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(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088; 2.水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室,廣東湛江 524088; 3.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088)

甲殼素是自然界第二大豐富的天然聚合物,含量僅次于纖維素。甲殼素經(jīng)脫乙酰反應(yīng)可制備乙酰度不同的殼聚糖。因具有良好的生物相容性、吸附性和安全性,甲殼素和殼聚糖被廣泛用于傷口敷料[1]、藥物釋放[2]以及污水處理等[3]。蝦殼中的甲殼素含量一般為14%～25%,是制備甲殼素的主要原料[4]。在工業(yè)生產(chǎn)中,通常采用酸堿法去除蝦殼中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)以提取甲殼素[5]。該方法不僅對環(huán)境造成嚴(yán)重威脅,而且使甲殼素脫乙酰,導(dǎo)致分子量降低[6-7]。近年來,微生物發(fā)酵法和酶法提取甲殼素因條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點日益受到關(guān)注。但是,提取工藝耗時長、殘余蛋白質(zhì)較多等缺點限制了其工業(yè)化應(yīng)用[8]。

離子液體具有良好的溶解性能、熱穩(wěn)定性、可循環(huán)利用和可設(shè)計性等顯著優(yōu)點[9]。1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽([C2mim]Ac)對纖維素、甲殼素和淀粉等多糖具有突出的溶解能力,再生后材料中殘余的離子液體可通過水或乙醇徹底除去,因此[C2mim]Ac可作為食品材料的加工助劑[10-12]。2017年,Husson等[13]首次采用[C2mim]Ac預(yù)處理甲殼素提高其酶水解能力。目前,有關(guān)天然聚合物蝦殼與離子液體相互作用的報道十分有限。Qin等[14]以[C2mim]Ac為蝦殼溶劑制備了甲殼素膜及甲殼素纖維,為甲殼素的綠色提取工藝提供了新的研究方向。

本文以[C2mim]Ac為蝦殼溶劑,從溶解度、回收率、組分、表觀形貌和晶體結(jié)構(gòu)等方面系統(tǒng)探索了溶解時間、溶解溫度、固-液比對蝦殼在[C2mim]Ac中溶解行為的影響規(guī)律。研究可為對蝦加工下腳料的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)殼 廣東省國聯(lián)水產(chǎn)股份有限公司;[C2mim]Ac(純度>95%) 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所;其他試劑 均為分析純,上海阿拉丁試劑公司。

DF-101型集熱式磁力攪拌器 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司;DMI4000B倒置熒光顯微鏡 德國徠卡顯微系統(tǒng);鹵素快速水分測定儀 瑞士Mettle-Toledo公司;全自動凱氏定氮儀 德國Gerhardt公司;D8 X-衍射儀 德國Bruker公司;S-4800掃描電鏡儀 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦殼樣品組分的測定 將蝦殼洗凈,在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)50 ℃干燥28 h,用高速粉碎機(jī)粉碎,過120目篩,在-18 ℃下保存,備用[15]。根據(jù)文獻(xiàn)[8]分別在105和550 ℃下測定蝦殼樣品中的水分和灰分含量。采用凱氏定氮法測定總氮,粗蛋白質(zhì)的含量在總氮基礎(chǔ)上乘以系數(shù)6.25[16]。采用索氏提取法以己烷做溶劑測定脂類含量[8]。

1.2.2 蝦殼的溶解與再生 在圓底燒瓶中準(zhǔn)確稱取10 g[C2mim]Ac,在恒溫磁力攪拌器中加熱到指定溫度,按一定固-液比向其中加入蝦殼粉,在顯微鏡下觀察溶解過程,一定時間后結(jié)束反應(yīng)。向燒瓶中加入30 mL蒸餾水趁熱離心分離(8000 r/min,10 min),將沉淀洗滌多次后在45 ℃下干燥48 h,所得固體粉末即為再生后的蝦殼材料,稱重,所得質(zhì)量與初始樣品質(zhì)量之比即為蝦殼回收率。將第一次離心后的上清液冷卻至室溫,補(bǔ)充30 mL蒸餾水,在轉(zhuǎn)速為8000 r/min下離心分離沉淀物10 min,洗滌多次,45 ℃下烘干48 h、稱重。沉淀物干燥后的質(zhì)量與初始蝦殼質(zhì)量之比即為溶解率[17],再生后蝦殼中蛋白質(zhì)的去除率采用公式(1)計算:

蛋白質(zhì)去除率(%)=(原蝦殼中蛋白質(zhì)總量-再生后蝦殼中蛋白質(zhì)總量)/原蝦殼中蛋白質(zhì)總量×100

式(1)

1.2.3 單因素實驗 單因素實驗設(shè)計如下:固液比為1∶20 (w/w),溶解溫度為120 ℃,設(shè)置不同溶解時間(0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h);固液比為1∶20 w/w,溶解時間為1 h,設(shè)置不同溶解溫度(60、80、100、120和140 ℃);溶解溫度為120 ℃,溶解時間為1 h,設(shè)置不同固-液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25，w/w)。系統(tǒng)考察了不同條件處理蝦殼后,蝦殼溶解度、化學(xué)組分、晶體結(jié)構(gòu)和表觀形貌的變化。

1.2.4 蝦殼樣品表面形貌觀察 未處理的蝦殼粉末和溶解再生后的固體樣品粉末經(jīng)過噴金處理,厚度為20 nm,采用掃描電鏡(SEM)在電壓為20.0 kV下觀察樣品表觀形貌。

1.2.5 蝦殼樣品晶體結(jié)構(gòu)分析 采用X-射線衍射(XRD)測定未處理的蝦殼以及溶解再生后蝦殼的晶體結(jié)構(gòu)。測試條件為:Cu靶Kα射線,2θ范圍5～60 °。根據(jù)公式(2)計算溶解前后樣品的結(jié)晶度指數(shù)(CrI)[18]:

式(2)

其中,Iam和I110分別為2θ=16 °和2θ=20 °的衍射峰反射強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗平行測定三次,計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,Excel軟件回歸擬合實驗數(shù)據(jù),Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦殼在[C2mim]Ac中的溶解及回收

甲殼素是N-乙酰基-D-葡糖胺通過β-(1,4)甙鍵聯(lián)結(jié)的支鏈多糖,羥基、氨基、羰基使其分子內(nèi)部和分子之間存在強(qiáng)烈氫鍵作用,所以甲殼素難溶于水和普通溶劑[19]。研究證明,咪唑類離子液體具有溶解甲殼素的良好能力[20-21]。根據(jù)文獻(xiàn)[22],110 ℃下甲殼素在1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([C4mim]Cl)中的溶解度為10%。溶解前蝦殼的基本成分測定結(jié)果見表1。蝦殼中甲殼素含量為28.67%,這與文獻(xiàn)[4]報道相符。然而,蝦殼中含有的蛋白質(zhì)(42.90%)與甲殼素緊密結(jié)合,礦物質(zhì)(22.43%)附著于纖維表面,因此蝦殼在離子液體中的溶解情況更為復(fù)雜。

表1 蝦殼粉(干基)主要成分的含量Table 1 Content of main components of shrimp shells powder(dry basis)

Al-Sawalmih等[23]研究指出，美國龍蝦(Homarusamericanus)殼的結(jié)構(gòu)是多層次的。從圖1觀察到凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)殼在溶解前呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形狀和類似的多層微觀結(jié)構(gòu)。前期研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維素或淀粉在[C2mim]Ac中被加熱,顆粒體積不斷增加,發(fā)生溶脹,然后溶解[11,24]。不同的是,蝦殼粉顆粒并未溶脹,而是不斷消融和分解。

圖1 不同條件下[C2mim]Ac溶解蝦殼的顯微照片F(xiàn)ig.1 Micrographs of shrimp shells dissolving in[C2mim]Ac at different conditions注：a:未處理;b:1∶20 w/w,120 ℃,0.5h;c:1∶20 w/w,120 ℃,4 h;d:1∶20 w/w,60 ℃,1 h;e:1∶20 w/w,100 ℃,1 h; f:1∶20 w/w,140 ℃,1 h;g:1∶5 w/w,120 ℃,1 h;h:1∶15 w/w,120 ℃，1 h;i:1∶25 w/w,120 ℃,1 h。圖5同。

當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w)時,在120 ℃下加熱0.5 h后,[C2mim]Ac中出現(xiàn)許多纖細(xì)的絲狀甲殼素纖維,4 h后幾乎觀察不到形狀完整的蝦殼顆粒,而且絲狀纖維也明顯減少。文獻(xiàn)指出蝦殼在1-烯丙基-3甲基-咪唑氯鹽([Amim]Cl)中137 ℃下加熱40 min后的溶解度最大為1.57%[17]。由表2可知,120 ℃下凡納濱對蝦殼在[C2mim]Ac中的溶解度隨時間的增加而增大(0.5～1 h),1 h后溶解度為12.29%,此后隨時間的延長,溶解度急劇下降,溶解8 h后,溶解度僅為1.63%。

表2 溶解時間對蝦殼溶解度、回收率和結(jié)晶度指數(shù)的影響Table 2 Effects of dissolution time on the solubility,recovery of shrimp shells and CrI

蝦殼在[C2mim]Ac中的溶解也明顯受到溫度的影響。如圖1所示,當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w)時,蝦殼粉顆粒在60 ℃下加熱1 h后部分溶解、斷裂,產(chǎn)生出少量且細(xì)小的甲殼素纖維;在100 ℃下加熱1 h,塊狀顆粒幾乎全部斷裂分離出更多絲狀的甲殼素纖維;溫度升高到140 ℃后,反而有大量未溶解或者未分解的大粒徑塊狀蝦殼粉顆粒。由表3可知,當(dāng)溫度從60 ℃升高到140 ℃時,蝦殼在[C2mim]Ac中的溶解度呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。溫度為100 ℃時,溶解度達(dá)到15.34%,而140 ℃下的溶解度僅為2.35%。此外,隨著[C2mim]Ac含量的增加,蝦殼的溶解度不斷增大,當(dāng)固-液比達(dá)到1∶20 (w/w)后,溶解度沒有明顯的增加(表4)。在相同的處理條件下,顯微鏡下觀察到的蝦殼在[C2mim]Ac中的溶解過程基本上與實驗測定的溶解度變化趨勢一致。

表3 溶解溫度對蝦殼溶解度、回收率和結(jié)晶度指數(shù)的影響Table 3 Effects of dissolution temperature on the solubility,recovery of shrimp shells and CrI

表4 固-液比對蝦殼溶解度、回收率和結(jié)晶度指數(shù)的影響Table 4 Effects of solid-solvent ratio on the solubility, recovery of shrimp shells and CrI

周雅文等[17]研究指出,離子液體主要溶解和再生的物質(zhì)是蝦殼中的甲殼素。由表2～表4可知,再生蝦殼固體的回收率隨溶解時間的增加、溶解溫度的升高或離子液體含量的增加而下降。該結(jié)果表明,延長加熱時間、高溫或增加溶劑含量均利于蝦殼中主要成分的溶解,因此再生后固體回收率更低。尤其當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w)時,在120 ℃下溶解8 h或140 ℃下溶解1 h后,蝦殼固體回收率分別僅為42.77%和43.61%。由此推測,盡管蝦殼中的甲殼素能夠在一定條件下溶解于[C2mim]Ac,但是高溫和長時間的加熱可能會促使部分甲殼素降解為易溶于水的小分子,不僅導(dǎo)致已經(jīng)溶解的甲殼素含量減少,而且體系黏度的增加不利于甲殼素在[C2mim]Ac中的進(jìn)一步溶解。此外,蝦殼中的其他重要成分如礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)可能與[C2mim]Ac發(fā)生相互作用,從而影響甲殼素的溶解。

2.2 [C2mim]Ac溶解處理后蝦殼組分的變化

離子液體及含離子液體的多元體系具有溶解并提取蛋白質(zhì)的能力[25-26],而蝦殼中的灰分含量是影響甲殼素溶解能力的重要因素[27]。因此,根據(jù)表2～表4所列的條件處理蝦殼,對比分析了未處理和不同條件處理后蝦殼樣品的組分變化情況。如圖2～圖4所示,與蝦殼原料相比,[C2mim]Ac處理后的樣品中蛋白質(zhì)含量降低,而且隨著溶解時間的增加、溶解溫度的升高或離子液體含量的增加而下降。當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w),溶解溫度120 ℃,溶解時間8 h,再生后蝦殼樣品中蛋白質(zhì)含量僅為14.1%,此時蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到67.13%。結(jié)果表明,[C2mim]Ac能夠破壞蝦殼中甲殼素與蛋白質(zhì)的結(jié)合,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的部分溶解。同時,蛋白質(zhì)在高溫下分解產(chǎn)生小分子物質(zhì)如氨基酸等,增加體系黏度并降低[C2mim]Ac對甲殼素的溶解能力。

圖2 溶解時間對再生蝦殼成分的影響Fig.2 Effect of dissolution time on the composition of regenerated shrimp shells

圖3 溶解溫度對再生蝦殼成分的影響Fig.3 Effect of dissolution temperature on the composition of regenerated shrimp shells

圖4 固液比對再生蝦殼成分的影響Fig.4 Effect of solid-solvent ratio on the composition of regenerated shrimp shells

不僅如此,[C2mim]Ac處理后的樣品中灰分含量隨溶解條件呈現(xiàn)不同程度的降低。當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w),溶解溫度100 ℃,溶解時間1 h,再生后蝦殼樣品中灰分含量僅為12.82%,此時礦物質(zhì)脫除率達(dá)到42.84%。結(jié)果表明，[C2mim]Ac具有脫除蝦殼中礦物質(zhì)的能力,但是過高的溫度(>120 ℃)和長時間(>2 h)加熱不利于礦物質(zhì)的溶解和脫除,而固-液比的影響并不明顯。

2.3 [C2mim]Ac溶解處理后蝦殼的表觀形貌

從圖5可以看出,未處理的蝦殼具有表面光滑且致密的多層結(jié)構(gòu),而經(jīng)過[C2mim]Ac溶解處理后的蝦殼樣品多粗糙不平。對所有樣品進(jìn)行仔細(xì)觀察對比后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過[C2mim]Ac溶解處理后的蝦殼樣品大致呈現(xiàn)4種表觀形貌特征:魚鱗狀且表面多孔,如固-液比為1∶20 (w/w)在60 ℃下溶解1 h的樣品;多層結(jié)構(gòu)扭曲變形,分離產(chǎn)生單層結(jié)構(gòu),如固-液比為1∶25 (w/w)在120 ℃下溶解1 h的樣品;表面出現(xiàn)粘附的絲狀纖維,如固-液比為1∶20 (w/w)在120 ℃下溶解0.5 h的樣品;表面分布許多晶體狀顆粒,如固-液比為1∶20 (w/w)在120 ℃下溶解4 h的樣品。

圖5 [C2mim]Ac溶解處理前后蝦殼掃描電鏡圖(5000×)Fig.5 SEM of untreated shrimp shells and the samples treated by[C2mim]Ac(5000×)

Kaya等[28-29]從其他原料中提取的甲殼素也有類似的魚鱗狀、多孔或絲狀纖維結(jié)構(gòu),并指出礦物質(zhì)的去除是導(dǎo)致甲殼素材料表面形成微孔或納米孔的主要原因。據(jù)此推測,由于[C2mim]Ac溶解除去蝦殼中的部分礦物質(zhì),材料表面形成許多隨機(jī)分布的微孔。但是,高溫和長時間處理使[C2mim]Ac中雜質(zhì)增加,礦物質(zhì)脫除能力下降,溶解后的礦物質(zhì)聚集在甲殼素材料表面,從而形成粗糙的顆粒狀表面形貌。

2.4 [C2mim]Ac溶解處理后蝦殼的晶體結(jié)構(gòu)

如圖6所示,未處理蝦殼和[C2mim]Ac溶解處理后樣品在2θ=9.0 °和2θ=19.4 °處都有顯著的衍射峰,這分別是葡萄糖胺序列和N-乙酰-D-葡萄糖胺單體的特征衍射峰[30],說明所有蝦殼樣品都具有斜方晶相的微晶結(jié)構(gòu)[31-32]。然而,[C2mim]Ac處理后的樣品在2θ=19.4 °處衍射峰明顯減弱。

圖6 [C2mim]Ac溶解處理前后蝦殼XRD圖Fig.6 XRD patterns of untreated shrimp shells and the samples treated by[C2mim]Ac

根據(jù)結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)分布情況,由公式(1)計算得到未處理蝦殼的CrI為78.4%,[C2mim]Ac處理后樣品的CrI均有不同程度的下降,結(jié)果見表2～表4。固-液比為1∶20 (w/w)在80 ℃下處理1 h后回收樣品的CrI下降到58.7%。結(jié)果表明,[C2mim]Ac溶解處理破壞了蝦殼中甲殼素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),而且礦物質(zhì)的脫除利于降低蝦殼樣品的結(jié)晶度。

3 結(jié)論

本文以[C2mim]Ac為凡納濱對蝦殼溶劑,探索了溶解時間、溶解溫度、固-液比3個因素對蝦殼溶解度、回收率、組分、表觀形貌、晶體結(jié)構(gòu)等方面的影響規(guī)律。結(jié)果表明,蝦殼在[C2mim]Ac的作用下分解出細(xì)小的甲殼素纖維,在一定范圍內(nèi)升高溫度、延長溶解時間或增加離子液體含量均利于蝦殼的溶解。當(dāng)固-液比為1∶20 (w/w),100 ℃下加熱1 h后,溶解度達(dá)到15.30%。[C2mim]Ac還具有溶解蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的能力。但是,當(dāng)溫度超過120 ℃,溶解時間超過2 h不利于[C2mim]Ac對蝦殼中礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)和甲殼素的溶解。與未處理的蝦殼相比,[C2mim]Ac溶解處理后的樣品表面多孔、粗糙或扭曲變形,而且結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索從天然生物資源中采用離子液體替代傳統(tǒng)酸堿法提取甲殼素提供了理論依據(jù)。