包雍宏，吳 琛，王秀文，時文悅，宋元達

（山東理工大學，山東淄博 255000）

甲殼素由N-乙酰氨基葡萄糖殘基經過β-1,4 糖苷鍵聚合而成的線性多糖[1]。全球每年產生甲殼素約1 000億t，產量僅次于纖維素，是自然界中含量第二豐富的天然多糖，被現代科學譽為“第六生命要素”[2]。甲殼素主要存在于各種無脊椎動物的細胞外基質中，包括海綿、軟體動物、線蟲、節(jié)肢動物和真菌等[3]，它是保護和支持細胞外基質的重要組成部分，包裹覆蓋整個組織或生物體。甲殼素發(fā)現較早，可追溯到200 年前。法國學者Braconot[4]在1811 年從Agaricusvolvaceus、Hydnumrepandum等真菌中發(fā)現了同時含有氮和乙?；奈镔|。Odier 在1823 年從甲殼類動物的外殼中分離出具有相似性質的物質，將其命名為“甲殼素”。甲殼素為白色或淡黃色片狀固體，其分子間的氫鍵作用很強，具有很好的化學穩(wěn)定性。甲殼素難溶于普通試劑，這嚴重限制了甲殼素的應用，目前發(fā)現的較好的甲殼素溶劑有濃硫酸、濃鹽酸、濃磷酸、氫氟酸、濃NaOH、KOH 溶液和一些特殊的溶劑（如氯化鋰/N,N-二甲基乙酰胺、六氟異丙醇/六氟丙醇、三氟醋酸等）。

自然界中的甲殼素可被微生物降解成多糖，被其他生物利用，維持生態(tài)系統(tǒng)的碳氮循環(huán)。因此，甲殼素的降解代謝對全球的碳和氮循環(huán)具有重要意義，而維持這種循環(huán)離不開甲殼素降解菌和甲殼素酶。甲殼素酶（chitinase，EC 3.2.1.14）是一種可以專一性水解甲殼素為低分子糖的酶，主要作用于甲殼素中的β-1,4 糖苷鍵。1905 年，BENECKE 等[5]研究芽孢扦菌（Bacilluschitinovrous）分解甲殼素酶的過程中，首次發(fā)現并分離出一類糖苷水解酶，可催化水解甲殼素為N-乙酰氨基葡萄糖聚體或單體。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現甲殼素酶廣泛分布于自然界中的真菌、細菌以及放線菌中，同時在昆蟲、甲殼類動物、高等植物甚至病毒中都有發(fā)現。本文介紹了微生物甲殼素酶的分類和分布情況，總結了近年來微生物甲殼素酶的相關研究及其在不同行業(yè)的應用前景。

1 甲殼素的降解系統(tǒng)

1.1 自然界中甲殼素生物降解的作用

甲殼素的生物降解系統(tǒng)與許多生物的生長和生存相關。對于不含甲殼素的細菌，甲殼素的生物降解系統(tǒng)可以為其提供碳源和氮源[6]；對于以甲殼素為結構支架的生物，甲殼素降解系統(tǒng)能夠降解甲殼素為其結構組分的代謝提供原材料；對于一些含甲殼素的生物體，該系統(tǒng)還能夠幫助其抵抗很多病蟲的侵害[7]。

1.2 細菌降解甲殼素的主要步驟

自然界中的甲殼素主要是由細菌降解的。細菌降解甲殼素主要包括三個步驟：分解結晶的甲殼素，將甲殼素鏈水解成二聚體，最后將二聚體水解成單體[8]。在細胞外環(huán)境中，前兩個步驟通常由裂解性多糖單氧酶（LPMO）、內作用非加工性甲殼素酶和加工性甲殼素酶三種類型的酶催化。LPMO 在CAZy（碳水化合物活性酶）數據庫中被歸類為輔助活性（AA）10 和11 家族，可以通過氧化反應切割結晶甲殼素表面的糖苷鍵，并引入氧化末端來促進其他分泌性甲殼素酶進一步降解甲殼素[9]。甲殼素酶通常會受到N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc）的誘導和調節(jié)，這是甲殼素的水解產物，或甲殼素低聚物（GlcNAc）n，其中n=2～6。Miyashita 等[10]在研究中發(fā)現，GlcNAc 可以作為鏈霉菌（Streptomyces）和擬桿菌（Paenibacillus）甲殼素酶表達的抑制物。圖1 顯示了甲殼素降解為低聚糖、殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺；而甲殼素多糖在細胞外被水解成單體或低聚合物后，產物會通過有效的攝取途徑進入細菌的周質或細胞質中，其中甲殼素低聚物會被β-N-乙酰己糖胺酶繼續(xù)水解為GlcNAc。同時在一些菌株中，磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酸轉移酶系統(tǒng)（PTS）和ATP 結合盒（ABC）轉運體分別負責GlcNAc 單體和寡聚物的攝取[11-12]。

圖1 甲殼素降解為低聚糖（COG）、殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）Fig.1 Degradation of chitin to COG,chitosan and GlcNAc

研究發(fā)現，不同甲殼素降解菌所產生的甲殼素酶的核苷酸序列具有高度保守性，例如粘質沙雷氏菌、芽孢桿菌、霍亂弧菌等產生的甲殼素酶。這種現象被稱作遺傳保護，可以解釋為單細胞中的多個基因在一個細胞中重復，同時，也有一些細菌產生的甲殼素酶的基因簇具有獨特的氨基酸序列。

2 甲殼素酶的分類與分布

2.1 甲殼素酶的分類

甲殼素酶（chitinase，EC 3.2.1.14）是一種可以將甲殼素專一水解為低分子糖的酶（圖2），主要作用于甲殼素中的β-1,4 糖苷鍵。在CAZy 數據庫中，甲殼素酶歸屬于糖苷水解酶18 家族（GH18）和19 家族（GH19）以及20家族（GH20），它們在氨基酸序列、催化結構域以及蛋白質的3D 結構等方面具有較大差異。GH18 家族的甲殼素酶分布最為廣泛，在病毒、細菌、植物和動物中都有發(fā)現。而GH19 家族的甲殼素酶主要存在于植物中，但在細菌、病毒、線蟲中也有發(fā)現。根據序列的相似性，甲殼素酶可以被分為5 類（Ⅰ～Ⅴ）。第Ⅰ類甲殼素酶的催化結構域最為保守，在N 端有一個富含半胱氨酸的結構域。第Ⅱ類與第Ⅰ類的催化結構高度相似，但在N 端缺少一個富含半胱氨酸的結構[13]。第Ⅲ類與前兩類沒有任何相似之處，第Ⅳ類甲殼素酶與第Ⅰ類相似，但由于缺失了四個催化結構域，所以比第Ⅰ類要小很多。第Ⅴ類與其他任何一類甲殼素酶都沒有相似性。其中Ⅲ類和Ⅴ類甲殼素酶屬于GH18 家族，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類屬于GH19 家族。GH18 家族甲殼素酶可以將甲殼素水解成較短的（GlcNAc）2和（GlcNAc）3片段，再經由β-N-乙酰-D-己糖胺酶進一步水解成單糖（GlcNAc）。GH18 家族還可進一步分為甲殼素酶以及非酶活性的甲殼素酶樣凝集素和甲殼素酶樣蛋白質。

圖2 甲殼素酶水解甲殼素類型Fig.2 Types of chitinase hydrolysis of chitin

按照產物和底物作用部位的不同，甲殼素酶又可被分為內切甲殼素酶和外切甲殼素酶。迄今為止，內切甲殼素酶主要來源于GH18 和GH19 兩個糖苷水解酶家族，而外切甲殼素酶主要來源于GH18 和GH20[9]。內切甲殼素酶（EC 3.2.1.14）內部任意位置開始水解甲殼素鏈，隨機生成GlcNAc 的低寡單位，如殼三糖、殼二糖和二乙酰殼二糖。外切甲殼素酶（EC 3.2.1.52）從甲殼素鏈的非還原端開始裂解甲殼素。外切甲殼素酶（EC 3.2.1.52）又被進一步分為兩類，甲殼糖苷酶和β-N-乙酰-D-己糖胺酶。甲殼糖苷酶從甲殼素鏈的非還原端催化水解甲殼素并釋放出二乙酰基殼二糖，β-N-乙酰-D-己糖胺酶則會將由內切甲殼素酶水解產生的低聚GlcNAc 切割成GlcNAc 單體[14]。

2.2 甲殼素酶的分布

甲殼素酶廣泛存在于各種病毒、昆蟲、植物和脊椎動物中，并具有各種生理功能，如形態(tài)發(fā)生、致病、寄生和防御等[15]。在昆蟲和甲殼類動物中，甲殼素酶的主要作用是在發(fā)育過程中分解舊角質層以重塑外骨骼，從而保持和支撐生物的形體大小和形狀。對于一些以甲殼素為營養(yǎng)來源（如細菌）或以含有甲殼素的物質為食物的生物（如脊椎動物），甲殼素酶的主要功能是降解甲殼素提供碳源和能量。除此之外，甲殼素酶還參與拮抗作用。對于真菌而言，甲殼素酶不僅參與提供營養(yǎng)，還在與真菌寄生相關的自溶和形態(tài)發(fā)生功能中起重要作用。由于甲殼素酶可以降解病原體的保護膜，所以對于植物而言，甲殼素酶可以保護其免受真菌感染以及病蟲危害，增強植物的抗性[16]。

在UniProt（蛋白序列）數據庫中，甲殼素酶具有3 967 個細胞生物蛋白質序列、5 個病毒來源的蛋白質序列和406 個亞基因組（https://www.uniprot.org/）。表1 對于目前已報道過的具有某些特征的微生物來源的甲殼素酶進行了總結。由表知，自然界中，細菌是甲殼素的主要降解者。大多數細菌甲殼素酶屬于GH18 家族，主要來源于粘質沙雷氏菌屬（Serratia marcescens）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）等。真菌來源的甲殼素酶同樣屬于GH18家族，子囊菌門的真菌是其主要來源。

表1 不同微生物來源的甲殼素酶Table 1 Chitinase from different microbial sources

3 甲殼素酶的生產優(yōu)化

3.1 優(yōu)化發(fā)酵條件提高甲殼素酶產量

大多數微生物甲殼素酶是誘導酶，只在甲殼素或甲殼素衍生物等底物誘導下才能合成甲殼素酶[40]。此外，微生物甲殼素酶還受一些營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響，其中營養(yǎng)因素包括碳、氮源以及一些有機鹽和無機鹽，環(huán)境因素包括溫度、pH、攪拌速度和發(fā)酵時間等。研究表明，微生物法制備甲殼素酶的最適溫度一般在28～30 ℃，最適初始pH 為5.0～9.0，底物濃度為1.5%～2.0%。國內外研究證實，不同菌株在發(fā)酵條件及抑制因素等方面存在較大的差異。

有研究人員使用“單因素法”對微生物培養(yǎng)基的成分和影響甲殼素酶生產的環(huán)境因素進行了優(yōu)化，以提高其活性和分泌量。如Gomaa 等[41]在研究中使用膠體甲殼素和酪蛋白作為碳源和氮源，在30 ℃下培養(yǎng)了5d，使蘇云金桿菌（B.thuringiensis）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）的甲殼素酶產量與活性大大提高。Alhasawi等[42]在將甲殼素粉末作為補料的培養(yǎng)基中培養(yǎng)熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），其中6 d 培養(yǎng)時間獲得的甲殼素酶產量最高。Sukalkar 等[14]通過研究發(fā)現，大孢子鏈霉菌M1（Streptomyces macrosporeus）生產甲殼素酶的最佳培養(yǎng)基組成是膠體甲殼素、KNO3、CaSO4，最佳培養(yǎng)條件為pH 6，40 ℃、72 h，此條件下甲殼素酶的產量與對照組相比提高了2.62 倍。

3.2 利用生物工程技術提高甲殼素酶產量

野生型菌株甲殼素酶產量低、活性不高，這極大地限制了甲殼素資源的高效利用。因此，現階段關于甲殼素酶的研究重點在獲得更高的產量以及提高其催化活性上。除了利用分離培養(yǎng)和環(huán)境宏基因組學方法篩選新型甲殼素酶降解菌和甲殼素酶，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化外，結合外源表達和蛋白質工程的實驗方法也對闡明特定結構或氨基酸殘基的功能、提高酶活性及產量提供了重要信息，并取得了一定進展。

3.2.1 外源表達

外源表達是提高靶蛋白產量的有效策略。其中大腸桿菌（Escherichia coli）[43]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[44]及畢赤酵母（Pichia pastoris）[45]是甲殼素酶應用最為廣泛的表達系統(tǒng)，因為它們具有生長速度快、發(fā)酵周期短、易于遺傳操作、重組蛋白分泌能力強等優(yōu)點。Mengyan 等[46]采用一系列分子生物學方法提高了甲殼素酶在枯草芽孢桿菌DAU101 中的表達，包括加入信號肽使甲殼素酶成功分泌到細胞外，進一步優(yōu)化核糖體結合位點和間隔序列，以及結合分子對接技術與定點突變技術，將甲殼素酶的表達水平和比活力分別提高至51.67、249.62 U/mg。

3.2.2 蛋白質工程

蛋白質工程主要包括定向進化、定點突變和結構域融合，是在已知甲殼素酶的基礎上進行改造和優(yōu)化的重要途徑。其中定向進化是通過對易出錯的PCR 進行隨機突變，建立突變文庫，進行高通量篩選，高效挑選出具有更高活性的突變體。Songsiriritthigul 等[47]利用該方法將地衣芽孢桿菌甲殼素酶的催化效率提高了2.7 倍。Kidibule等[45]通過定向進化的方法獲得了甲殼素酶突變體并利用枯草芽孢桿菌作為外源表達系統(tǒng)，獲得了高產胞外甲殼素酶工程菌株，其酶比活力最高提升了16.89 倍，達到（1 004.83±0.87）U/mg。

定點突變是一種提高甲殼素酶性狀的重要手段。Ni等[48]結合同源模擬、分子對接和定點突變，構建了蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）甲殼素酶突變體，使突變體酶活性提高了60%以上，并表現出抗蟲和抗真菌活性。Emruzi 等[49]通過G191V 定點突變顯著提高了粘質沙雷氏菌B4A 甲殼素酶的穩(wěn)定性，使其在50 ℃和60 ℃條件下，分別提高了約5、15 倍。

結構域融合也是一種提高甲殼素酶活性的手段。結構域融合通過增強甲殼素酶和底物的結合，從而提高其活性。Takashim 等[50]將GH18 催化域和N-末端LysM結構域進行融合，形成融合蛋白。實驗結果表明，融合蛋白的甲殼素酶水解效率明顯高于單催化結構蛋白。Neeraja等[51]將甲殼素酶催化域和CBM融合，提高了甲殼素酶對底物的親和性、酶活性和構象穩(wěn)定性。

4 甲殼素酶的應用

4.1 農業(yè)

在現代農業(yè)中，造成作物產量損失的重要因素之一是由細菌、真菌、昆蟲引起的疾病，其中真菌是植物病變的主要原因，占作物病害的70%以上。大多數植物病原菌的細胞壁主要成分是甲殼素，甲殼素酶可以通過控制真菌的孢子萌發(fā)以及菌絲體的生長來發(fā)揮其防御作用，因此被認為是控制真菌病原菌最有效的制劑之一，被廣泛用于保護農作物免受真菌感染侵害。如由蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）產生的甲殼素酶對引起馬鈴薯莖塊干腐的玫瑰鐮刀菌（Fusarium roseum）有明顯的抑制作用[52]。El-Shora 等[53]發(fā)現枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）MN548732.1 產生的甲殼素酶對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、茄絲核菌（Rhizoctonia solani）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、米根霉（Rhizopus oryzae）和里氏木霉（Trichoderma reesei）有明顯的抑制作用。

農業(yè)害蟲也是造成作物損失的重要因素，目前，化學農藥殺蟲劑被廣泛用于控制農業(yè)害蟲，然而化學農藥毒性大，大量使用會污染環(huán)境，損害人類和其他生物的健康。生物殺蟲劑具有低毒性、生物降解性高、環(huán)境友好型等優(yōu)點，其中微生物甲殼素酶是研究熱點。研究表明，甲殼素酶可以水解昆蟲幼蟲中腸圍食膜中的甲殼素成分，從而加速殺蟲劑侵染中腸上皮細胞，提高幼蟲的死亡率[54]。Suganthi 等[55]在其研究中發(fā)現，由熒光假單胞菌（P.fluorescens）MP-13 產生的甲殼素酶對茶蚊（TMB）的致死率高達100%。

4.2 醫(yī)藥

甲殼素酶可以作為制劑應用于醫(yī)藥學領域，其可以與某些物質或微生物整合并具有協同作用，表現出強大的抑菌效果。目前，許多眼科制劑就是由甲殼素酶與微生物抑制劑合成。Halder 等[56]在研究中指出，抗真菌物質與甲殼素酶整合可以有效治療多種真菌感染。Allonsius等[57]通過研究發(fā)現，甲殼素酶與乳酸菌，特別是干酪乳酸菌（Lactobacillus casei）具有明顯的協同作用，可以有效抑制白色念珠菌（Candida albicans）的生長。此外，甲殼素酶還具有抗癌作用。Xing 等[58]在研究中發(fā)現，來自灰鏈霉菌和粘質沙雷氏菌的甲殼素酶可以破壞小鼠的MCF-7 和B11-2 癌細胞。Abu-Tahon 等[59]發(fā)現，綠色木霉（Trichoderma viride）AUMC13021產生的甲殼素酶對MCF7和HCT-116 細胞具有細胞毒性，IC50值分別為20、40 μg/mL。

4.3 食品

甲殼素酶因其良好的抑制真菌作用，可以用于食品保鮮，具有可行性高、節(jié)約成本、節(jié)約時間等優(yōu)點。甲殼素酶能破壞真菌細胞壁，抑制孢子萌發(fā)，從而延緩食物變質。Le 等[60]發(fā)現鹽生弧菌（Salinivibriosp.）產生的甲殼素酶具有較高的抗真菌能力，且安全無害，可用于食品保鮮。Deng等[61]證實了來自哈茨木霉（Trichodermaharzianum）的甲殼素酶能夠有效抑制灰曲霉（Botrytis cinerea）的生長，且對人體無害，可用于食品保鮮。從這些研究中可以得出，甲殼素酶能夠作為一種有效且有前途的食品貯藏保鮮物質。

甲殼素酶和甲殼素材料還被廣泛用于生產單細胞蛋白。單細胞蛋白（SCP）是一種高價值的蛋白質來源，可代替魚肉和豆粕成為新的蛋白質來源。Tom 等[62]發(fā)現從黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分離出來的甲殼素酶可以水解甲殼素作為營養(yǎng)物質用于畢赤酵母（Pichia kydriavzevii）發(fā)酵產單細胞蛋白（45%蛋白質和8%～11%核酸）。Vyas 等[63]用產自疣狀黏菌（Myrotheciumverrucaria）的甲殼素酶處理甲殼素，并將甲殼素水解物用作釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NCIM3052 生產單細胞蛋白（SCP）的底物。

5 總結與展望

甲殼素酶是一類應用前景廣闊的生物酶，能有效用于生物防治、醫(yī)藥化工及食品加工等領域?，F階段，自然分離的甲殼素酶存在活性低、熱穩(wěn)定性差，且甲殼素酶的純化過程繁瑣、產量低，缺乏大規(guī)模工業(yè)化生產的條件。但隨著在菌種選育及產酶條件優(yōu)化等方面的進一步研究，同時隨著熱穩(wěn)定微生物甲殼素酶分子結構、催化機理和其基因水平調控機理研究的進一步深入，微生物甲殼素酶終將實現標準化的大規(guī)模生產，應用領域也將進一步擴大，并具有越來越廣闊的市場發(fā)展前景。