王 歡，劉 茜，李 紅，楊曉華，尹 娜，楊 靜，李 媛，潘興華，魏 玲

Klotho基因是1997年Kuro等[1]研究自發(fā)性高血壓大鼠時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的新型抗衰老基因，敲除Klotho基因的小鼠會(huì)過(guò)早出現(xiàn)與衰老相關(guān)的表型，如皮膚萎縮、肺氣腫、糖代謝異常、骨質(zhì)疏松等，甚至導(dǎo)致壽命縮短。Semba等[2]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中Klotho高表達(dá)是社區(qū)成年居民較少發(fā)生心血管疾病，如冠狀動(dòng)脈疾病、心力衰竭、外周動(dòng)脈疾病的獨(dú)立保護(hù)因素。本實(shí)驗(yàn)擬研究慢性心衰大鼠心肌Klotho基因表達(dá)，及其與心?、裥秃廷笮湍z原表達(dá)的相關(guān)性，探討其抗心肌纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠20只，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK（滇）2011-0005]，鼠齡約 3 月齡，體重約（300±30）g，其中10只大鼠用于心衰大鼠模型制備,10只為正常對(duì)照組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清（BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司），慢病毒載體LV-EGFP（上海吉?jiǎng)P生物有限公司），鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司)，Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），DMEM-F12培養(yǎng)基（HyClone公司）。

1.3 心衰模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 20只SD大鼠經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組與心衰模型組，心衰模型組大鼠連續(xù)腹腔給予異丙腎上腺素注射，3 mg/(kg·d)，共 14 d。 建模 2 w 后行超聲心動(dòng)圖測(cè)定，左心室射血分?jǐn)?shù)＜50%的大鼠定義為慢性心衰大鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 心/體重指數(shù) 稱取各組建?；蛭桂B(yǎng)2 w后大鼠體重，麻醉后，剪開(kāi)胸腔，取出心臟，用冰生理鹽水洗滌血污，剔除脂肪、血管等非心肌組織后，無(wú)菌紗布吸干心臟表面液體，稱取心臟重量，計(jì)算心臟濕重/體重指數(shù)（HW/BW）。

1.4.2 心肌組織中 Klotho、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA的表達(dá)量 采取大鼠心肌組織,用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)。根據(jù)RNAiso Plus使用說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取總RNA，使總RNA濃度在 3～5 μg/μl，A260/A280 比值在 1.8～2.0。 取 2 μg總RNA，按照GoScriptTM Reverse Transcription System Kit說(shuō)明書(shū)配制20 μl逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，所得產(chǎn)物cDNA置于-20℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增大鼠 Klotho、ColⅠ、Collagen Ⅲ，循環(huán)條件：預(yù)變性95℃10 min，再一步變性95℃、15 s，退火延伸60℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，根據(jù)每個(gè)樣本反應(yīng)后達(dá)到熒光信號(hào)閾值的循環(huán)數(shù)（Ct值），計(jì)算2-△△Ct值，對(duì)比分析兩組Klotho、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因的mRNA表達(dá)差異。 引物見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，心重/體重指數(shù)采用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩變量相關(guān)性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Klotho、CollagenIa1、CollagenⅢa1PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組心重/體重指數(shù)及心功能檢測(cè)結(jié)果 建?；蛭桂B(yǎng)2 w后，心衰模型組的心重/體重指數(shù)為（6.01±0.30）%，明顯高于正常對(duì)照組（4.12±0.25）%(P＜0.01)。超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示：心衰模型組大鼠的射血分?jǐn)?shù)（EF）為（39.53±2.55）%，顯著低于正常對(duì)照組的（70.66 4.08）%（P＜ 0.01）。

2.2 兩組心肌 Klotho和 Collagen I、CollagenⅢmRNA表達(dá)量比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組心 肌 組 織 中 Klotho、Collagen I和 CollagenⅢmRNA均有表達(dá)。心衰模型組的Klotho較正常組顯著降低（P＜ 0.05），而 CollagenⅠ和 CollagenⅢ的mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。 見(jiàn)表 2。

2.3 各指標(biāo)間相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌Klotho mRNA與CollagenⅠmRNA和CollagenⅢ mRNA表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)（r=－0.578、0.558，P＜ 0.05）。

3 討論

表2 兩組心肌KIotho和CoIIagenⅠ、CoIIagenⅢmRNA表達(dá)量比較

心肌纖維化是心臟重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)，心肌膠原的沉積是心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)[3]。近年來(lái)眾多研究證實(shí)，Klotho基因能抑制心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)[4-5]。Xie等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白通過(guò)抑制瞬時(shí)受體電位通道-6（TRPC-6)，阻滯了Klotho基因缺陷小鼠心肌病理性重構(gòu)及纖維化的發(fā)生。Zhang等[7]研究表明，Klotho蛋白主要通過(guò)阻滯胰島素生長(zhǎng)因子(IGF1)/磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）信號(hào)通路介導(dǎo)的離子通道胞吐作用，降低細(xì)胞膜上TRPC6的含量，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。有研究表明[8]，血循環(huán)中的Klotho能維持血管內(nèi)皮完整性，保護(hù)血管通透性。但Klotho基因改善心肌纖維化的機(jī)制仍不甚清楚。

本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用RT-qPCR法研究慢性心衰大鼠心肌中Klotho基因與心肌CollagenⅠmRNA和CollagenⅢmRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果表明，心衰大鼠的心肌Klotho mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），而Collagen I和CollagenⅢmRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明心衰導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的抗衰老功能減低，而纖維化傾向增加。進(jìn)一步相關(guān)分析顯示，心衰大鼠心肌Klotho mRNA表達(dá)量與心肌CollagenⅠmRNA和CollagenⅢmRNA的表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)，提示 Klotho和 CollagenⅠ、CollagenⅢ之間可能存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系，這可能是Klotho基因抑制心肌纖維化的機(jī)制。

[1] Kuro M,Matsumura Y,Aizawa H,et al.Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrome resembling ageing [J].Nature,1997,390(6655):45-51.

[2] Semba RD,Cappola AR,Sun K,et al.Plasma klotho and cardiovascular disease in adults[J].Am Geriatr Soc,2011,59(9):1596-1601.

[3] Hu SS,Kong LZ,Gao RL,et al.Outline of the report on cardiovascular disease in China [J].Biomed Environ Sci,2012,25(3):251-256.

[4] Li X,Han J,Li L,et al.Effect of farnesyltransferase inhibition on cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats[J].International Journal of Cardiology,2013,168(4):3340-3347.

[5] 賈政，魏玲，劉茜,等.重組腺病毒介導(dǎo)Klotho基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)大鼠心力衰竭心肌重構(gòu)的影響[J].中華心血管病雜志,2015,43(3):219-226.

[6] 張軍，代文靜，周敬群.抗衰老Klotho蛋白減輕大鼠乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[J]，中國(guó)病理生理雜志,2015,21(6):980-987.

[7] Zhang W,Xue D,Hu D,et al.Secreted klotho protein attenuates oeseogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal Stem cells in vitro via inactivation the FGFR1/ERK signaling pathway[J].Growth Factors,2015,33(5-6):356-365.

[8] Kusaba T,Okigaki M,Matui A,et al.Klotho is associated with VEGF receptor-2 and the transient receptor potential canonical-1 Ca2+channel to maintain endothelial integrity[J].Proc Nat Acad Sci,2010,107(45):19308-19313.