域大量出現(xiàn)，并高表達(dá)骨重建蛋白R(shí)ANKL，結(jié)果如圖11 所示。把培養(yǎng) 4～6 周后的仿生骨小梁微結(jié)構(gòu)支架切成 10mm 的片狀體，在電鏡下對(duì)三維微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察(圖12)。通過(guò)Micro CT(精度 0.013 872mm，掃描層厚設(shè)定為0.625mm)掃描并構(gòu)建三維模型觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠成骨細(xì)胞逐漸形成骨小梁生理微結(jié)構(gòu)和進(jìn)一步功能化趨勢(shì)(圖13)。

圖11 骨小梁結(jié)構(gòu)區(qū)域一氧化氮合酶陽(yáng)性細(xì)胞聚集并高表達(dá)骨重建蛋白 RANKLFig. 11 Accumulation of nitric oxide synthase positive cells in bionic trabecular structure and high expression of bone remodeling protein RANKL

圖12 10mm 切片骨小梁結(jié)構(gòu)電鏡圖像Fig. 12 10mm slice of trabecular structure with electron microscopy

圖13 三維骨小梁微結(jié)構(gòu)模型Fig. 13 3D trabecular microstructure model

4 討 論

本研究開(kāi)發(fā)了一種新的骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法，成功地構(gòu)建了兔仿生松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)，算法通過(guò)容積逼近空間邊際極限最終達(dá)到仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨骨小梁體積相等，也即是說(shuō)仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨具有同樣的孔隙率，并且仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)達(dá)到很高的相似度(可達(dá) 95% 以上)。傳統(tǒng)松質(zhì)骨多孔支架的制備方法(如相分離法、溶媒擴(kuò)散法、氣體發(fā)泡法等)，隨機(jī)產(chǎn)生連結(jié)并不能為支架的組織長(zhǎng)入提供最理想的滲透性，也不能為再生組織的力學(xué)性能提供最大程度優(yōu)化的連結(jié)性[26]。3D 打印技術(shù)能夠精確地制備出外形符合要求的支架，雖然均勻孔隙率多孔支架能夠在整體孔隙率逼近真實(shí)樣本，但在骨小梁微結(jié)構(gòu)的制造上與真實(shí)松質(zhì)骨還有較大的差距[27,28]。Lui 等[29]介紹過(guò)使用傳統(tǒng)方法制備羥基磷灰石基多孔柱狀支架修復(fù)骨缺損，使用自體間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和未使用間充質(zhì)干細(xì)胞的組織學(xué)和形態(tài)統(tǒng)計(jì)分析表明，成骨數(shù)量存在顯著性差異(P＜0.05)，復(fù)合了自體干細(xì)胞的多孔支架也僅在表面與宿主骨骨膜區(qū)的骨痂結(jié)合形成了最大厚度為 3.14mm 外層圈。而本文復(fù)合成骨細(xì)胞成功培養(yǎng)了尺寸為 20mm×10mm×10mm 大小的 3D 打印仿生松質(zhì)骨。最新的研究但并非本文提供的方法構(gòu)建的細(xì)胞生長(zhǎng)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，顯示了直徑為 700 nm，最遠(yuǎn)柱間距為 5.6 μm的納米柱才有利于骨形成，但在空間寬度和間距為 1～10 μm，高度為 0.35～10 μm 的格柵上，脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的伸長(zhǎng)現(xiàn)象并不明顯且影響細(xì)胞增殖[30]。這類結(jié)構(gòu)還達(dá)不到本文仿生骨小梁微結(jié)構(gòu)的目的，遠(yuǎn)不如真實(shí)的骨小梁的自然三維結(jié)構(gòu)。本文所采用的骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法，能夠在最大程度上對(duì)松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)進(jìn)行仿生建模，滿足真實(shí)松質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性，在骨小梁仿生設(shè)計(jì)領(lǐng)域具有極大的優(yōu)勢(shì)。

天然松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)復(fù)雜，傳統(tǒng)骨骼缺損修復(fù)體大多采用均勻、規(guī)則的幾何體，只能滿足少部分松質(zhì)骨的生物力學(xué)特性和生理微環(huán)境特征，與真實(shí)的松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)和生理功能還有很大的差距，甚至?xí)斐伤狼?。本研究通過(guò)對(duì)天然松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建，還原出結(jié)構(gòu)高度相似的仿生松質(zhì)骨，雖然仿生松質(zhì)骨與天然松質(zhì)骨還是有差距，但通過(guò)生物活性的自身調(diào)節(jié)和修復(fù)，最終可以達(dá)到天然松質(zhì)骨的性狀。另外，骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法可以擴(kuò)展到大尺寸松質(zhì)骨的人工制造，通對(duì)大體積松質(zhì)骨分布情況分析和量化，最終完成大尺寸的仿生松質(zhì)骨的構(gòu)建。

5 結(jié) 論

研究通過(guò)生物 3D 打印制備仿生松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法可以構(gòu)建與實(shí)體松質(zhì)骨相似的仿生松質(zhì)骨骨小梁微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境。本研究開(kāi)發(fā)的骨小梁仿生微結(jié)構(gòu)的解析與構(gòu)建方法，結(jié)合 3D 打印技術(shù)，可應(yīng)用于人體骨缺損修復(fù)與功能重建，為植入物的骨小梁結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了思路和理論依據(jù)，為 3D 打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究、臨床研究、臨床應(yīng)用提供了更真實(shí)的生理結(jié)構(gòu)，為人體組織工程在微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的研究及應(yīng)用方面提供了路徑參考和理論依據(jù)。

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