張文茂+彭贊平+鄔洪梁

[摘要] 目的 探討FOXP2基因的2個單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點rs121908377、rs121908378與高功能孤獨癥兒童之間的相關(guān)性。 方法 方便選取2016年1月—2017年1月在該院兒童保健科確診的100例高功能孤獨癥兒童（病例組）及同期在兒童保健科體檢中心體檢的120名身體及精神均健康兒童（對照組），應(yīng)用基因芯片及PCR-測序方法對病例組及對照組的rs121908377、rs121908378 位點進行基因分型，對所獲分型數(shù)據(jù)進行病例對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 從病例組中隨機選取的高功能孤獨癥兒童的基因芯片結(jié)果為陰性，病例組FOXP2基因的2個SNPs 的基因型頻率為0.960、0.970，對照組的2個SNPs基因頻率為0.958、0.958，分布均未偏離哈德溫伯格平衡（P>0.05）；FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點的基因型頻率在病例與對照間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結(jié)論 FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點的單核苷酸多態(tài)性與高功能兒童孤獨癥不相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 高功能孤獨癥；FOXP2基因；PCR-測序法；病例對照研究

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）10（b）-0001-03

[Abstract] Objective This paper tries to explore the correlation between the rs121908377， rs121908378 SNPs of the FOXP2 gene and the high functioning autism. Methods From January 2016 to January 2017， 100 children with high functioning autism （the case group） and 120 normal children both physically and mentally healthy in the same period （the control group） were convenient selected from this hospital. The rs121908377， rs121908378 SNPs of FOXP2 was genotyped by PCR-Sequencing in individuals with high functioning autism and normal subjects. A correlation study was performed by using the data of genotyping. Results The results of the gene chip of the highly functional autistic children randomly selected from the case group were negative， the frequencies of two SNPs in the genotypes were 0.960 and 0.970 in the case group， 0.958 and 0.958 in the control group， all were in Hardy-Weinberg equilibrium （HWE） （P>0.05）. There were no significant differences in allele frequency of the FOXP2 gene of rs121908377， rs121908378 between the high functioning autisms group and normal control group （P>0.05）. Conclusion The SNPs of rs121908377， rs121908378 of FOXP2 gene were not associated with high functioning autism.

[Key words] High function autism； FOXP2 gene； Polymerase chain reaction-Sequencing； Case-control study

孤獨癥（autism），又稱自閉癥，是PDD （Pervasive developmental disorder，廣泛性發(fā)育障礙）的代表性疾病，三大特征為刻板行為、語言障礙及社交障礙[1]。ASD一般3歲前發(fā)病并攜帶終生，男性發(fā)病率為女性的4～6倍，我國的兒童孤獨癥患者約為500萬，已經(jīng)成為危害極其嚴重的公共健康問題，其中大部分無法被完全治愈，引起社會廣泛關(guān)注[2]。據(jù)家系調(diào)查及孿生子研究，孤獨癥病因遺傳因素占90%，環(huán)境因素占10%[3]。目前國際上對于孤獨癥的遺傳學研究雖然已經(jīng)取得了很大進展，鑒定了超過100多個易感基因，但由于孤獨癥高度的表型和遺傳異質(zhì)性，這些位點或基因很少能夠被重復驗證，所有已發(fā)現(xiàn)的遺傳變異還只能解釋大約10%～20%的ASD患者，總體而言，關(guān)于孤獨癥的分子致病機制研究還處于早期階段，而且多數(shù)研究以ASD（Autism spectrum disorder，孤獨癥譜系障礙）而不是典型的孤獨癥患者為研究對象，進一步導致了研究樣本的不同質(zhì)性?；诖耍瑢τ诠陋毎Y進行臨床分型研究是很有必要的一件事情。高功能孤獨癥是孤獨癥中總智商（full intelligence quotient， FIQ）≥70的一類特殊人群，占整個孤獨癥的30%左右[4]，選取高功能孤獨癥兒童進行研究可以最大限度減少智力相關(guān)因素的影響。FOXP2基因位于染色體7q31，與人的語言表達能力相關(guān)[5]。最近一項研究探討發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子FOXP2與CNTNAP2基因的表達調(diào)控相關(guān)，F(xiàn)OXP2轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到CNTNAP2基因內(nèi)含子1的調(diào)控序列上來直接調(diào)控CNTNAP2基因的表達，使得CNTNAP2基因表達量大量下調(diào)，進而引發(fā)孤獨癥[6]。該文方便選取2016年1月—2017年1月在該院兒童保健科確診的100例高功能孤獨癥兒童（病例組）及同期在兒童保健科體檢中心體檢的120名身體及精神均健康兒童（對照組），首次對FOXP2基因及高功能孤獨癥的關(guān)系進行了病例對照研究，為孤獨癥臨床分型研究提供參考，現(xiàn)報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例組高功能孤獨癥兒童樣本方便選取于該院兒童保健科，并由1 名獲得兒童精神衛(wèi)生專業(yè)資格證的主任醫(yī)師，按DSM-IV 標準以及國際疾病分類第十版與孤獨癥相關(guān)的診斷標準進行診斷，且其FIQ≥70， 共100例，其中男82例，女18例，平均年齡（7.29±1.92）歲，患者均為漢族兒童，與孤獨癥類似的脆性X 染色體綜合征、Asperger綜合征、不典型孤獨癥等疾病均被排除，患兒民族均為漢族。對照組樣本共120名，其中男94名，女26名，平均年齡（8.17±2.23）歲，均為漢族兒童，采集于該院兒童保健科體檢中心，均為身體及精神健康兒童。該研究均征得所有被研究兒童監(jiān)護人的知情同意，并且與被研究兒童監(jiān)護人簽署知情同意書。兩組兒童在年齡、疾病組成方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取被試兒童2 mL靜脈血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的人全血DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取DNA，-80℃保存待測。

1.2.2 基因芯片 隨機選取其中1例高孤獨癥兒童的DNA送“北京貝康醫(yī)學檢驗所”進行基因芯片分析。

1.2.3 生物信息學 采用SNPbrowser程序和NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫選擇FOXP2基因的2個SNP位點rs121908377、rs121908378，并采用聚合酶鏈反應(yīng)和基因測序的方法對各位點進行基因分型。

1.2.4 PCR及測序（分型檢測） 采用聚合酶鏈反應(yīng)擴增FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點序列，使用的引物見表1，PCR產(chǎn)物純化后送英駿公司測序。PCR條件：采用表一所列的正向及反向引物、50μL反應(yīng)體系以及下列所述條件對兩段目的片段進行擴增。50 μL反應(yīng)體系中含25 μL酶混合液（1.25 U Takara Taq DNA聚合酶，0.4 mM dNTP，3 mM Mg2+），0.5 μmol/L的引物和100 ng基因組DNA，補加純水至50 μL。rs121908377和rs121908378的PCR反應(yīng)條件：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個循壞，產(chǎn)物純化后-20℃保存。

1.3 統(tǒng)計方法

采用haploview 4.1分析軟件對FOXP2基因的rs121908377、rs121908378兩個SNPs位點的基因分型數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片

基因芯片結(jié)果為陰性，沒有發(fā)現(xiàn)任何SNPs位點及CNV（copy number varients，拷貝數(shù)變異）。

2.2 哈德溫伯格遺傳平衡檢驗

對高功能孤獨癥病例組和對照組的FOXP2基因的2個病源相關(guān)的SNP位點rs121908377、rs121908378的基因分型結(jié)果運用haploview 4.1軟件進行哈德溫伯格遺傳平衡檢驗，病例組FOXP2基因的2個SNPs 的基因型頻率為0.960、0.970，對照組的2個SNPs基因頻率為0.958、0.958，哈德溫伯格值均為1.0，顯示這兩個位點的基因型頻率分布遵守哈德溫伯格平衡（P>0.05）。

2.3 FOXP2基因的連鎖不平衡檢驗

基因FOXP2的2個SNPs配對的D'和r2值見下表2。在病例及對照中，rs121908377和rs121908378兩個位點之間的連鎖不平衡程度都很低，這與兩個位點在染色體上相距較遠相關(guān)。

2.4 FOXP2基因2個SNPs 的關(guān)聯(lián)分析

高功能孤獨癥兒童的病例及對照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示兩個SNPs位點等位基因在病例及對照間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

高功能孤獨癥是孤獨癥中的一種臨床分型，高功能孤獨癥兒童智力水平低于正常兒童，往往伴隨有特殊功能，存在語言感知功能障礙[7]?；蛐酒茄芯績和蚤]癥最常見的方法[8]，該研究首先是運用基因芯片的方法對隨機選取的1例高功能孤獨癥兒童進行基因分析，結(jié)果顯示沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點及CNVs，進一步說明了孤獨癥的高度異質(zhì)性。

基因FOXP2可能在語言發(fā)育障礙或孤獨癥發(fā)病機制中發(fā)揮某種主要作用[9-10]，其作用機制與調(diào)控相關(guān)[11]?；诖耍撐倪M行了FOXP2基因和高功能孤獨癥的病例對照研究。該研究結(jié)果顯示FOXP2基因的rs121908377、 rs121908378兩個 SNPs 位點的等位基因頻率在高功能孤獨癥兒童病例及對照間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），當前的研究結(jié)果并不支持FOXP2基因與高功能孤獨癥的致病相關(guān)。雖然該研究結(jié)果如此，但是這不能成為FOXP2基因與高功能孤獨癥無關(guān)的證據(jù)，也有可能是因為該研究中收集的病例及對照數(shù)量不夠多，無法檢測到微效基因效應(yīng)。事實上，導致多基因疾病的原因較多，對其進行關(guān)聯(lián)研究普遍存在重復性差的問題。

綜上所述，該文的病例對照研究結(jié)果不支持FOXP2基因與高功能孤獨癥的致病相關(guān)。盡管該研究結(jié)果不支持FOXP2基因與高功能孤獨癥的致病相關(guān)，但由于該研究所收集的樣本量有局限性，而且只基于病例對照法進行研究，因此更大樣本量、更多位點以及基于家系研究方法進行重復驗證是有必要的。

[參考文獻]

[1] 張玉，劉蕓，黃浩宇.孤獨癥病因?qū)W的研究進展[J].中國全科醫(yī)學，2017，20（11）： 1392-1397.

[2] 郭輝， 胡正茂， 夏昆. 孤獨癥的遺傳病因?qū)W研究進展及基因型-表型關(guān)聯(lián)研究計劃[J].生命科學，2014，26（6）：571-582.endprint

[3] Lyall K， Croen L， Daniels J， et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders[J]. Annual review of public health， 2017， 38： 81-102.

[4] 周萍. 高功能孤獨癥兒童的智力特征分析[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2017， 11（5）： 188-189.

[5] Newbury DF， Bonora E， Lamb JA， et al. FOXP2 is not a major susceptibility gene for autism or specific language impairment[J].The American Journal of Human Genetics， 2002， 70（5）： 1318-1327.

[6] Vernes S.CA functional genetic link between distinct developmental language disorders[J].N Engl J Med，2008，359（22）： 2337-2345.

[7] 楊峰， 周家秀， 肖秀云.高功能孤獨癥兒童漢語普通話語言感知能力障礙的初步研究[J].中國兒童保健雜志， 2015， 23（12）： 1287-1289.

[8] 楊友，金志娟，王劍，等.兒童孤獨癥譜系障礙 DLGAP1 基因多態(tài)性研究[J].中國實用兒科雜志，2016，31（10）：761-764.

[9] 胡純純， 徐秀. 孤獨癥譜系障礙動物模型的研究進展[J]. 中國循證兒科雜志， 2015， 10（6）： 463-469.

[10] Chien YL，Wu YY，Chen HI，et al. The central nervous system patterning gene variants associated with clinical symptom severity of autism spectrum disorders[J]. Journal of the Formosan Medical Association，2017，116（10）：755-764.

[11] 劉朝陽，高繪菊，牟志美，等.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Fox 的功能及分子機制研究進展[J]. 昆蟲學報，2013，56（3）：312-322.

（收稿日期：2017-07-15）endprint