劉 緣 潘浩波 趙曉麗

(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

南極磷蝦屬節(jié)肢動物門甲殼綱磷蝦目，是生活在南冰洋的南極洲水域的無脊椎動物。南極磷蝦的蘊藏量十分豐富，可達 6.5×108～10×108t[1,2]，是最為豐富的一種海洋動物資源。在2010 年，中國水產(chǎn)品總產(chǎn)量近 6 000 萬噸[3]，不到南極磷蝦資源總量的 10%。南極磷蝦營養(yǎng)價值高，含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素及其他生物活性成分[4]。更為重要的是，從南極磷蝦廢棄的蝦殼中可以提取甲殼素，再經(jīng)過脫乙?？梢缘玫接猛緩V泛的殼聚糖。與近海資源相比，以南極磷蝦的蝦殼作為殼聚糖的新型來源，其優(yōu)勢在于無污染，重金屬含量低，巨大的生物質(zhì)存量可以保證殼聚糖質(zhì)量的穩(wěn)定性，同時南極極端的自然環(huán)境可能賦予它特殊的理化性質(zhì)。

殼聚糖，英文名 Chitosan，又名脫乙酰甲殼素，經(jīng)甲殼素脫去乙?；玫?，是甲殼素的主要改性產(chǎn)物；化學(xué)名β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖[5](圖1)，是自然界中唯一存在的堿性多糖，被稱為繼蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素、礦物質(zhì)以外的第六生命要素。殼聚糖具有很好的生物相容性[6]、生物降解性及安全性，其固有的優(yōu)良性能使其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[7,8]。

近年來，南極磷蝦作為殼聚糖的來源引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦殼聚糖具有優(yōu)異的止血效果，在創(chuàng)傷和止血方面具有很好的應(yīng)用前景[9]。目前臨床應(yīng)用的止血材料主要包括沸石、馬鈴薯淀粉、明膠和膠原等，在使用中都存在一定局限性。其中，明膠和膠原的組織黏附性能較差，它們的止血功能均依賴于血小板和凝血因子，應(yīng)用受到限制[10]。沸石在吸收血液中的水分后會放出大量的熱，可能會導(dǎo)致傷口炎癥[11]。相比之下，無毒、無抗原性、抗菌性和生物相容性良好的殼聚糖在開發(fā)止血材料方面有著更大的優(yōu)勢，但提取殼聚糖的工藝還有待進一步優(yōu)化。

圖1 殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The molecular structure of chitosan

南極磷蝦的蝦殼中含有大量的甲殼素，其個體小，蝦殼薄，處理工藝與傳統(tǒng)的蝦殼和蟹殼不同。因此，本研究將對南極磷蝦殼聚糖的提取工藝進行探索與優(yōu)化，對產(chǎn)物的各項性能進行表征，并對其凝血效果進行評價。

2 實驗方法

2.1 實驗試劑與儀器

氫氧化鈉、鹽酸、冰醋酸等購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，G250 考馬斯亮藍染色劑、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，氘帶醋酸、重水購自 Aladdin(阿拉丁)公司。作為對照的殼聚糖分別購買于 Aladdin 公司(a-cs，脫乙酰度≥95%)，J&K 百靈威(b-cs，平均分子量 100 000～300 000)。

紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)，VERTEX 70，德國BRUKER 公司。熱重分析儀，TAQ600，賽默飛世爾科技公司。旋轉(zhuǎn)黏度計，NJD-1，上海精純儀器設(shè)備有限公司。烏氏粘度計，賽默飛世爾科技公司。全波長讀數(shù)儀，Multiskan Go，賽默飛世爾科技公司。核磁共振波譜儀，AVANCE Ⅲ 400，賽默飛世爾科技公司。冷凍干燥機，F(xiàn)D-1D-80，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

2.2 南極磷蝦殼聚糖的提取

首先通過兩次酸堿交替，從南極磷蝦的蝦殼中提取甲殼素。具體方法如下，將干蝦殼和1 mol/L HCl 按 1∶20 質(zhì)量體積比(m/v)在室溫下攪拌反應(yīng) 1 h，過濾沖洗至中性，進行脫鈣。然后加入 1 mol/L NaOH 溶液(m/v＝1∶20)，于100℃ 下攪拌反應(yīng) 1 h 進行脫蛋白，過濾沖洗至中性。分別重復(fù)一次脫鈣、脫蛋白的步驟，將得到的產(chǎn)物于 60℃ 烘箱中烘干得到甲殼素。

將得到的甲殼素脫乙酰制備殼聚糖，步驟如下：(1)將甲殼素與 50% 濃 NaOH 按 1∶50 質(zhì)量/體積加入三口燒瓶，在油浴鍋中 110℃ 回流反應(yīng) 1 h，于室溫攪拌 2 h；重復(fù)上述脫乙酰步驟后，將收集得到的產(chǎn)物沖洗至中性，干燥可得殼聚糖粗品。(2)將殼聚糖粗品溶解在 1% 的乙酸溶液中進行純化，過濾除去不溶性雜質(zhì)；然后用 1 mol/L NaOH 將溶液的 pH 調(diào)節(jié)至 8.5，待產(chǎn)生白色絮狀沉淀，對溶液進行過濾收集沉淀物；(3)將沉淀物用雙蒸水洗滌至中性并通過冷凍干燥，即得到亮白色的南極磷蝦殼聚糖粉末(n-cs)。

2.3 殼聚糖的性質(zhì)表征

2.3.1 紅外光譜

采用溴化鉀(KBr)壓片法，將南極磷蝦殼聚糖樣品和 KBr 粉末混合，充分研磨制成壓片，用BRUKER VERTEX 70 傅里葉變換紅外光譜儀掃描，記錄樣品在 400～4 000 cm－1的紅外吸收光譜。

2.3.2 核磁共振圖譜

取 10 mg 殼聚糖粉末溶于 1 mL 2% 氘帶醋酸的重水溶液，用 AVANCE Ⅲ 400 核磁共振波譜儀測定殼聚糖的1H NMR 圖譜。

2.3.3 灰分含量測量

稱取 5～10 mg 的殼聚糖，采用熱重分析儀測量灰分含量。其中，天平和樣品載氣均為空氣，流速 20 mL/min，設(shè)定溫度從室溫升至800℃(保持 20 min)，由所得數(shù)據(jù)計算其灰分含量。

2.3.4 蛋白含量測量

用 Bradford 法[12]對殼聚糖蛋白質(zhì)含量進行測定。首先，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白配制成不同濃度梯度，加入 G250 染色劑，在 Multiskan Go 全波長讀數(shù)儀上測定 595 nm 處吸光度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。其次，將殼聚糖樣品溶于 1% 的醋酸溶液中使其濃度為 10 mg/mL，G250 進行染色后，在 595 nm處測定其吸光值。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出殼聚糖的蛋白含量。

2.3.5 分子量測量

采用烏氏粘度法測量其粘均分子量。首先，稱取 0.015 g 殼聚糖溶于 20 mL 0.3 mol/L 醋酸/0.2 mol/L 醋酸鈉溶劑中，充分溶解后用濾紙過濾除去微細(xì)不溶物。其次，調(diào)節(jié)恒溫槽溫度至(25.0±0.1)℃，將烏氏粘度計垂直放入恒溫槽，使水面完全浸沒 G 球，測得殼聚糖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時間t，重復(fù) 3 次(每次的差值不超過 0.2 s)，計算平均值；測定純?nèi)軇┝鹘?jīng)毛細(xì)管所需時間t0。最后，相對粘度ηr＝t/t0，增比粘度ηsp＝ηr－1，根據(jù)一點法公式η＝(ηsp＋3㏑ηr)/4c(c為溶液濃度)計算出殼聚糖的粘度(η)，再由粘度計算粘均分子量M＝η／ka[13]。其中，k＝0.007 9，a＝0.796。

2.3.6 黏度測量

采用旋轉(zhuǎn)黏度計測量殼聚糖溶液的黏度。稱取 0.25 g 殼聚糖樣品溶于 25 mL 1% 醋酸溶液中，攪拌 30 min 使其充分溶解。靜置一段時間后，在 20℃ 左右條件下用 NJD-1 型旋轉(zhuǎn)黏度計測試其黏度。

2.4 提取工藝對南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)的影響

2.4.1 前處理對殼聚糖顏色的影響

將南極磷蝦蝦殼用 1 mol/L 的 NaOH 進行前處理：室溫下攪拌浸泡 24 h，過濾水洗后重復(fù)一次，水洗至中性并干燥。之后與未做前處理的殼聚糖進行對比實驗。

2.4.2 酸濃度對殼聚糖灰分含量的影響

首先，將南極磷蝦蝦殼分別用 1 mol/L 和2 mol/L 的鹽酸進行脫鈣處理，后續(xù)操作均相同。其次，采用熱重分析儀測量灰分，并比較 2種產(chǎn)物的灰分含量。

2.4.3 反應(yīng)時間對殼聚糖蛋白質(zhì)含量的影響

將南極磷蝦蝦殼在 1 mol/L NaOH 溶液于100℃ 分別反應(yīng) 1 h 和 1.5 h，其他操作均相同，用 Bradford 法，比較最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。

2.4.4 不同反應(yīng)溫度和時間對殼聚糖脫乙酰度的影響

為探討不同反應(yīng)溫度和時間對殼聚糖脫乙酰度的影響，對甲殼素做 2 種處理，具體如下。

(1)將制備的甲殼素(6 g)平均分成 3 份，置于 220 mL 的三口燒瓶中，加入 100 mL 50% 的NaOH，分別在 100℃、110℃ 和 130℃ 的油浴鍋加熱攪拌回流 1 h 進行脫乙酰反應(yīng)，水洗至中性；重復(fù)一次前述脫乙酰的操作，獲得脫乙酰殼聚糖。

(2)將制備的甲殼素(6 g)平均分成 3 份，置于 220 mL 的三口燒瓶中，加入 100 mL 50% 的NaOH，在 110℃ 的油浴鍋加熱攪拌回流進行脫乙酰反應(yīng)，反應(yīng)時間分別為 1 h、2 h 和 3 h，水洗至中性；重復(fù)一次前述脫乙酰的操作，獲得脫乙酰殼聚糖。

對上述 2 種方法處理獲得的產(chǎn)物均采用核磁譜圖檢測其脫乙酰度。

2.5 凝血效果評價

采用試管法評價殼聚糖的凝血效果，具體步驟如下：(1)取最優(yōu)條件制備的南極磷蝦殼聚糖和從阿拉丁和百靈威購買的殼聚糖粉末(10 mg)，分別放入玻璃管中并預(yù)熱至 37℃；(2)通過 SD大鼠心臟取血實驗獲得實驗用血液，存放于抗凝試管中備用；(3)取 1.0 mL 血液分別加入到不同的殼聚糖試管中，而未加殼聚糖的血液凝固時間作為對照；(4)加入 0.2 mol/L CaCl2達到 20mmol/L[14]恢復(fù)血液凝血能力并開始計時；(5)每隔 30 s 傾斜試管檢查血液流動情況，直到血液完全停止流動，停止計時。所有實驗組及對照組均同時做 3 份重復(fù)，最終取平均值。

3 結(jié) 果

3.1 南極磷蝦殼聚糖外觀顏色

本研究采用酸堿交替法提取南極磷蝦殼聚糖，免去了傳統(tǒng)的殼聚糖制備工藝過程中的脫色操作。與商品化的淡黃色殼聚糖相比，南極磷蝦殼聚糖的顏色為亮白色(如圖2)。

圖2 南極磷蝦殼聚糖產(chǎn)物形貌Fig. 2 The morphology of Antarctic krill shell fi sh

3.2 紅外光譜

南極磷蝦殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)由紅外光譜確定，結(jié)果如圖3 所示。在譜圖中，殼聚糖的特征吸收峰在 1 653、1 570 和 1 077 cm－1處，分別屬于 C＝O 伸縮(酰胺 I 帶)、N－H 變形(酰胺 II帶)和 C－O 伸縮振動[15]。產(chǎn)物符合殼聚糖的特征峰。

圖3 不同種類的殼聚糖紅外譜圖Fig. 3 The FTIR of the different kinds of chitosan

3.3 1H 核磁共振

目前可用來測定殼聚糖的脫乙酰度的方法有很多，但1H 核磁共振法是檢測殼聚糖脫乙酰度最為準(zhǔn)確、快速的方法，并且重復(fù)性好，其譜圖結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同種類殼聚糖的核磁氫譜Fig. 4 The 1H NMR of the different kinds of chitosan

脫乙酰度按以下公式[16]計算：

由表1 可知，南極磷蝦殼聚糖和購買于阿拉丁公司的殼聚糖的脫乙酰度都高于 90%，滿足醫(yī)用級殼聚糖的標(biāo)準(zhǔn)。而購買于百靈威公司的殼聚糖脫乙酰度較低，僅為 72.64%。

表1 不同來源的殼聚糖脫乙酰度Table 1 The degree of deacetylation of chitosan from different sources

3.4 南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)

國家食品藥品監(jiān)督管理局在 2008 年制定了YY/T0606.7—2008《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品第 7 部分：殼聚糖》[17]。其中，對殼聚糖的雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)做了規(guī)定：規(guī)定殼聚糖中灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.5%，蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.2%。鑒于該步驟得到的殼聚糖蛋白含量(0.55%)及灰分含量(0.85%)都還比較高(見表2)，將在純化過程中進一步進行處理。

表2 南極磷蝦殼聚糖的理化性質(zhì)Table 2 The physiochemical properties of Antarctic krill chitosan

3.5 提取工藝對南極磷蝦殼聚糖理化性質(zhì)的影響

3.5.1 前處理對殼聚糖顏色的影響

在南極磷蝦中，顯色的物質(zhì)為蝦紅素，它在高溫、紫外光照射、酸堿等條件下易分解，同時在加熱的條件下可以和蛋白質(zhì)結(jié)合。雖然在脫蛋白的過程中可以去除部分蝦紅素，但一般仍有殘留，最終以糖蛋白的結(jié)合形式殘留在殼聚糖中。本研究通過增加堿浸泡的前處理工序，減少殼聚糖中蝦紅素的殘留。通過對比可發(fā)現(xiàn)，未做前處理的殼聚糖顏色偏粉，而用增加堿液進行前處理工藝得到的殼聚糖顏色亮白(圖5)。表明堿液前處理可以降低殼聚糖中蝦紅素的含量，獲得更好的殼聚糖形貌。目前其他文獻報道和商品化的殼聚糖多為淡粉色或淡黃色[18,19]，而這一前處理工藝可以解決殼聚糖顏色偏黃的問題，從而具有更廣泛的應(yīng)用[20]。

圖5 前處理工藝對殼聚糖的影響Fig. 5 Effects of pretreatment in NaOH solution on the color of chitosan

3.5.2 酸濃度對殼聚糖灰分含量的影響

通過不同酸濃度處理結(jié)果顯示，用 1 mol/L的鹽酸進行脫鈣處理后得到的南極磷蝦殼聚糖灰分含量為 0.85%，而用 2 mol/L 的鹽酸進行脫鈣處理得到的南極磷蝦殼聚糖，其灰分含量降到0.095%，達到醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。這表明增加酸處理濃度可降低殼聚糖中的灰分含量。

3.5.3 反應(yīng)時間對南極磷蝦殼聚糖蛋白質(zhì)含量的影響

在脫蛋白過程中，對南極磷蝦蝦殼分別用堿液反應(yīng) 1 h 和 1.5 h，將得到的殼聚糖的蛋白含量進行對比。由結(jié)果(表3)可見，延長脫蛋白時間對南極磷蝦殼聚糖中蛋白質(zhì)的去除沒有顯著的影響。蛋白質(zhì)去除困難的原因可能是甲殼動物外殼中的蛋白質(zhì)與甲殼素通過共價、靜電、疏水和氫鍵等作用方式形成甲殼素-蛋白質(zhì)糖蛋白復(fù)合物[20]。這種較強的相互作用，給提取殼聚糖帶來了難度。同時，由于殼聚糖在脫蛋白工藝中通過強堿已經(jīng)去除了大部分的蛋白質(zhì)，剩余蛋白含量極少，因而再增加堿處理時間對去除殼聚糖中剩余蛋白質(zhì)作用不明顯[21]，完全去除殼聚糖的蛋白還需通過其他方式進一步研究。

表3 反應(yīng)時間對南極磷蝦殼聚糖蛋白含量的影響Table 3 The effects of different reaction time of alkali treatments on the protein content of Antarctic krill chitosan

3.5.4 不同脫乙酰處理條件對殼聚糖脫乙酰度的影響

通過脫乙酰過程中不同反應(yīng)溫度和時間，研究其對殼聚糖脫乙酰度的影響。由結(jié)果(表4)可見，當(dāng)反應(yīng)時間為 1 h 、溫度為 100℃ 時，殼聚糖脫乙酰度為 83% 左右。當(dāng)升高溫度至 110℃后，脫乙酰度增加了約 7%，但繼續(xù)升高溫度對脫乙酰度的影響不大。在 110℃ 反應(yīng)溫度下研究增加脫乙酰反應(yīng)時間對脫乙酰度的影響發(fā)現(xiàn)，不同反應(yīng)時間下的殼聚糖脫乙酰度都約為 90%，沒有顯著性區(qū)別，說明增加反應(yīng)時間對脫乙酰度的提高影響不大?？赡苁怯捎诿撘阴＿^程中，酰胺鍵的斷裂主要發(fā)生在反應(yīng) 1 h 內(nèi)，由于空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合形式等原因，剩余少量的酰胺鍵在當(dāng)前的反應(yīng)條件下達不到斷裂反應(yīng)條件，而繼續(xù)增加反應(yīng)時間會發(fā)生殼聚糖主鏈的斷裂，導(dǎo)致分子量的下降，黏度降低。因此，由以上結(jié)果可確定脫乙酰反應(yīng)的最優(yōu)條件為 110℃ 反應(yīng) 1 h。

表4 不同脫乙酰處理條件對殼聚糖脫乙酰度的影響Table 4 The effects of different deacetylation conditions on the degree of deacetylation of chitosan

3.6 凝血效果評價

圖6 不同殼聚糖的凝血效果Fig. 6 The effect of different chitosan on the blood coagulation

殼聚糖可以凝血的原因是由于它所攜帶的正電荷可以吸附帶有負(fù)電的血小板及凝血蛋白等，并有激活血小板的凝血功能。本研究通過凝血實驗對比提取的南極磷蝦殼聚糖與商品化的殼聚糖的凝血效果。由圖6 可見，復(fù)凝血液的自凝固時間需要約 1 000 s，而不同來源的殼聚糖均能夠有效地降低血液凝固的時間。其中，阿拉丁殼聚糖(a-cs)和百靈威殼聚糖(b-cs)能夠?qū)⒛獣r間降低至對照組的約 40%，而南極磷蝦殼聚糖(n-cs)具有更明顯的凝血作用，能夠進一步縮短 15% 的凝血時間。這說明南極磷蝦殼聚糖的凝血效果更佳。

4 討 論

南極磷蝦生物蘊藏量十分豐富，其蝦殼作為殼聚糖的新型來源，相對近海資源來說具有無污染的優(yōu)勢，而且南極磷蝦個體小、蝦殼薄，易于處理。對于從南極磷蝦提取的殼聚糖，傳統(tǒng)工藝多采用酸堿交替的實驗方法，酸處理和堿處理都在 3 次以上[22]，操作步驟較多，有些還需用到高錳酸鉀來進行脫色[18]。本研究采用 2 次酸堿交替法，且每次處理僅需 1 h，相對地減少了操作步驟，縮短了實驗時間；同時，南極磷蝦殼聚糖為亮白色，無需再進行脫色處理，避免了造成環(huán)境污染的可能。得到南極磷蝦殼聚糖的脫乙酰度高于 90%，分子量為 123 kDa，灰分含量為 0.095%，達到醫(yī)藥級的標(biāo)準(zhǔn)。但蛋白含量仍然較高，需要針對天然多糖的蛋白去除做進一步研究。

凝血實驗表明，南極磷蝦殼聚糖的凝血效果優(yōu)于其他商品化的殼聚糖。殼聚糖的多種理化性質(zhì)，如分子量、脫乙酰度、特性黏度、水合度、結(jié)晶度、蛋白含量和灰分等[23]對止血效果均有一定的影響。其中，脫乙酰度、分子量和水合度起主要作用，蛋白含量和灰分對于凝血作用的影響較小。提高脫乙酰度對殼聚糖促凝血效果具有促進作用，高分子量的殼聚糖凝血效果略優(yōu)于低分子量的殼聚糖。據(jù)報道，南極磷蝦殼聚糖結(jié)構(gòu)內(nèi)的自由羥基含量高[22]。而我們前期研究也發(fā)現(xiàn)這種殼聚糖的水化能力明顯高于其他來源的殼聚糖[9]，再加上結(jié)晶度、分子量等的差別，使得南極磷蝦殼聚糖的凝血效果更好，這也從一定程度上表明其在止血材料方面具有極大的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 論

本研究以生活在南極水域的南極磷蝦為來源，進行殼聚糖提取的工藝研究。通過脫蛋白、脫鈣和脫乙酰得到的殼聚糖為亮白色，脫乙酰度達 90.6%，分子量為 123 kDa，灰分含量為0.095%。通過對提取工藝進行優(yōu)化可以發(fā)現(xiàn)，堿液前處理能夠改善殼聚糖表觀顏色，提高酸濃度能夠降低灰分，延長脫蛋白時間對降低蛋白含量作用較小，脫乙酰的最適溫度在 110℃，而延長反應(yīng)時間對提高脫乙酰度作用不大。將優(yōu)化制備工藝后的殼聚糖進行止血效果評價發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦殼聚糖的凝血效果優(yōu)于其他殼聚糖。應(yīng)用南極磷蝦作為殼聚糖的提取來源，將提高現(xiàn)有殼聚糖止血產(chǎn)品的止血效果，具有重要的應(yīng)用前景。

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