丁 爍 趙 磊 Rojina Shilpakar 魏云巍

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤腔鏡外科，哈爾濱 150001)

近年來，嵌合抗原受體(CAR)修飾T 細(xì)胞在治療腫瘤中取得了很大進(jìn)展。CART細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cell,CART)將能識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associate antigen，TAA)的單鏈抗體和能促進(jìn)T 細(xì)胞活化的信號傳遞結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)于自體T 細(xì)胞的表面，從而賦予該T 細(xì)胞以腫瘤靶向的殺傷活性和持久擴(kuò)增的能力，抗體與相應(yīng)的腫瘤抗原結(jié)合后能使T 細(xì)胞活化，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。不同于生理性的TCR，重組CARs 與抗原的結(jié)合不需要依賴于MHC的遞呈，有效避免了腫瘤細(xì)胞MHC 表達(dá)下調(diào)這一免疫逃逸機(jī)制;同時，CARs 不僅能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，還能識別糖類、神經(jīng)節(jié)苷脂、蛋白多糖、高度糖基化的蛋白，更加廣譜殺傷腫瘤細(xì)胞。CART 在血液腫瘤治療中獲得了突破，但由于受實(shí)體瘤中微環(huán)境復(fù)雜、免疫逃逸機(jī)制多樣、腫瘤抗原靶點(diǎn)繁雜、且實(shí)體瘤體積大、CART細(xì)胞難以歸巢到腫瘤組織等多方面因素的影響，CART 在實(shí)體瘤的治療實(shí)踐中仍有部分障礙。本文針對CART實(shí)體瘤治療存在的問題及目前研究的現(xiàn)狀綜述如下。

1 腫瘤微環(huán)境

實(shí)體腫瘤的微環(huán)境對其增殖、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等生物學(xué)行為具有重要的推動作用。實(shí)體腫瘤與血液腫瘤不同，其微環(huán)境中存在大量的纖維基質(zhì)和免疫抑制細(xì)胞，同時通過物理屏障和免疫屏障保護(hù)腫瘤組織、抵抗免疫細(xì)胞的攻擊[1]。因此，針對實(shí)體腫瘤微環(huán)境的CART治療方式有望起到一定的效果。

1.1物理屏障 惡性腫瘤微環(huán)境中的物理屏障由其周圍基質(zhì)組成，其中包括大量的纖維結(jié)締組織等[2]。這些基質(zhì)成分不僅通過物理方式阻止免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞接觸，而且通過與微環(huán)境的其他物質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的相互作用影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等[3]。如在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中透明質(zhì)酸(Hyaluronan)含量明顯增多，并且其與胰腺癌的病理類型和生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-6]。腫瘤細(xì)胞的物理屏障同樣阻止了CART細(xì)胞的浸潤，針對這種情況Moon等[7]和Wang等[8]都分別研發(fā)了靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)的CART細(xì)胞，使腫瘤周圍纖維結(jié)締組織形成減少，從而增加淋巴細(xì)胞的浸潤。

1.2免疫屏障 有些實(shí)體腫瘤組織中TIL的數(shù)量并不少，但對腫瘤殺傷作用仍不明顯，其中TME的免疫屏障起到重要作用[9]。免疫屏障主要是對TIL起免疫抑制作用，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、骨髓抑制細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞本身及其分泌的因子均參與了對T細(xì)胞的免疫抑制作用。CART細(xì)胞與腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)相似，在腫瘤微環(huán)境中同樣接受復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。①免疫檢查點(diǎn)(Checkpoint)：免疫檢查點(diǎn)其實(shí)是腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)的抑制信號。當(dāng)T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞接觸時，腫瘤細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)受體通過與T細(xì)胞上的配體相結(jié)合，抑制T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。目前發(fā)現(xiàn)的免疫檢查點(diǎn)很多，如程序性細(xì)胞死亡蛋白/受體1(Programmed cell death protein 1,PD-1/PDL-1)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4)、淋巴細(xì)胞活化基因3蛋白(Lymphocyte activation gene 3 protein,LAG3)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3,TIM3)等[10]。其中CTLA4和PD-1/PDL-1是目前研究最多也最具有代表性的靶點(diǎn)。CTLA-4位于細(xì)胞膜，當(dāng)其上調(diào)時可抑制CD28和B7的共刺激激活信號并使T細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、阻止其增殖[11-14]。PD-1則通過與PDL-1結(jié)合抑制T細(xì)胞激酶信號的激活，阻止T細(xì)胞活化[15]。針對免疫檢查點(diǎn)抑制，CART治療目前采用兩種改進(jìn)策略：一種為CART與免疫檢查點(diǎn)抑制劑如Nivolumab和Pembrolizumab等聯(lián)合用藥[16]；另一種為制備靶向免疫檢查點(diǎn)的CART細(xì)胞[17]。兩種方式均取得了良好的效果，但仍有待大量研究加以證實(shí)。②免疫抑制細(xì)胞：實(shí)體腫瘤微環(huán)境中包含了大量免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T-cells,Tregs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)、骨髓源性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)等。這些免疫抑制細(xì)胞及其分泌的抑制性因子如IL-10、IL-4等通過調(diào)控復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)抑制CART細(xì)胞激活或增加微環(huán)境纖維基質(zhì)含量，阻止其與腫瘤細(xì)胞接觸以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷[18]。③腫瘤細(xì)胞本身因素：實(shí)體瘤占惡性腫瘤的絕大多數(shù)且種類繁多，各種惡性腫瘤組織來源不同、內(nèi)部結(jié)構(gòu)不一、各部分細(xì)胞分化程度各異，加之患者間的個體差異，使得CART靶向治療可能僅對腫瘤的部分細(xì)胞有效，有時甚至?xí)黾幽[瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[19,20]。

2 CART細(xì)胞靶點(diǎn)的選擇

腫瘤表面的抗原可分為相關(guān)性抗原(TAA)和特異性抗原(TSA)兩類。在實(shí)體瘤治療研究的早期，CART細(xì)胞多針對實(shí)體腫瘤的TAA而非TSA，容易產(chǎn)生“脫靶效應(yīng)”，導(dǎo)致正常組織的損傷[21]。為使CART細(xì)胞更具安全性，研究中多從以下三個方面對CART細(xì)胞加以改進(jìn)：①在CART細(xì)胞中加入“自殺基因”，如HSV-tk、Caspase9等。這些“自殺基因”可根據(jù)需要(如患者CRS反應(yīng)劇烈時)中止CART細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，表達(dá)HSV-tk的CART細(xì)胞可以在更昔洛韋的刺激下發(fā)生凋亡[22]；表達(dá)Caspase9的CART細(xì)胞也同樣可以在小分子藥物A1903的作用下發(fā)生凋亡[23]。但實(shí)際中“自殺基因”并不是對所有CART細(xì)胞均有效，且有些轉(zhuǎn)染的“自殺基因”如HSV-tk會自身激活造成CART細(xì)胞的無辜消耗并影響其殺傷效果[22]。近年來，CD20和EGFR也被嘗試用于CART細(xì)胞的“自殺基因”[24,25]，可分別經(jīng)利妥昔單抗和西妥昔單抗刺激后導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但其功效仍有待進(jìn)一步確認(rèn)。②選擇腫瘤特異性更強(qiáng)的靶點(diǎn)。理論上選擇特異性腫瘤靶點(diǎn)是解決“脫靶效應(yīng)”的最好方式。然而，CART細(xì)胞只能識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原靶點(diǎn)，因此尋找僅在腫瘤細(xì)胞膜上特異性表達(dá)的靶點(diǎn)并非易事。表皮生長因子變異受體(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ)和多態(tài)性上皮黏蛋白1(Mucin 1,MUC1)是實(shí)體瘤CART治療中研究最多的特異性抗原。人源化的EGFRvⅢ抗體主要用于腦膠質(zhì)瘤的治療，前期研究顯示靶向EGFRvⅢ的CART細(xì)胞和NK細(xì)胞均對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷作用明顯同時不損傷正常組織[26,27]。MUC1是一種高糖基化、高分子量的膜蛋白，靶向MUC1的CART細(xì)胞也被認(rèn)為是一種可行的抗腫瘤方式[28]。Posey等[29]近期研究也表明，靶向Tn-MUC1的CART細(xì)胞可在體內(nèi)外殺傷白血病和胰腺癌細(xì)胞。然而，TSA的臨床試驗(yàn)未見大宗病例報(bào)道，其有效性和安全性仍待臨床試驗(yàn)評估。③制備非永久表達(dá)CART細(xì)胞。通常情況下編碼CAR的基因通過病毒轉(zhuǎn)染至T細(xì)胞DNA中，使其能夠永久性表達(dá)。但考慮到目前可用的實(shí)體瘤靶點(diǎn)多為TAA，CART細(xì)胞永久表達(dá)可能對擁有相同TAA的正常組織造成損傷。間皮素是腫瘤細(xì)胞的TAA，其在正常組織中也有少量表達(dá)[30]。Beatty等[31]將表達(dá)間皮素CAR的mRNA序列轉(zhuǎn)染至患者T細(xì)胞中，在治療中他們發(fā)現(xiàn)，這種CART細(xì)胞僅在人體內(nèi)存在1～2個月，在此期間胰腺癌患者腹腔轉(zhuǎn)移灶明顯好轉(zhuǎn)而且未對其他臟器造成損害。④增加CAR對腫瘤細(xì)胞的識別能力。腫瘤細(xì)胞本身具備多種抗原可供識別，但傳統(tǒng)CART細(xì)胞一般只能識別一種抗原，一旦其所識別的抗原為TAA就可能產(chǎn)生“脫靶效應(yīng)”。Roybal等[32]設(shè)計(jì)了一種識別雙抗原的CART細(xì)胞，首先CART細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞A抗原并激活細(xì)胞內(nèi)CAR編碼序列表達(dá)，CAR表達(dá)后其表面的單鏈抗體再識別腫瘤細(xì)胞的B抗原，從而激活CART細(xì)胞并殺傷腫瘤細(xì)胞。這些靶向雙抗原的CART細(xì)胞可以殺傷表達(dá)雙抗原的腫瘤細(xì)胞，使殺傷更為精準(zhǔn)，同時避免了“脫靶效應(yīng)”的發(fā)生[33]。Cao等[34]還設(shè)計(jì)了一種雙結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換器一端連接CART細(xì)胞表面的單鏈抗體、另一端連接腫瘤細(xì)胞表面的抗原。通過使不同轉(zhuǎn)換器與不同抗原結(jié)合，達(dá)到利用單一CART細(xì)胞治療多種腫瘤和識別腫瘤細(xì)胞多個靶點(diǎn)的目的，從而使CART治療更為精準(zhǔn)、可控。

3 T細(xì)胞代謝變化

實(shí)體腫瘤周圍往往伴隨血管畸形和纖維結(jié)締組織增生，形成低氧、酸性、缺乏必需氨基酸(精氨酸、色氨酸等)的微環(huán)境。在這種環(huán)境下，浸潤T細(xì)胞存活困難、激活障礙，較難達(dá)到理想的腫瘤殺傷效果[7]。精氨酸和色氨酸是T細(xì)胞激活所需要的重要物質(zhì)，精氨酸酶和吲哚胺2,3二氧化酶(Indoleamine 2,3 Dioxygenase,IDO)可分別分解精氨酸和色氨酸，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活狀態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞和骨髓細(xì)胞均會分泌上述兩種酶，通過減少精氨酸和色氨酸的含量，阻礙T細(xì)胞的增殖和持續(xù)激活[35,36]。Mussai等[37]研究表明，神經(jīng)母細(xì)胞瘤可通過過表達(dá)精氨酸酶Ⅱ抑制靶向GD2的CART細(xì)胞在微環(huán)境內(nèi)的增殖。Ninomiya等[38]也證實(shí)，抑制IDO活性后，CART細(xì)胞增殖和殺傷能力均增強(qiáng)、分泌細(xì)胞因子增加。然而，此類研究仍較少，可能會成為今后實(shí)體瘤治療研究的方向之一。

綜上所述，實(shí)體腫瘤中存在物理屏障、免疫屏障等諸多因素影響CART細(xì)胞的治療效果。雖然CART細(xì)胞實(shí)體瘤的臨床前實(shí)驗(yàn)取得了進(jìn)展，但無論是尋找不同腫瘤的適宜靶點(diǎn)、突破腫瘤微環(huán)境的抑制作用，還是增強(qiáng)CART細(xì)胞本身的殺傷效率和持續(xù)時間，都需要進(jìn)一步的臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)去突破和證實(shí)。

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