李正昀，王 舒，張 揚，張林平，李 冬

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院；江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045)

油茶(Camelliaoleifera)是我國特有的高級油料樹種，是一種發(fā)展前景較好的經(jīng)濟植物。目前，我國油茶栽培面積達24.44萬hm2，主產(chǎn)區(qū)為湖南、江西和廣西等紅壤區(qū)，土壤有效磷缺乏和磷素積累問題較為嚴重[1]。為提高油茶產(chǎn)量，通常會施入大量的磷肥以達到增產(chǎn)的目的，但施入的磷肥僅有5%～10%在當(dāng)季被吸收利用，其余的磷被轉(zhuǎn)化為土壤中難溶性磷酸鹽[2]。因此，如何通過生物學(xué)途徑釋放土壤中無效態(tài)庫存磷，對于提高油茶土壤磷素有效性，減少磷肥使用量，減輕環(huán)境污染及維持生態(tài)系統(tǒng)的問題具有重要意義。

解磷細菌是土壤中的一類溶解磷酸化合物能力較強的細菌的總稱，可合成或分泌一些有機酸和酶類，提高土壤中有效磷含量，改變植物根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而促進植物的生長發(fā)育[3-6]。目前，解磷菌劑已在農(nóng)作物上開展了大量應(yīng)用研究[7-8]，而在木本植物上應(yīng)用，特別對根際土壤微生態(tài)環(huán)境和土壤酶活性的影響報道甚少[9-10]。為此，本試驗在3種施磷水平下，在油茶苗根際周圍接種不同解磷菌劑，研究不同解磷菌劑對油茶苗根際微生物和酶活性的影響，為解磷菌劑對土壤微生態(tài)環(huán)境的影響提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為阿耶波多桿菌(Bacillusaryabhattai)、耳假單胞桿菌(Pseudomonasauricularis)，源自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護實驗室，其液體培養(yǎng)基中的溶磷率分別為19.75%和11.88%[11-12]。供試植株為油茶贛興46的1年生嫁接苗，由江西省林業(yè)科學(xué)研究院提供。供試土壤采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園基地，采集深度為0～20 cm，紅壤土，土壤理化性質(zhì)為：pH 5.25，有機質(zhì)含量43.71 mg·kg-1、堿解氮含量94.68 mg·kg-1、有效磷含量2.80 mg·kg-1、速效鉀含量15.80 mg·kg-1。樣土風(fēng)干后過篩(1 mm)，并將紅壤∶沙土∶泥炭土以6∶3∶1(V∶V)混合滅菌后備用。

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗采用2因素完全隨機區(qū)組設(shè)計，因素1為菌劑，共設(shè)5個處理：1)耳假單胞桿菌菌劑50 mL(T1)；2)阿耶波多桿菌菌劑50 mL(T2)；3)混合菌劑 (T1∶T2=1∶1) 50 mL(T3)；4)LB培養(yǎng)液50 mL為對照(CK1)；5)無菌水50 mL為土壤對照(CK2)。因素2為施磷水平，參考胡冬南[13]等和本試驗盆栽土壤的特點，共設(shè)3種施磷處理：P1(不施磷肥，即0 g·kg-1)、P2(過磷酸鈣1 g·kg-1)、P3(過磷酸鈣2 g·kg-1)，每處理5個重復(fù)。所用磷肥含P2O512.4 %。為滿足植株對N、K營養(yǎng)的需求，每個處理均施入尿素(N 300 mg·kg-1)和硝酸鉀(K2O 200 mg·kg-1)，并與土壤混合均勻，每盆裝入3 kg土壤。2013年9月于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥園溫室大棚內(nèi)進行盆栽試驗，油茶苗正常管理。

1.3 菌劑制備及接種

將不同解磷細菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h(28℃，180 r·min-1)，測定各菌株懸浮液OD600值并調(diào)整至0.5。不同解磷細菌菌懸液按3%(v/v)分別接種至盛有300 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶(500 mL)中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至其含菌量均達到108CFU·mL-1，即為解磷細菌液體菌劑。用無菌注射器將菌劑(50 mL)分別注射至移栽成活且生長比較一致的油茶苗根際周圍，CK1每盆注射無菌水50 mL，CK2注射滅菌后的LB液體培養(yǎng)基50 mL，每個處理10個重復(fù)。

1.4 土壤微生物數(shù)量和酶活性測定

2014年4月將帶土植株取出，輕輕抖動附在根系上的土壤作為根際土壤樣品，樣品分成2份，1份帶回實驗室立即進行土壤微生物測定，另一份樣品風(fēng)干后過篩并測定土壤酶活性[14]。采用稀釋平板法測定土壤微生物數(shù)量，具體方法參照李阜棣[15]等，采用NA培養(yǎng)基分離細菌，改良高氏1號合成培養(yǎng)基分離放線菌，馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基分離真菌。采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性，采用靛酚藍比色法測定土壤脲酶活性，具體方法參考文獻[16]，每個處理3個重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行分析作圖，同時，應(yīng)用SPSS V13.0軟件進行雙因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對根際真菌數(shù)量的影響

由圖1可知，不同解磷菌劑的施入降低了油茶苗根際真菌整體代謝活性和數(shù)量，其中T1、T3減幅較多，T2減幅最小，且與CK1差異顯著(P<0.05)。試驗對照CK1和CK2之間無顯著差異(P<0.05)，表明添加LB培養(yǎng)液(滅菌)對根際真菌數(shù)量無影響。

圖1 解磷菌劑對油茶苗根際真菌數(shù)量的影響

2.2 對根際細菌數(shù)量的影響

由圖2可知，不同施磷水平下接種不同解磷菌劑均可增加油茶根際細菌數(shù)量，其中P3水平增幅最大。根際細菌數(shù)量隨著施P量的提高而逐漸增加，可能是因為解磷菌劑將難溶性磷轉(zhuǎn)化為有效磷，有效磷含量的增加提高了土壤質(zhì)量，從而增加細菌的生長和繁殖。各菌劑處理以T3增幅和數(shù)量最大，并顯著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌群較單一菌劑更能提高油茶苗根際細菌整體代謝活性和數(shù)量。試驗對照CK1和CK2間無顯著性差異(P<0.05)，表明單獨添加LB培養(yǎng)液(滅菌)對根際細菌數(shù)量無影響。

圖2 解磷菌劑對油茶苗根際細菌數(shù)量的影響

2.3 對根際放線菌數(shù)量的影響

由圖3可知，不同施磷水平下接種不同解磷菌劑對油茶根際放線菌數(shù)量的影響不同，根際放線菌的數(shù)量均有所增加，其中P3水平增幅最大，隨著施P量的提高，根際放線菌數(shù)量的增幅逐漸增加，各菌劑處理以T3增幅和數(shù)量最大，并顯著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌劑較單一菌劑更利于油茶根際放線菌數(shù)量的增加。對照CK1和CK2之間無顯著差異，表明單獨添加LB培養(yǎng)液(滅菌)對根際放線菌數(shù)量無影響。

圖3 解磷菌劑對油茶苗根際防線菌數(shù)量的影響

2.4 對根際蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶又叫轉(zhuǎn)化酶，主要參與分解土壤中高分子量蔗糖，其活性表示土壤熟化程度的大小和肥力水平的高低。由圖4可知，接種不同解磷菌劑對油茶土壤蔗糖酶活性的影響不同。在3種施磷水平下，與對照CK1相比，接種各菌劑均不同程度地提高了土壤蔗糖酶的活性，且差異顯著(P<0.05)。其中P3水平增幅最大，結(jié)果表明在低磷脅迫作用下，抑制了蔗糖酶活性的增加。各菌劑處理以T3增幅最大，并顯著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌劑較單一菌劑更利于油茶土壤蔗糖酶活性的增加，在一定程度上提高土壤肥力。試驗對照CK1和CK2間無顯著差異，表明單獨添加LB培養(yǎng)液(滅菌)對根際土壤蔗糖酶活性的增加無影響。

圖4 解磷菌劑對油茶苗根際土壤蔗糖酶活性的影響

2.5 對根際脲酶活性的影響

土壤脲酶可催化尿素水解為氨和二氧化碳，其活性高低可以反映土壤的供氮能力。由圖5可知，各菌劑對根際脲酶活性的影響不同。相對于對照CK1、CK2，在不同施磷水平下接種不同菌劑后根際土壤脲酶活性均有不同程度提高，但差異均不顯著。試驗對照CK1和CK2之間無顯著差異，表明單獨添加LB培養(yǎng)液(滅菌)對根際土壤脲酶活性的增加無影響。

圖5 解磷菌劑對油茶苗根際土壤脲酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

土壤微生物(真菌、細菌、放線菌)是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，其群落的組成和活性對土壤肥力的保持和提高具有重要意義[17-19]。本研究采用接種法研究了施入不同解磷菌劑對油茶苗根際微生物群落數(shù)量的影響，結(jié)果表明，分別接種阿耶波多桿菌、耳假單胞桿菌及其混合菌群后，根際細菌和放線菌數(shù)量較對照均有所增加，而真菌數(shù)量減少，這和余旋[9]、董卿[20]、栗麗[21]等研究結(jié)果一致。根際細菌和放線菌數(shù)量增加，有利于改善根際土壤的微生態(tài)環(huán)境，進而提高土壤肥力和促進植物根系發(fā)育及養(yǎng)分吸收[22]。土壤真菌是重要的物質(zhì)分解者，卻與許多植物土傳病害有關(guān)[23]。本研究僅對油茶苗接種解磷菌劑后一個生長時期內(nèi)根際微生物的數(shù)量變化進行分析，不同時期根際微生物數(shù)量變化及優(yōu)勢菌群的變化規(guī)律及其相關(guān)性有待于進一步研究。

土壤酶活性能夠反映土壤質(zhì)量在時間序列或各種不同條件下的變化，而解磷菌劑對根際微生物數(shù)量及酶活性的影響與施入的磷素水平密切相關(guān)。有關(guān)研究表明解磷菌劑在不施入P肥時對根際微生物數(shù)量及酶活性的影響>施入P肥[9-10]，這與本研究結(jié)果正好是相反的，說明施磷具有提高土壤酶活性的作用。植物在土壤低磷條件下，根系表面積、生物量、根毛數(shù)量和長度等均有所增加，且根系分泌物如各種有機酸的含量和酶活性有所提高，可將土壤中難溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷，更好地被植物吸收[24-25]。本試驗中土壤酶與土壤微生物之間具有密切的關(guān)系，與前人研究結(jié)果一致[26]，說明微生物生命代謝活動的增強能夠提高土壤酶活性，進而加速了土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化，為微生物創(chuàng)造良好的土壤微生態(tài)環(huán)境。

眾多研究表明，不同解磷細菌之間具有協(xié)同作用，混合接種要比其中任何一種單一接種更能促進植株生長和營養(yǎng)吸收[27-28]，這與本研究結(jié)果是一致的，主要是由于混合菌群在根際養(yǎng)分和生態(tài)位的競爭中更有優(yōu)勢，且2株高效解磷菌劑分離自油茶根際[11-12]，能在根際或根部有效定殖，從而發(fā)揮解磷功效，至于不同解磷細菌之間協(xié)同作用機制需進一步深入研究。此外，本研究主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法進行微生物培養(yǎng)和計數(shù)，存在一定局限性，因為土壤中有很多無法正常培養(yǎng)的微生物，因此，采用DGGE、RFLP或高通量測序等技術(shù)進行土壤微生物的研究是必要的，可提高試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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