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(貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心， 貴陽 550001)

1 植物種子發(fā)育過程研究

高等植物種子的發(fā)育開始于胚珠里發(fā)生的雙受精過程，結(jié)束于形成下一代繁殖所需的成熟的休眠種子。從形態(tài)學(xué)來說，種子發(fā)育過程經(jīng)歷3個(gè)標(biāo)志性的時(shí)期，即細(xì)胞分化、器官形成和種子成熟[1]。以模式植物擬南芥為例(圖1)[2]，從花受精到種子成熟一共持續(xù)19 d，期間種胚發(fā)育過程從原胚期開始(0 d)，經(jīng)過球形胚前期(1 d)、球形胚期(3～4 d)、心形胚期(5～6 d)、魚雷形胚期(7～8 d)、綠熟期(13～14 d)，到種子后熟期(18～19 d)，然后種子進(jìn)入休眠狀態(tài)，等待下一代萌發(fā)。胚乳發(fā)育包括游離核期、細(xì)胞化期和吸收期。胚柄和胚體的分化發(fā)生在受精后1～5 d，細(xì)胞和組織的分化發(fā)生在受精后4～6 d，頂端/根分生組織的分化在受精后第5天，子葉和軸的發(fā)育在受精后6～18 d，營養(yǎng)儲(chǔ)存物質(zhì)的積累從受精后第7天開始，一直到種子后熟(第19天)。種子后熟時(shí)種子大量失水，隨后進(jìn)入休眠期。從細(xì)胞角度而言，受精后前8 d主要是細(xì)胞分化時(shí)期，9～19 d主要是細(xì)胞擴(kuò)張時(shí)期。

種子的發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)積累過程依賴于大量基因的表達(dá)和調(diào)控，研究這些基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律有助于了解種子發(fā)育過程中各種營養(yǎng)物質(zhì)積累的分子機(jī)制。擬南芥[2]、水稻[3]、小麥[4]、大豆[5]、油菜[6]、大麥[7]等種子發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析挖掘了大量與之相關(guān)的調(diào)控和功能基因。轉(zhuǎn)錄因子是參與植物表達(dá)調(diào)控的重要反式作用因子,它們?cè)诜N子發(fā)育和籽粒灌漿的過程中具有重要調(diào)控作用[1]。玉米種子發(fā)育過程中共檢測(cè)到414個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其中113個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育的胚乳中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，它們主要為bZIP(13%)、鋅指蛋白(17%)和NAC(11%)幾個(gè)家族成員[8]。對(duì)玉米發(fā)育不同時(shí)期和組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，篩選出218個(gè)在種子中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它們分屬于43個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄因子家族，包括MYB、AP 2、B 3、NAC等[9]。大豆種子發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在脫水和干旱的種子中的表達(dá)量高于幼嫩時(shí)期的種子[5]。穎片是離種子最近的營養(yǎng)器官，19個(gè)WRKY和16個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在大麥種子灌漿期上調(diào)表達(dá)，表明這些轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控能量從穎片向種子的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。油菜灌漿期種子和角果皮的轉(zhuǎn)錄組分析表明，HB、Aux/IAA、bHLH、C 2 C 2-CO-like、MYB和REM幾類轉(zhuǎn)錄因子在灌漿期的種子和角果皮中大量表達(dá)[10]。

2 植物NAC轉(zhuǎn)錄因子研究

NAC是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，研究表明，其廣泛參與到植物生長發(fā)育過程及各項(xiàng)生理活動(dòng)，如胚和頂端分生組織的發(fā)育、次生根的形成、激素信號(hào)的響應(yīng)、防御和抗逆、衰老等[11]。最初的NAC轉(zhuǎn)錄因子作為干旱響應(yīng)因子被鑒定，從失水脅迫的擬南芥中克隆了9個(gè)基因，分別為RD19(RESPONSIVETODEHYDRATION26)、RD21、RD22、RD29、RD17、RD20、RD28、RD26，其中RD22和RD29的表達(dá)也可以被生長素脫落酸所誘導(dǎo)；通過對(duì)RD 28編碼蛋白序列的分析，表明該蛋白是跨膜通道蛋白大家族中的一員[11-12]。隨后越來越多的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來，包括矮牽牛的NAM和擬南芥ATAF 1/2和CUC 2 三個(gè)蛋白，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的命名也是由三個(gè)蛋白的首字母組成[12]。隨著植物基因組學(xué)的發(fā)展，NAC轉(zhuǎn)錄因子在全基因組水平上的鑒定和分析在多個(gè)植物物種中完成，到目前為止，擬南芥中鑒定到117條，水稻中鑒定到151條[13]，大白菜中鑒定到204條[14]，木薯中鑒定到96條[15]，桑樹中鑒定到79條[16]，西瓜中鑒定到82條[17]，玉米中鑒定到128條[18]，土豆中鑒定到110條[19]，蘋果中鑒定到256條[20]，葡萄中鑒定到71條[21]，還有一些其他物種[22-23]，這些物種中的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子得到了廣泛的鑒定和系統(tǒng)的分析，包括其結(jié)構(gòu)、保守模體、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式等。Nakashima等[12]對(duì)擬南芥、水稻、石松和苔蘚4個(gè)物種中的大多數(shù)NAC基因進(jìn)行了的系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)保守氨基酸和NA結(jié)構(gòu)域的分析，4個(gè)物種中的NAC基因被廣泛地分為六大類(圖2 A)。同一大類中的NAC基因功能相近，如許多脅迫響應(yīng)的NAC基因都?xì)w屬于SNAC(Sress-responsive NAC)大類。NAC家族參與脅迫響應(yīng)報(bào)道最為多見，SNAC大類基因又被細(xì)分為SNAC-A，SNAC-B，和SNAC-C三類(圖2 B)，其中擬南芥和水稻的SNAC基因集中在SNAC-A和SNAC-B兩類中，石松和苔蘚的SNAC基因集中在SNAC-C類中。以上研究表明，六大類NAC轉(zhuǎn)錄因子在很早的時(shí)期就已經(jīng)存在(至少在古老的低等植物苔蘚中)，同時(shí)，SNAC-A和SNAC-B兩類NAC轉(zhuǎn)錄因子的分化發(fā)生在石松類植物和其他維管植物的分化之后，但是在單子葉和雙子葉植物的分化之前。

圖1 擬南芥種子發(fā)育示意圖(圖片引自Le等，2010)

NAC家族蛋白的氮端含有一個(gè)高度同源的區(qū)域，即與DNA結(jié)合的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域長約150個(gè)氨基酸，含有5個(gè)保守區(qū)域(A-E)。利用X射線晶體學(xué)研究了擬南芥ANAC 019蛋白NAC結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)NAC結(jié)構(gòu)域缺少經(jīng)典的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模體，多了一個(gè)新的由一些螺旋狀元素包裹一個(gè)扭曲的β片層組成的TF折疊模體；同時(shí)，2個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域可以形成一個(gè)有功能的二聚體結(jié)構(gòu)[11]。水稻中一個(gè)響應(yīng)脅迫的NAC蛋白(SNAC 1)的結(jié)構(gòu)也被鑒定了出來，SNAC 1的NAC結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與擬南芥ANAC 019的結(jié)構(gòu)相似，并且也是形成二聚體起作用[24]。此外，氮端的NAM結(jié)構(gòu)域還含有一個(gè)核定位信號(hào)，NAC家族蛋白碳端區(qū)域是高度變異的，含有轉(zhuǎn)錄激活域，有些NAC蛋白碳端區(qū)域含有蛋白結(jié)合活性的模體，而另一些NAC蛋白碳端區(qū)域含有跨膜模體[11]。

注：A為NAC家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系示意圖；B為SNAC亞家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2 擬南芥、水稻、石松和苔蘚四種植物中NAC結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育樹。(圖片引自Nakashima 等，2012)

3 NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子發(fā)育過程

通過基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物花發(fā)育、響應(yīng)激素信號(hào)、響應(yīng)生物和非生物脅迫信號(hào)、響應(yīng)光信號(hào)、細(xì)胞程序化死亡和衰老等[11]。植物NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控種子發(fā)育和籽粒灌漿過程在以小麥和水稻為代表的多種植物中可見報(bào)道。小麥NAM家族中多個(gè)基因影響種子谷粒蛋白含量，從野生二粒小麥Gpc-B 1數(shù)量性狀位點(diǎn)克隆到一個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子TtNAM-B 1，通過RNA 干擾技術(shù)沉默TtNAM-B1及其同源基因TtNAM-A1和TtNAM-B2后，與對(duì)照相比,干擾株系延緩衰老3周，并且種子蛋白、鐵、鋅含量減少了30%左右，表明NAM基因參與調(diào)節(jié)小麥衰老，有利于提高種子蛋白、鐵、鋅含量；隨后普通小麥中NAM同源基因也被驗(yàn)證具有相似作用[25]。分別在16個(gè)小麥及小麥近源種中克隆出NAM-B1基因，對(duì)其序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)NAM-B1基因SNP位點(diǎn)變異與谷粒蛋白含量存在一定的相關(guān)性：在一個(gè)NAM-B1堿基突變提前形成終止密碼子,產(chǎn)生無義氨基酸的材料中，谷粒蛋白含量最低[26]。對(duì)TtNAM-B1基因的過表達(dá)和干擾株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選到619個(gè)受該基因調(diào)控的下游基因，其中包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、激素調(diào)節(jié)基因、轉(zhuǎn)錄因子等[4]。最近，TtNAM-B1的同源基因NAM-G1也被發(fā)現(xiàn)具有相似的功能，可以增加谷粒蛋白含量；另一個(gè)同源基因TaNAC-S在小麥中過表達(dá)后使谷粒中N含量增加[27]。NAM基因在中國春小麥的不同組織中均有表達(dá)，其中TaNAM-D1在籽粒中的表達(dá)豐度最高[28]。

水稻種子中NAC轉(zhuǎn)錄因子影響水稻的抗逆性、谷粒灌漿及產(chǎn)量[29-30]。OsNAC5基因在灌漿期的水稻旗葉中上調(diào)表達(dá)，參與了營養(yǎng)物質(zhì)從綠色葉片到種子的轉(zhuǎn)運(yùn)。OSNAC9和OsNAC10兩個(gè)基因可以改變水稻的根系結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)抗旱性，進(jìn)而提高產(chǎn)量。ONAC023基因在受粉后3 d和7 d的水稻種子中特異表達(dá)，以其為誘餌通過酵母雙雜交技術(shù)，調(diào)取到21個(gè)與之結(jié)合的蛋白，其中有2個(gè)谷蛋白編碼基因。

其它物種中，NAC家族轉(zhuǎn)錄因子與種子發(fā)育的關(guān)系也有報(bào)道。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定在玉米胚乳中表達(dá)的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，其中APN-1在授粉后5 d的種子中大量表達(dá)，并在授粉后20 d的種子中達(dá)到最大值；對(duì)其上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中含有胚乳特異、ABA和GA響應(yīng)的順式作用元件；將APN-1上游啟動(dòng)子序列連接GUS基因進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因只在胚乳的糊粉層中表達(dá)，表明其可能調(diào)控胚乳的發(fā)育[8]。從大豆中克隆了6個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，均含有保守的NAM結(jié)構(gòu)域；對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，表明6個(gè)NAC基因先隨著種子發(fā)育表達(dá)量逐漸增加，在30～35 d的大豆種子中最高，隨后逐漸降低；組織特異性分析表明，GmNAC2 和GmNAC5兩個(gè)基因在灌漿期的種子中表達(dá)豐度最高[31]。

4 結(jié)論和展望

種子發(fā)育是植物重要的生長過程之一，植物特有的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在這一過程中起重要調(diào)控作用。小麥NAM家族基因的表達(dá)參與谷粒蛋白含量、植株衰老、鐵、鋅和氮含量的調(diào)控；水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控水稻的抗逆性、谷粒灌漿，最終影響產(chǎn)量；玉米、大豆等其他物種中NAC家族轉(zhuǎn)錄因子在種子中存在組織特異性表達(dá)。與NAC家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物抗逆性相比，其調(diào)控種子發(fā)育的研究相對(duì)較少，通過反向遺傳學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方式鑒定更多與種子發(fā)育相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子十分迫切。同時(shí)，由于一些NAC轉(zhuǎn)錄因子可能在植物的生長發(fā)育過程中有多種作用，往往不僅僅只調(diào)控一個(gè)單一的生長發(fā)育過程，也存在著多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控同一生長發(fā)育過程的情況，因此研究一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多個(gè)生長發(fā)育過程或多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控同一生長發(fā)育過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分必要。

[1]黃娟,陳慶富,鄧嬌,等.植物種子發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J].貴州師范學(xué)院學(xué)報(bào),2016(12):48-53.

[2]Le BH,Cheng C,Bui A Q,et al.Global analysis of gene activity during Arabidopsis seed development and identification of seed-specific transcription factors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(18):8 063-8 070.

[3]Jiang S Y,Ramachandran S.Functional genomics of rice pollen and seed development by genome-wide transcript profiling and Ds insertion mutagenesis[J].Int J Biol Sci,2010,7(1):28-40.

[4]Cantu D,Pearce S P,Distelfeld A,et al.Effect of the down-regulation of the high Grain Protein Content (GPC) genes on the wheat transcriptome during monocarpic senescence[J].BMC Genomics,2011(12):492.

[5]Jones S I,Gonzalez D O,Vodkin L O.Flux of transcript patterns during soybean seed development[J].BMC Genomics,2010(11):136.

[6]Basnet R K,Moreno-Pachon N,Lin K,et al.Genome-wide analysis of coordinated transcript abundance during seed development in different Brassica rapa morphotypes[J].BMC Genomics,2013,14:840.

[7]Kohl S,Hollmann J,Erban A,et al.Metabolic and transcriptional transitions in barley glumes reveal a role as transitory resource buffers during endosperm filling[J].J Exp Bot,2015,66(5):1 397-1 411.

[8]Verza N C,Figueira T R S,Sousa S M,et al.Transcription factor profiling identifies an aleurone-preferred NAC family member involved in maize seed development[J].Annals of Applied Biology,2011,158(1):115-129.

[9]謝億.調(diào)控玉米種子發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的篩選[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[10]柳寒.油菜灌漿期種子和角果皮基因表達(dá)差異及相關(guān)基因的功能分析[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[11]康桂娟,曾日中,聶智毅,等.植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2012(11):21-26.

[12]Nakashima K,Takasaki H,Mizoi J,et al.NAC transcription factors in plant abiotic stress responses[J].Biochim Biophys Acta,2012,1819(2):97-103.

[13]Nuruzzaman M,Manimekalai R,Sharoni A M,et al.Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice[J].Gene,2010,465(1-2):30-44.

[14]Liu T,Song X,Duan W,et al.Genome-Wide Analysis and Expression Patterns of NAC Transcription Factor Family Under Different Developmental Stages and Abiotic Stresses in Chinese Cabbage[J].Plant Molecular Biology Reporter,2014,32(5):1 041-1 056.

[15]Hu W,Wei Y,Xia Z,et al.Genome-Wide Identification and Expression Analysis of the NAC Transcription Factor Family in Cassava[J].PLoS One,2015,10(8):e 136993.

[16]Baranwal V K,Khurana P.Genome-wide analysis,expression dynamics and varietal comparison of NAC gene family at various developmental stages in Morus notabilis[J].Mol Genet Genomics,2016,291(3):1 305-1 317.

[17]Wei S,Gao L,Zhang Y,et al.Genome-wide investigation of the NAC transcription factor family in melon (CucumismeloL.) and their expression analysis under salt stress[J].Plant Cell Rep,2016,35(9):1 827-1 839.

[18]Shiriga K,Sharma R,Kumar K,et al.Genome-wide identification and expression pattern of drought-responsive members of the NAC family in maize[J].Meta Gene,2014(2):407-417.

[19]Singh A K,Sharma V,Pal A K,et al.Genome-wide organization and expression profiling of the NAC transcription factor family in potato(SolanumtuberosumL.)[J].DNA Res,2013,20(4):403-423.

[20]劉更森,張演義,戴洪義,等.蘋果NAC轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(6):14-23.

[21]李成慧,蔡斌.葡萄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分析[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013(6):7-13.

[22]羅朝兵.青桿PwNAC1及其擬南芥同源基因ANAC018轉(zhuǎn)錄活性及功能分析[D].北京林業(yè)大學(xué),2016.

[23]朱乾坤.AtNAC 1轉(zhuǎn)錄因子的分子建模和鐵皮石斛NAC家族基因的克隆及表達(dá)分析[D].西南交通大學(xué),2014.

[24]Chen Q,Wang Q,Xiong L,et al.A structural view of the conserved domain of rice stress-responsive NAC 1[J].Protein Cell,2011,2(1):55-63.

[25]Uauy C,Distelfeld A,Fahima T,et al.A NAC Gene regulating senescence improves grain protein,zinc,and iron content in wheat[J].Science,2006,314(5 803):1 298-1 301.

[26]Jamar C,Loffet F,Frettinger P,et al.NAM-1gene polymorphism and grain protein content in Hordeum[J].J Plant Physiol,2010,167(6):497-501.

[27]Zhao D,Derkx A P,Liu D C,et al.Overexpression of a NAC transcription factor delays leaf senescence and increases grain nitrogen concentration in wheat[J].Plant Biol (Stuttg),2015,17(4):904-913.

[28]吳丹,董劍,要燕杰,等.小麥中國春NAM轉(zhuǎn)錄因子Gpc-1和Gpc-2灌漿期時(shí)空表達(dá)模式分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(07):1 262-1 276.

[29]唐立群,黃世文,侯雨萱.水稻種子酵母雙雜交體系的構(gòu)建及種子特異表達(dá)蛋白ONAC 023互作蛋白的鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(09):16-20.

[30]Redillas M C,Jeong J S,Kim Y S,et al.The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions[J].Plant Biotechnol J,2012,10(7):792-805.

[31]孟慶長.大豆GmNAC和GmLFY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的克隆、鑒定和種子性狀的QTL定位研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.