陳 敏，劉方炎，李永和，史敏銳，朱正倉(cāng)

(1.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 資源昆蟲(chóng)研究所，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué) 云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；4.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224)

云南松(Pinusyunnanensis)是我國(guó)西南地區(qū)極為重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。其起源和分布中心均在云南高原，分布范圍延伸到西南季風(fēng)影響下的西藏、四川、云南、貴州和廣西等省區(qū)。云南松是云南省主要森林樹(shù)種，分布面積極廣，約占全省森林面積的70%，海拔700～3 200 m均有分布。楚雄腮扁葉蜂(Cephalciachuxiongica)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)扁葉蜂科(Pamphiliidae)腮扁葉蜂屬(Cephalcia)，是云南松和華山松(P.armandii)等松科植物的重大食葉害蟲(chóng)。楚雄腮扁葉蜂蟲(chóng)害大面積發(fā)生時(shí)，被害林針葉常被全部吃光，林分遠(yuǎn)看形似火燒。目前，其對(duì)云南省松林的危害程度僅次于松毛蟲(chóng)。在正常生理狀態(tài)下，不同種類(lèi)的植物均能主動(dòng)產(chǎn)生并釋放特定的揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)物組成了該種植物特有的氣味特征主體，從而為植食性昆蟲(chóng)的產(chǎn)卵、逃避和取食等行為提供了有價(jià)值的信息[1]。但昆蟲(chóng)取食會(huì)改變植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的成分和含量[2-3]。植物釋放的揮發(fā)物常常被有害昆蟲(chóng)用作區(qū)分植物的種類(lèi)，即寄主或非寄主植物，以及判斷已在該植物上取食的昆蟲(chóng)密度[4-5]。植物釋放揮發(fā)性物質(zhì)的組分和含量受到多種因素的影響，包括植物種類(lèi)、發(fā)育階段以及受害部位、程度和持續(xù)時(shí)間等。通常，植物在受到機(jī)械損傷后釋放的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植食性昆蟲(chóng)天敵具有引誘作用，但這種引誘作用持續(xù)時(shí)間很短，在損傷形成后很快消失。但植食性昆蟲(chóng)的取食活動(dòng)對(duì)寄主植物造成的損傷與機(jī)械損傷完全不同，它不僅能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生并釋放大量新的揮發(fā)物成分，從而增強(qiáng)對(duì)昆蟲(chóng)的引誘作用，而且釋放的新的揮發(fā)物成分持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間。目前，已有學(xué)者對(duì)不同地區(qū)健康植株或部分昆蟲(chóng)危害的云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)主要成分進(jìn)行了研究[6-8]。但有關(guān)楚雄腮扁葉蜂不同危害程度下云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)成分變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)云南省尋甸縣楚雄腮扁葉蜂危害的云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了研究報(bào)道，初步掌握了不同危害程度下，云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)主要成分及差異，為防控楚雄腮扁葉蜂危害的大面積發(fā)生提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)的提取

2016年10月在云南省尋甸縣(25°18′N(xiāo)，103°12′E；海拔1 970 m)云南松純林中，選擇受楚雄腮扁葉蜂取食為害的林地進(jìn)行取樣。云南松植株受危害程度的判定標(biāo)準(zhǔn)為：嚴(yán)重危害，即云南松植株約50%的松針枯黃，楚雄腮扁葉蜂蟲(chóng)巢數(shù)>10個(gè)；中度危害，即云南松約30%的松針枯黃，蟲(chóng)巢數(shù)5～10個(gè)；輕度危害，即云南松約10%的松針枯黃，蟲(chóng)巢數(shù)<5個(gè)；健康植株，即云南松松針正常，無(wú)枯黃現(xiàn)象，無(wú)蟲(chóng)巢。

松針揮發(fā)物質(zhì)提取采用水蒸氣蒸餾萃取法。取新鮮健康和不同危害程度的松針各100 g，剪碎后分別放到1 000 mL的蒸餾瓶中，加400 mL蒸餾水，水蒸氣蒸餾4 h。餾分用乙醚萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥24 h。從不同處理材料中分別取1 μL提取的松針油進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2 揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定

松針提取物分析測(cè)試在TRACE DSQ GC/MS聯(lián)用儀上進(jìn)行，進(jìn)樣量為1 μL。

GC條件：色譜柱為DB-17(30.0 m×250 μm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫40℃(保留3 min)，40℃·min-1升溫到130℃，2℃·min-1升溫到160℃，20℃·min-1升溫到280℃，保持3 min。汽化室溫度230℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓35.03 kPa，載氣流量1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量1 μL；分流比40∶1。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 982 V；接口溫度280℃；質(zhì)量掃描范圍10～450 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)HPMSD化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，利用色譜峰面積歸一法，測(cè)得各化學(xué)組分在揮發(fā)油中的百分含量，再經(jīng)GC-MS測(cè)定，運(yùn)用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)檢索、解析，確認(rèn)其化學(xué)成分，并在計(jì)算機(jī)檢索的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工識(shí)別和判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 松針揮發(fā)物質(zhì)總離子流

從云南松健康松針和不同危害程度松針總離子流圖可以看出，健康云南松松針和受到楚雄腮扁葉蜂不同危害程度松針揮發(fā)油的總離子流圖色譜峰存在明顯差異(圖1～圖4)。從云南松健康松針揮發(fā)油的總離子流圖中可檢測(cè)出約17個(gè)色譜峰，鑒定出16種化合物，所鑒定的成分約占揮發(fā)性物質(zhì)色譜峰面積的97.58%。從嚴(yán)重危害的松針揮發(fā)油中可檢測(cè)出約15個(gè)色譜峰，鑒定出14種化合物，所鑒定的成分約占揮發(fā)性物質(zhì)色譜峰面積的97.27%。從中度危害的松針揮發(fā)油中可檢測(cè)出約19個(gè)色譜峰，鑒定出15種化合物，所鑒定的成分約占揮發(fā)性物質(zhì)色譜峰面積的93.52%。從輕度危害的松針揮發(fā)油中可檢測(cè)出約13個(gè)色譜峰，鑒定出13種化合物，所鑒定的成分約占揮發(fā)性物質(zhì)色譜峰面積的100%。

2.2 松針揮發(fā)物質(zhì)主要成分和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)云南松松針提取物進(jìn)行分離測(cè)定，所有處理中共分離出37種化合物，結(jié)合計(jì)算機(jī)檢索技術(shù)對(duì)分離的化合物進(jìn)行鑒定，共鑒定出33種揮發(fā)物成分，有4種未知物。通過(guò)對(duì)健康云南松松針和受到楚雄腮扁葉蜂不同危害程度松針揮發(fā)性物質(zhì)成分的比較可知(表1)，受楚雄腮扁葉蜂危害誘導(dǎo)，云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量均發(fā)生了明顯變化，且危害程度不同，其揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量均存在差異。

其中，健康云南松松針中鑒定出17種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為石竹烯(28.76%)、畢澄茄烯(23.14%)、α-蒎烯(14.53%)、β-杜松烯(9.21%)；受楚雄腮扁葉蜂嚴(yán)重危害的云南松松針中共鑒定出15種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為畢澄茄烯(43.32%)、石竹烯(23.56%)、β-杜松烯(12.11%)；受到中度危害的云南松松針中共鑒定出19種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為畢澄茄烯(30.87%)、石竹烯(25.65%)、杜松烯(10.23%)；受到輕度危害的云南松松針中共鑒定出13種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為石竹烯(40.49%)、畢澄茄烯(17.01%)、α-蒎烯(14.38%)、β-杜松烯(8.02%)。

圖1 云南松健康松針GC-MS總離子流

圖2 楚雄腮扁葉蜂嚴(yán)重危害的云南松松針GC-MS總離子流

圖3 楚雄腮扁葉蜂中度危害的云南松松針GC-MS總離子流

圖4 楚雄腮扁葉蜂輕度危害的云南松松針GC-MS總離子流

健康云南松松針和受不同程度危害的松針中共有揮發(fā)性物質(zhì)成分僅有3種，表明云南松松針受楚雄腮扁葉蜂危害時(shí)，受害程度不同，產(chǎn)生和釋放的揮發(fā)性物質(zhì)也存在顯著差異。共有揮發(fā)性物質(zhì)分別是畢澄茄烯、石竹烯和α-石竹烯，其中，畢澄茄烯和石竹烯在所有松針揮發(fā)性物質(zhì)中均為主要成分，但兩者在健康松針和受不同程度危害松針中的含量存在較大差異，變化范圍分別為17.01%～43.32%和23.56%～40.49%。這種含量的差異也可以影響松針揮發(fā)物質(zhì)的性質(zhì)，對(duì)昆蟲(chóng)是否具有趨避或引誘作用，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

云南松松針在受到楚雄腮扁葉蜂危害后產(chǎn)生了大量不同于健康植株的新的揮發(fā)性物質(zhì)，同時(shí)，少量化合物與健康植株揮發(fā)物組分相同，如畢澄茄烯和石竹烯等，但其含量均發(fā)生了顯著變化。另一方面，受楚雄腮扁葉蜂危害的程度不同，云南松松針新產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類(lèi)及其含量也存在明顯差異。

植物在遭受植食性昆蟲(chóng)啃食危害后，能夠產(chǎn)生大量新的揮發(fā)性化合物組分，這些揮發(fā)物與健康植株和受機(jī)械損傷植株釋放的揮發(fā)物組分或含量明顯不同，因此，被稱(chēng)為蟲(chóng)害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物。前人已對(duì)蟲(chóng)害誘導(dǎo)不同植物揮發(fā)物組分進(jìn)行了大量研究[9-12]。不同植物種類(lèi)、不同部位、不同生育期以及不同受害程度的植株受到昆蟲(chóng)啃食后釋放的蟲(chóng)害誘導(dǎo)揮發(fā)物成分和含量均存在明顯差異，同時(shí)，昆蟲(chóng)的種類(lèi)、危害方式、程度等因素也會(huì)對(duì)揮發(fā)物成分和含量產(chǎn)生影響。例如，不同地區(qū)的馬尾松(P.massioniana)松針揮發(fā)物含量與松毛蟲(chóng)(Dendrolimuspunctatus)暴發(fā)情況之間存在明顯相關(guān)性，常災(zāi)區(qū)、偶災(zāi)區(qū)和無(wú)災(zāi)區(qū)受松毛蟲(chóng)危害的馬尾松松針揮發(fā)性物質(zhì)組成比例差異很大[12]。大菜粉蝶(Pierisbrassicae)等咀嚼式昆蟲(chóng)與麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphumavenae)、麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)等刺吸式昆蟲(chóng)危害植物后產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物組分存在明顯不同[13]。另一方面，植物遭受昆蟲(chóng)危害后，揮發(fā)性物質(zhì)組分含量發(fā)生了明顯變化。例如，馬尾松松針在受到松毛蟲(chóng)危害后，揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量除水芹烯降低外，其余均在1 h內(nèi)出現(xiàn)明顯升高[14]。濕地松松葉受到蟲(chóng)害后，揮發(fā)性物質(zhì)氨茴酸-3，5-二甲基-3-乙烯基-4-己烯酯和大香葉烯D的含量均發(fā)生了顯著變化[14]。而甘藍(lán)(Brassicaoleracea)在遭遇大菜粉蝶(Pierisbrassicae)啃食后，可誘發(fā)植株釋放大量揮發(fā)性化合物，但釋放的揮發(fā)物成分與健康植株基本相同，并沒(méi)有產(chǎn)生新的揮發(fā)性物質(zhì)，只是釋放揮發(fā)物的量更大，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)[14-15]。部分植物受到蟲(chóng)害后也會(huì)產(chǎn)生大量新的揮發(fā)性物質(zhì)。例如，棗樹(shù)葉片在受到棗鐮翅小卷蛾(Ancylissativa)啃食后，葉片的揮發(fā)性物質(zhì)組分和含量均會(huì)出現(xiàn)明顯增加，并能產(chǎn)生特異性揮發(fā)物乙酸-4-己烯醇酯，從而使鄰近棗樹(shù)識(shí)別空中傳遞的蟲(chóng)害信號(hào)，提高棗樹(shù)的自身防御水平[17]。同時(shí)，蠶豆(Viciafaba)葉片受到昆蟲(chóng)啃食后，釋放的揮發(fā)性物質(zhì)與健康植株也完全不同[18]。本研究中，云南松松針在受到楚雄腮扁葉蜂危害后產(chǎn)生了大量不同于健康植株的新的揮發(fā)性物質(zhì)，同時(shí)，少量化合物與健康植株揮發(fā)物組分相同，如畢澄茄烯和石竹烯等，但其含量均發(fā)生了顯著變化。另一方面，受楚雄腮扁葉蜂危害的程度不同，新產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物種類(lèi)和含量也存在明顯差異。有研究表明，植物在受蟲(chóng)害后在揮發(fā)物成分上表現(xiàn)出來(lái)的質(zhì)和量的差異是植物與天敵長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果[18]。植物遭受蟲(chóng)害后所產(chǎn)生的揮發(fā)物在質(zhì)和量上的差異能給同類(lèi)或天敵以準(zhǔn)確且清晰的信號(hào)。

表1 不同危害程度云南松松針揮發(fā)性物質(zhì)成分比較

注：NA表示未查到登錄號(hào)。

與健康植株相比，受蟲(chóng)害植株釋放出了新的揮發(fā)物，或者釋放某種揮發(fā)物的量較大。植食性昆蟲(chóng)對(duì)植物的這些變化較為敏感，在較遠(yuǎn)的距離就能探測(cè)到這種信息。但這種信息對(duì)植食性昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)具有很大的不確定性，很難預(yù)測(cè)這種信息將吸引還是排斥植食性昆蟲(chóng)[19]。研究表明，蟲(chóng)害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物可以引誘植食性昆蟲(chóng)的天敵[20-22]。同時(shí)，植食性昆蟲(chóng)也可以利用這種揮發(fā)物尋找適宜的寄主，如蟲(chóng)害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物可以吸引金龜子和葉甲的幼蟲(chóng)[23-24]。本研究表明，云南松松針在受到楚雄腮扁葉蜂危害后，產(chǎn)生和釋放的揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量存在顯著差異，且松針受害程度不同，產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物也不同。松針在受到楚雄腮扁葉蜂危害所產(chǎn)生和釋放的揮發(fā)性化合物成分和含量的變化可能也會(huì)對(duì)植食性昆蟲(chóng)取食行為產(chǎn)生一定影響。目前，松針受危害后對(duì)楚雄腮扁葉蜂或其他昆蟲(chóng)具有趨避或引誘作用，仍有待進(jìn)一步研究。

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