高帆 李克雷 吳星 徐苗 梁爭(zhēng)論

102629北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院生物制品檢定所（高帆、李克雷、吳星、徐苗、梁爭(zhēng)論），北京民海生物科技有限公司（李克雷）

疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產(chǎn)物作為免疫原，能夠誘導(dǎo)特定的主動(dòng)保護(hù)性免疫，用于預(yù)防、治療人類(lèi)相應(yīng)疾病的生物制品。疫苗穩(wěn)定性是疫苗在效期內(nèi)保持理化、微生物和生物學(xué)特性的能力。為保證疫苗質(zhì)量，需對(duì)疫苗生產(chǎn)中間產(chǎn)物、原液、成品及運(yùn)輸、儲(chǔ)存直至效期末的全疫苗生命周期進(jìn)行穩(wěn)定性研究。疫苗的效力隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)及儲(chǔ)存條件的變化而逐漸下降。根據(jù)疫苗組成成分的生物活性及理化性質(zhì)的不同，疫苗的穩(wěn)定性特點(diǎn)也存在很大差異。疫苗效力在不同儲(chǔ)存條件下的下降曲線(xiàn)是制訂疫苗效期、確定疫苗儲(chǔ)運(yùn)條件的主要依據(jù)。根據(jù)對(duì)熱和凍結(jié)穩(wěn)定性的差異，疫苗可分為熱敏感性疫苗和凍結(jié)敏感性疫苗。前者主要包括減毒活疫苗，如口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV），凍干乙型腦炎減毒活疫苗等；后者主要為含鋁佐劑滅活及重組病毒樣顆粒（VLP）疫苗，如甲肝滅活疫苗和重組乙肝疫苗等。因此設(shè)計(jì)完善的穩(wěn)定性研究方案，在研發(fā)階段、臨床試驗(yàn)階段以及上市后有效評(píng)價(jià)疫苗的穩(wěn)定性，是全面了解研究疫苗特性，完成上市審批以及保證上市后疫苗安全有效的基礎(chǔ)。

世界衛(wèi)生組織（WHO）于1989年首次頒布“疫苗穩(wěn)定性” 文件（WHO／EPI／GEN／89.08）［1］，并在1998 年進(jìn)行了修訂（WHO／GPV／98.07）［2］，2006 年頒布了“疫苗溫度敏感性”文件［3］，明確指出需關(guān)注凍結(jié)對(duì)疫苗質(zhì)量的影響。在同年頒布的《疫苗穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》［4］中提出需按照不同疫苗的特點(diǎn)設(shè)計(jì)穩(wěn)定性研究參數(shù)；在疫苗研發(fā)、臨床試驗(yàn)、上市后監(jiān)測(cè)等不同階段均需進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)；提出應(yīng)重視穩(wěn)定性研究設(shè)計(jì)、選擇適當(dāng)統(tǒng)計(jì)方法并進(jìn)行合理的數(shù)據(jù)分析。為推動(dòng)疫苗在冷鏈難以推廣國(guó)家和地區(qū)的應(yīng)用，2012年WHO頒布了疫苗溫度控制鏈（CTC）指南［5］。2013年為評(píng)估擴(kuò)大計(jì)劃免疫疫苗穩(wěn)定性，并考慮符合批準(zhǔn)儲(chǔ)存條件的可行性，WHO頒布了擴(kuò)展控制溫度條件（ECTC）指導(dǎo)原則，為脫冷鏈狀態(tài)下疫苗的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)提供了指南［6］。

中國(guó)藥典（2015版）三部新增的人用疫苗總論中，首次對(duì)疫苗穩(wěn)定性評(píng)價(jià)進(jìn)行了規(guī)定，并對(duì)疫苗貯運(yùn)提出了要求［7］。國(guó)家藥品審評(píng)中心（CDE）頒布了《生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，對(duì)生物制品原液、成品或中間產(chǎn)物等的穩(wěn)定性研究設(shè)計(jì)、結(jié)果分析等進(jìn)行了明確規(guī)范［8］。2017年國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)和食品藥品監(jiān)管總局頒布了《疫苗運(yùn)輸和儲(chǔ)存管理規(guī)范》［9］，保證疫苗在運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性。同年CDE年頒布了《生物制品上市后變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》，對(duì)變更進(jìn)行的相關(guān)穩(wěn)定性研究提出了具體要求［10］。

1 研究目標(biāo)

穩(wěn)定性評(píng)價(jià)是疫苗質(zhì)量和安全性監(jiān)管的重要部分；穩(wěn)定性研究是產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂的基礎(chǔ)，可用于合理選擇產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、制劑處方及包裝材料，是貫穿于整個(gè)藥品研發(fā)階段和支持藥品上市及上市后的研究。穩(wěn)定性研究目標(biāo)在疫苗各個(gè)生命周期中有所不同［3］，分別為：（1）研發(fā)階段：確定疫苗有效期和儲(chǔ)存條件，并支持批準(zhǔn)上市。包括研究前期應(yīng)對(duì)疫苗中間品、原液、成品等階段各制劑處方組分的生物活性、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)完整性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。研究后期開(kāi)展與器皿封閉性、完整性相關(guān)的參數(shù)研究等；（2）上市后階段：研究上市疫苗與臨床疫苗的一致性，確保上市疫苗的安全性和有效性，同時(shí)應(yīng)對(duì)1批或多批疫苗進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)；（3）通過(guò)闡明不同工藝制造的產(chǎn)品可比性支持工藝變更［4］，要求采用變更后工藝生產(chǎn)至少3批疫苗，與現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的至少3批疫苗在不少于3個(gè)溫度點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行比較研究。為了節(jié)約時(shí)間和避免無(wú)菌監(jiān)測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果，溫度和時(shí)間的選擇應(yīng)根據(jù)特定疫苗的穩(wěn)定性而定。加速穩(wěn)定性研究的方案應(yīng)按照疫苗特性變化的溫度和時(shí)間而設(shè)計(jì)，并且通過(guò)檢測(cè)初始時(shí)間和最終時(shí)間時(shí)疫苗穩(wěn)定性參數(shù)，計(jì)算疫苗在各溫度條件下的降解率。通過(guò)比較不同工藝同一溫度下疫苗的降解率，評(píng)價(jià)新工藝的可行性。另外，熱加速穩(wěn)定性可在疫苗早期研發(fā)階段進(jìn)行，為確定有效期提供數(shù)據(jù)支持，也可協(xié)助評(píng)估疫苗在工藝變更后的穩(wěn)定性，但不可用于預(yù)測(cè)疫苗的實(shí)時(shí)、真實(shí)狀態(tài)的穩(wěn)定性。

2 研究設(shè)計(jì)

開(kāi)展穩(wěn)定性研究需要科學(xué)的方案設(shè)計(jì)，合理設(shè)定檢測(cè)批次、樣本數(shù)量、頻次和時(shí)間間隔。目前應(yīng)用于藥品及疫苗穩(wěn)定性評(píng)價(jià)常用的時(shí)間點(diǎn)為3、6、9、12和18個(gè)月，但其后每6個(gè)月作為檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)不一定適合所有疫苗，應(yīng)依據(jù)所研究疫苗的特性選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)間點(diǎn)；檢測(cè)參數(shù)應(yīng)選擇與臨床相關(guān)的、敏感的、可表征疫苗免疫原性或療效的指標(biāo)；疫苗穩(wěn)定性研究過(guò)程中，不但需要考慮蛋白、多糖、脂質(zhì)等疫苗的活性成分，還需同時(shí)關(guān)注疫苗的佐劑、稀釋劑等制劑組分以及包裝瓶、膠塞等包裝材料的影響；在數(shù)據(jù)分析時(shí)應(yīng)選擇適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法；可通過(guò)穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)外推定義有效期。此外，由于生物學(xué)檢測(cè)的固有變異性，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和使用對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。

3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)能表征疫苗的免疫原性或療效，以及與經(jīng)臨床試驗(yàn)證明的效力或安全性之間的聯(lián)系。疫苗效價(jià)是反映疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，也是用于考察疫苗穩(wěn)定性或降解程度的重要指標(biāo)。對(duì)于大多數(shù)疫苗，效價(jià)指標(biāo)可反映穩(wěn)定性（降解）對(duì)疫苗的免疫原性和保護(hù)效果產(chǎn)生的影響。根據(jù)疫苗特性的不同，效價(jià)檢測(cè)方法也各不相同，包括體內(nèi)效力或體外效力檢測(cè)方法，應(yīng)與相應(yīng)疫苗批簽發(fā)放行的效價(jià)檢測(cè)方法一致。但體內(nèi)和體外效力試驗(yàn)的缺點(diǎn)在于其往往受到多種生物變化因素的影響。除了效價(jià)，抗原含量和特定毒性也可反應(yīng)疫苗的活性，可借助特異抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）得到定量檢測(cè)結(jié)果。其它檢測(cè)參數(shù)還包括組胺致敏試驗(yàn)（百日咳疫苗）、游離多糖水平、佐劑解吸、佐劑聚集等。

疫苗效價(jià)的檢測(cè)方法依據(jù)疫苗的品種，以及各企業(yè)產(chǎn)品的特點(diǎn)有所不同（詳見(jiàn)藥典各論及附錄）。病毒滴度半數(shù)細(xì)胞感染劑量（CCID50）的檢測(cè)可用于直接研究減毒活疫苗中間品和／或成品的穩(wěn)定性，如麻疹／腮腺炎／風(fēng)疹（麻腮風(fēng)）疫苗、OPV疫苗、凍干甲肝減毒活疫苗和流感減毒活疫苗等；對(duì)于多數(shù)滅活疫苗，效價(jià)只能用于成品穩(wěn)定性的檢測(cè)，如脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV）、腸道病毒71型（EV-A71）滅活疫苗等；由于體外相對(duì)效力檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確定量、重復(fù)性好和符合3R原則等優(yōu)點(diǎn)，在得到穩(wěn)定的體內(nèi)效力和體外效力相關(guān)關(guān)系后，可采用體外相對(duì)效力檢測(cè)方法代替體內(nèi)法，如甲肝滅活疫苗和乙肝疫苗；抗原檢測(cè)是依據(jù)免疫學(xué)原理，通過(guò)標(biāo)記抗體以及單抗結(jié)合等方法（如ELISA法），評(píng)價(jià)疫苗抗原結(jié)構(gòu)的完整性。對(duì)于肺炎多糖疫苗和結(jié)合多糖疫苗，可通過(guò)游離糖檢測(cè)方法準(zhǔn)確反映疫苗穩(wěn)定性。

鋁佐劑具有增強(qiáng)免疫效果的作用，如果在外界環(huán)境壓力作用下發(fā)生解聚或聚集，可引起疫苗效力不可逆的下降［11］。WHO建立了SHAKE TEST方法用于評(píng)價(jià)疫苗凍結(jié)后質(zhì)量評(píng)價(jià)。該方法通過(guò)比較凍結(jié)前后疫苗沉降率的差異，了解疫苗是否受到冷凍的損傷［12］。另外，近年來(lái)采用儀器法和免疫學(xué)方法評(píng)價(jià)疫苗穩(wěn)定性的報(bào)道增多。儀器法主要檢測(cè)疫苗抗原的分子大小和結(jié)構(gòu)，如掃描電鏡法、質(zhì)譜法、流式細(xì)胞術(shù)等均可用于觀察鋁佐劑疫苗的聚集程度；而免疫學(xué)方法則是通過(guò)標(biāo)記抗體以及單抗結(jié)合等方法評(píng)價(jià)疫苗抗原結(jié)構(gòu)的完整性。

Estey等［13］采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）結(jié)合肽圖的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)佐劑結(jié)合的肉毒桿菌三價(jià)疫苗rBoNT（Hc）蛋白抗原的化學(xué)完整性。研究表明在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件下，鋁鹽佐劑可影響蛋白的化學(xué)穩(wěn)定性和／或化學(xué)降解路徑。Feinstein等［14］為了解沙眼衣原體外膜蛋白nMOMP在穩(wěn)定劑Amphipols中的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，應(yīng)用多種光譜技術(shù)鑒別其二級(jí)（圓二色）、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)（免疫組化和凝膠電泳），以及聚集狀態(tài)（光散射）。通過(guò)核磁共振檢測(cè)15N標(biāo)記的nMOMP蛋白，在Amphipols中可檢測(cè)到nMOMP暴露的外環(huán)結(jié)構(gòu)，表明Amphipols可提高膜蛋白為組分的疫苗穩(wěn)定性。 Stergaard 等［15］通過(guò)單抗標(biāo)記 Gardasil? 、Silgard?和Cervarix?3種凍結(jié)前后HPV疫苗，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示不同的HPV疫苗具有不同的熒光顆粒峰。凍結(jié)后的HPV疫苗經(jīng)檸檬酸／磷酸鹽緩沖液解離后發(fā)現(xiàn)抗原降解為較小的顆粒，證實(shí)該方法可用于鑒別佐劑凍結(jié)對(duì)HPV疫苗質(zhì)量的影響。Ye等［16］應(yīng)用柯薩奇病毒A組16型（CA16）抗原實(shí)心（F）和空心（E）顆粒的單抗，建立了評(píng)價(jià)CA16顆粒熱穩(wěn)定性的ELISA方法。感染了CA16的細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有成熟的F顆粒、E顆粒和變性顆粒。56℃加熱1 min后F顆粒失去活性，變性顆粒和E顆粒含量上升，提示F顆?？赡苻D(zhuǎn)變?yōu)樽冃灶w粒或E顆粒。

4 上市疫苗的穩(wěn)定性研究

4.1 WHO對(duì)上市疫苗穩(wěn)定性的分析報(bào)告 為了解疫苗的穩(wěn)定性，WHO在2006年的指南文件中對(duì)近20種疫苗包括白喉／百日咳／破傷風(fēng)疫苗（白百破疫苗）、乙肝疫苗、多糖和多糖結(jié)合疫苗、卡介苗、麻腮風(fēng)疫苗、黃熱病疫苗、OPV和IPV等，以及8種其它疫苗包括口服輪狀病毒疫苗、乙型腦炎疫苗、傷寒疫苗、霍亂疫苗、甲肝滅活疫苗、狂犬病毒疫苗、流感病毒疫苗和水痘疫苗等的熱敏感性、凍結(jié)敏感性和不同溫度下的穩(wěn)定性進(jìn)行了歸納總結(jié)。其中12種疫苗為凍結(jié)敏感性疫苗，包括破傷風(fēng)／白喉疫苗（單價(jià)及聯(lián)合疫苗）、乙肝疫苗、百日咳疫苗、IPV疫苗、肺炎多糖疫苗、肺炎結(jié)合疫苗、甲肝滅活疫苗、傷寒霍亂滅活疫苗凍結(jié)后可影響疫苗質(zhì)量，流感和水痘減毒活疫苗可冷凍保存，但溶解后不能重新凍結(jié)［3］。2015年，WHO依據(jù)疫苗的熱敏感性由高到低排列將疫苗分為6組，其中A組為OPV，B組為流感疫苗，C組包括IPV、凍干麻風(fēng)或麻風(fēng)二聯(lián)或麻風(fēng)腮三聯(lián)疫苗；D組包括霍亂、百白破、麻疹、風(fēng)疹、輪狀、黃熱等疫苗；E組包括BCG、HPV疫苗、破傷風(fēng)等，F(xiàn)組包括乙肝疫苗、凍干流感嗜血桿菌疫苗（Hib）、流腦疫苗等［17］。

4.2 新研發(fā)上市疫苗的穩(wěn)定性

4.2.1 HPV 疫苗：Shank-Retzlaff等［18］應(yīng)用體外相對(duì)效力（IVRP）和示差掃描量熱法（DSC）方法，評(píng)價(jià)默克公司Gardasil?疫苗的熱穩(wěn)定性。疫苗樣本置于4℃到42℃，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的IVRP，結(jié)果表明Gardasil?具有較好的穩(wěn)定性。疫苗在25℃時(shí)半衰期預(yù)計(jì)大于130個(gè)月；37℃時(shí)，半衰期為18個(gè)月；42℃時(shí)約為3個(gè)月。對(duì)3批疫苗在64℃條件下放置40 min后檢測(cè)IVRP和ED50，結(jié)果顯示熱加速疫苗與4℃對(duì)照疫苗IVRP蛋白比值分別為：0.50～0.67，0.95～1.18；ED50分別為 0.52 ～0.77，0.10 ～0.13。顯示熱處理導(dǎo)致IVRP下降約50%，ED50升高4～7倍。應(yīng)用DSC評(píng)價(jià)在溫度快速升高條件下蛋白變性的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)四種HPV單價(jià)成分的DSC特性不同，提示氨基酸結(jié)構(gòu)細(xì)微的改變可顯著影響與穩(wěn)定L1蛋白有關(guān)的分子間的聯(lián)系，并與VLP裝配有關(guān)。該研究還認(rèn)為，VLP疫苗相對(duì)較穩(wěn)定，同時(shí)通過(guò)比較液相疫苗和佐劑疫苗熱處理后的IVRP，認(rèn)為該疫苗的鋁佐劑有助于疫苗抗原保持穩(wěn)定。

4.2.2 戊型肝炎（HE）疫苗：Zhang 等［19］應(yīng)用小鼠體內(nèi)效力和體外抗原方法評(píng)價(jià)12批2～8℃條件下儲(chǔ)存24個(gè)月的預(yù)充注射器HE疫苗（Hecolin?）的穩(wěn)定性；采用分析超速離心法、高效體積排阻色譜法和透射電子顯微鏡評(píng)估佐劑中解離的P239 VLP顆粒特性；應(yīng)用DSC對(duì)吸附抗原的熱及構(gòu)象穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估；應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和銀染，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS）和MALDI-TOF方法考察解離抗原蛋白的完整性；應(yīng)用表位表面等離子共振（SPR）檢測(cè)法和基于單克隆抗體夾心ELISA法測(cè)定中和抗體結(jié)合活性和疫苗的抗原性。結(jié)果顯示預(yù)充HE疫苗2～8℃儲(chǔ)存24個(gè)月抗原結(jié)構(gòu)和功能特性未發(fā)生改變，疫苗具有較好的穩(wěn)定性。

4.2.3 口服輪狀病毒疫苗：Naik等［20］對(duì)印度SIIPL公司研發(fā)的口服輪狀病毒疫苗進(jìn)行了穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。該疫苗為減毒活疫苗，含G1，G2，G3，G4和G5等5個(gè)血清型，以蔗糖-甘氨酸為保護(hù)劑。疫苗可在25℃條件下保存36個(gè)月，37℃和40℃條件下保存18個(gè)月，可短暫暴露于55℃條件下。并證實(shí)該疫苗在-20℃冷凍至42℃環(huán)境溫度均耐受。該疫苗被認(rèn)為是首個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的熱穩(wěn)定疫苗［21］。

5 小結(jié)

疫苗穩(wěn)定性研究是保證疫苗安全有效的基礎(chǔ)。我國(guó)疫苗產(chǎn)能居世界首位，疫苗質(zhì)量達(dá)到國(guó)際水平，且近年來(lái)有多種新型疫苗成功上市，但關(guān)于疫苗穩(wěn)定性研究的報(bào)道較少。迫切需要開(kāi)展疫苗穩(wěn)定性相關(guān)研究工作。在穩(wěn)定性研究方案設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)依據(jù)研究目標(biāo)的不同進(jìn)行科學(xué)、周密的設(shè)計(jì)，選擇適宜的監(jiān)測(cè)方法和指標(biāo)。在疫苗研發(fā)階段，應(yīng)充分考慮疫苗穩(wěn)定性對(duì)其質(zhì)量和應(yīng)用的影響，包括疫苗的劑型和保護(hù)劑，以及疫苗接種可能面臨的瓶頸。對(duì)已上市的疫苗制品，需考慮在保證冷鏈儲(chǔ)運(yùn)的前提下進(jìn)行有效的穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)，保證疫苗的安全有效。

利益沖突無(wú)