和法蓮，白盈盈，陳慧芬，李自安，楊建勇，潘興華，劉高米洋

綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（GFP-BMSC）具有自我更新和多向分化潛能，同時(shí)又能穩(wěn)定表達(dá)GFP，可作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）體內(nèi)示蹤及分化研究的良好工具。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，體外分離培養(yǎng)中小鼠GFP-BMSC的培養(yǎng)不同于人及大鼠，其培養(yǎng)擴(kuò)增難度高，細(xì)胞活性保持時(shí)間短，傳代過程中BMSC消化時(shí)間長短難以控制，嚴(yán)重影響小鼠GFP-BMSC的體外擴(kuò)增效率。本研究通過比較不同胰酶消化時(shí)間對消化過程的影響，優(yōu)化小鼠BMSC消化時(shí)間，為小鼠BMSC的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 4～8周齡雄性綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，由醫(yī)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國BI公司)、胎牛血清（Hyclone公司）、SW-CL-2F 型百萬層級層流超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、0.25% 胰酶(美國BI公司)，成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)試劑盒（GIBCO公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BMSC的提取和培養(yǎng) 脫頸處死綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，75%乙醇皮膚消毒，無菌條件下取股骨及脛骨，浸泡在PBS中，移至超凈工作臺(tái)，移除PBS，再用含雙抗1∶100的PBS清洗3遍。用無菌剪剪掉兩側(cè)的骨骺端，暴露骨髓腔，放于10 mm培養(yǎng)皿中，用1 ml一次性注射器吸取細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM/F-12)沖洗骨髓腔。沖洗數(shù)次直至將絕大部分骨髓沖出，骨髓腔由紅色變成白色為準(zhǔn)。用5 ml一次性無菌巴氏滴管，反復(fù)在培養(yǎng)皿中吹吸細(xì)胞懸液3～5次，盡量使細(xì)胞呈單個(gè)狀態(tài)；再全部轉(zhuǎn)移到新的10 cm2培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞懸液約5 ml，24 h后補(bǔ)液至10 ml。待細(xì)胞融合率約80%～90%時(shí)傳代。

1.2.2 胰酶最佳消化時(shí)間確定 取P2代純化的含相同細(xì)胞量的小鼠BMSC懸液接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%的胰酶消化 5、10、15和 20 mins，觀察細(xì)胞消化程度、細(xì)胞形態(tài)、死亡細(xì)胞碎片的數(shù)量，比較不同時(shí)間點(diǎn)胰酶對小鼠BMSCs的消化能力。

1.2.3 BMSC誘導(dǎo)分化潛能鑒定

1.2.3.1 成脂誘導(dǎo) 取消化10～15 mins后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按2×104個(gè)/cm2的密度接種6孔板中，加入20%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基2 ml/孔。將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液，直到細(xì)胞融合度達(dá)到100%或者過融合。棄上清，加入成脂誘導(dǎo)液，每3 d換1次液。成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后，4%中性甲醛溶液固定，油紅O染色，觀察成脂染色效果。

1.2.3.2 成骨誘導(dǎo) 取消化10～15 min后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按2×104個(gè)/cm2的密度接種在6孔板中，將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d換液，直到細(xì)胞融合度達(dá)到60%，棄上清，加入成骨誘導(dǎo)液，每3 d換1次液；培養(yǎng)至21 d后，4%中性甲醛溶液固定，茜素紅染色，用1×PBS沖洗3次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。1.2.3.3 成軟骨誘導(dǎo) 取消化10～15 min后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按5×105個(gè)/cm2的密度接種在6孔板中，將細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁2 h后，棄上清，加入成軟骨誘導(dǎo)液，每3 d換1次液，培養(yǎng)誘導(dǎo)14～28 d后，對軟骨球進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋，進(jìn)行阿辛藍(lán)染色，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 BMSC分離培養(yǎng)結(jié)果 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離的小鼠BMSC，接種3 d后，可見大量貼壁細(xì)胞生長，呈梭形，上層培養(yǎng)基中懸浮大量的雜細(xì)胞；棄上層培養(yǎng)后，并用PBS緩沖液沖洗2遍后，自然光與綠色激發(fā)光下，可見形態(tài)均一的細(xì)胞增殖集落(圖 1a、b)；繼續(xù)培養(yǎng) 2～3 d，75%以上細(xì)胞融合。 經(jīng)胰酶消化后1:2傳代，自然光與綠色激發(fā)光下，細(xì)胞貼壁后呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)(圖1c、d)，分布均勻，大小一致。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)胰酶消化結(jié)果 胰酶消化5 min后，大量細(xì)胞仍處于貼壁狀態(tài)，無法傳代(圖2a)；胰酶消化10～15 min后，50%～80%細(xì)胞縮成圓形，不再貼壁，可用于傳代，顯微鏡下細(xì)胞呈單個(gè)狀態(tài)，死亡碎片較少，且二次貼壁后細(xì)胞呈長梭形，表面光滑，具有多向分化潛能(圖2b、c)；胰酶消化20 min后，細(xì)胞大部分懸浮，傳代再貼壁后細(xì)胞呈寬大扁平狀，表面粗糙，狀態(tài)較差(圖2d)。

2.3 BMSC誘導(dǎo)分化能力 體外成脂分化誘導(dǎo)14～21 d后，細(xì)胞由長梭形開始收縮、變圓，形態(tài)不規(guī)則，有脂肪小滴，經(jīng)油紅O染色后，脂滴明顯紅染（圖3a）；體外成骨分化誘導(dǎo) 14～21 d后，經(jīng)茜素紅染色后，出現(xiàn)明顯紅染的鈣結(jié)節(jié)（圖3b）；體外成軟骨分化誘導(dǎo)14～28 d后，石蠟包埋切片，可見軟骨膠原基質(zhì)中酸性粘多糖經(jīng)阿利新藍(lán)染成藍(lán)色（圖3c）。

3 討論

圖1 倒置顯微鏡觀察小鼠熒光BMSC的形態(tài)（40×）

圖2 熒光小鼠BMSC的胰酶消化后的貼壁形態(tài)（40×）

BMSC是干細(xì)胞研究中的一個(gè)重點(diǎn)和熱點(diǎn)，因其含量相對較多又易于獲得，體外生長能力強(qiáng)，已被廣泛用于人類疾病動(dòng)物模型治療研究，但在體內(nèi)示蹤其遷移、分布、定位及分化困難。綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是近年來細(xì)胞標(biāo)記的主要技術(shù)[2]，但GFP慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記的細(xì)胞，其GFP表達(dá)存在實(shí)效性極不穩(wěn)定、易熒光淬滅的缺陷，而GFP-BMSC具有綠色熒光蛋白表達(dá)穩(wěn)定、免疫原性較低等特性，為干細(xì)胞體內(nèi)示蹤提供了良好的條件[3-4]。建立完善的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠BMSC的培養(yǎng)體系，是獲得GFPBMSC并用于相關(guān)研究的前提和基礎(chǔ)。

圖3 小鼠BMSC誘導(dǎo)潛能結(jié)果

人類和大鼠BMSC在傳代過程中，可以用0.25%胰酶消化2 min左右便可使細(xì)胞脫落[5-6]，而GFP小鼠的BMSC胰酶消化時(shí)間尚不確定，胰酶消化時(shí)間過短，GFP-BMSC難以自動(dòng)脫落；而消化時(shí)間過長，胰酶過度與細(xì)胞接觸，可破壞細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞雙層膜，導(dǎo)致細(xì)胞破壞、甚至死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胰酶消化5 min時(shí)，大部分細(xì)胞處于貼壁狀態(tài)，只有少量細(xì)胞懸浮，不符合細(xì)胞傳代要求；在胰酶消化時(shí)間為20 min時(shí)，細(xì)胞全部脫落，但是二次貼壁后，細(xì)胞死亡碎片較多且細(xì)胞形態(tài)不一，不成梭形，不滿足干細(xì)胞的形態(tài)；而在胰酶消化時(shí)間為10、15 min時(shí)，大部分細(xì)胞變成圓形、脫落，符合傳代要求，且二次貼壁后，細(xì)胞狀態(tài)良好、呈梭形，具有BMSC的基本形態(tài)，誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示具有成脂、成骨、成軟骨的誘導(dǎo)分化能力。結(jié)果說明，用胰酶消化10～15 min不會(huì)破壞 GFP-BMSC的細(xì)胞形態(tài)、傳代生長特性及分化能力。

綜上所述，0.25%胰酶與底物GFP-BMSC的最佳消化時(shí)間是10～15 min。相比于人和大鼠消化只需要2 min而言，GFP-BMSC的消化時(shí)間是其5～8倍，這一現(xiàn)象可能與其種屬遺傳特性及轉(zhuǎn)GFP基因有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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