李慶杰，包海鷹,2，圖力古爾，李 玉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心,吉林 長春 130118; 2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長春 130118)

粗毛纖孔菌[(Inonotushispidus(Bull.:Fr.)P.Karst]為擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、繡革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纖孔菌屬(Ionnouts)藥用真菌，目前發(fā)現(xiàn)其主要寄生于桑樹、楊樹、榆樹、水曲柳、槭樹和胡桃楸等樹種上[1-2]。在我國新疆、吉林、黑龍江、遼寧和內(nèi)蒙古等地均有分布[3]。粗毛纖孔菌被國內(nèi)學(xué)者考證為桑黃[4-5]。研究[6-8]表明：粗毛纖孔菌富含多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化和抑菌等功效。

在新疆維吾爾自治區(qū)將生長在桑樹上的粗毛纖孔菌稱為桑黃。古代本草記載桑黃具有活血止痛、清熱解毒的功效[3]?！端幮哉摗分杏涊d“桑黃，性甘辛，無毒。治女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”，是治療月經(jīng)病的傳統(tǒng)藥材[9]，但目前，尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道粗毛纖孔菌具有治“女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”的藥理作用。本文作者通過分時間段采集，得到了寄生于不同樹種上的粗毛纖孔菌子實體，擬探討生長在不同樹種上的粗毛纖孔菌是否對寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)產(chǎn)生影響，為粗毛纖孔菌是否為古代本草記載的“桑黃”提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

SPF級Wistar大鼠180只，雌雄各半，體質(zhì)量220～250 g，動物使用許可證號：SCXK-(遼)2015-0001，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。6種粗毛纖孔菌子實體分別采自吉林省和新疆維吾爾自治區(qū)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)圖力古爾教授鑒定，具體信息見表1。本文作者將6個樣品命名為S1～S6：S1(黑色，寄生于水曲柳)，S2(黑色，寄生于蒙古黃榆)，S3(黃色，寄生于水曲柳)，S4(黃色，寄生于桑樹)，S5(黃色，寄生于楊樹)，S6(黃色，寄生于蒙古黃榆)。6份粗毛纖孔菌子實體分別用10倍量水煎煮2次，每次2 h，煎煮液濃縮，凍干，粉碎，得到提取干膏粉，作為實驗用樣品。陽性對照藥品為復(fù)方丹參片(廣東白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：20160903)。鹽酸腎上腺素注射液[遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國)有限公司，批號：111102)]。

表1 粗毛纖孔菌子實體來源信息

1.2 主要儀器

血液流變測試儀(BT-300)購自北京博萊特醫(yī)藥技術(shù)有限公司，高效液相色譜儀(島津 LC-20A)購自日本島津公司。

1.3 動物分組及給藥

將實驗大鼠隨機分為正常對照組、血瘀模型組、陽性對照組和低、高劑量粗毛纖孔菌子實體(S1～S6)組，共15組，每組12只大鼠。正常對照組和模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。低劑量粗毛纖孔菌子實體組大鼠每日給藥量相當(dāng)于生藥5.2 g·kg-1，高劑量粗毛纖孔菌子實體組大鼠每日給藥量相當(dāng)于生藥7.8 g·kg-1，陽性對照組大鼠按服用說明計算給予相應(yīng)劑量復(fù)方丹參片。每天給藥1次，連續(xù)灌胃給藥7 d。

1.4 大鼠血瘀證模型制備[10-11]

于末次給藥后30 min，除正常對照組外，其他各組大鼠均經(jīng)皮下注射鹽酸腎上腺素注射液(1 mg·kg-1)。2 h后，將動物放入4℃冰水中浸泡5 min取出。2 h后，再次皮下注射相同劑量鹽酸腎上腺素。禁食20 h后，腹腔注射20%烏來糖(5 mL·kg-1)麻醉，經(jīng)腹主動脈穿刺取血3 mL，以0.1%肝素抗凝。取其中1 mL全血用血液流變儀檢測全血黏度(mPa.s)；其余抗凝血液以3 000 r·min-1離心15 min，取血漿1 mL用血液流變儀檢測血漿黏度(mPa.s)。

1.5 譜效關(guān)系分析實驗

1.5.1 溶液配制 供試品溶液：稱取粉碎過40目篩的粗毛纖孔菌子實體10 g，加甲醇超聲處理4次，每次30 min，每次加甲醇10倍量，濾過，濾液合并，蒸干，再加30 mL蒸餾水溶解，用石油醚(60℃～90℃)萃取3次，每次30 mL，棄去石油醚層，水層用乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定溶至5 mL容量瓶中，濾過即得。對照品溶液：稱取phellibaumin A、phelligridin C(反式)、phelligridin D和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one自制對照品，置于10 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，配成0.2 g·L-1的對照品溶液。

1.5.2 色譜條件[12-13]流動相A(0.1%甲酸溶液)，流動相B(甲醇)，采用梯度洗脫，具體梯度洗脫程序見表2。菲羅門色譜柱(Kinetex 2.6u XB-C18 100A，美國菲羅門公司),柱溫30℃,流速1.0 mL·min-1,二極管陣列檢測器,檢測波長400 nm,進(jìn)樣量10 μL。

1.5.3 譜效關(guān)系分析 對6個不同來源樣品成分進(jìn)行色譜分析，對每個樣品中特征峰的量化峰面積和對寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)的影響應(yīng)用灰色系統(tǒng)理論建模軟件(GSTAV 7.0)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，相關(guān)系數(shù)>0.8表明具有相關(guān)性[14-15]

表2 梯度洗脫序列時間表

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 粗毛纖孔菌子實體煎煮后出膏率

因生長環(huán)境不同，不同樹種上生長的粗毛纖孔菌水提取出膏率有明顯差異，其中以蒙古黃榆樹為最高，楊樹最低。不同采集時間樣品比較，自然脫落、黑色的粗毛纖孔菌子實體出膏率均明顯低于黃色子實體，表明粗毛纖孔菌的采收時間或生長環(huán)境對粗毛纖孔菌品質(zhì)有較大影響。見表3。

表3 粗毛纖孔菌煎煮出膏率

2.2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組大鼠血漿黏度和全血黏度均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，寄生于桑樹、楊樹、水曲柳和蒙古黃榆樹的高劑量粗毛纖孔菌黃色子實體(S3～S6)組大鼠血漿黏度和全血黏度均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，寄生于同一樹種的粗毛纖孔菌黑色子實體(S1和S2)組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)無明顯變化(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

Tab.4 Hemorheological indexes of rats in various groups

表4 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)

GroupBloodviscosity180s-1100s-130s-13s-1Plasmaviscosity(180s-1)Normalcontrol8．32±1．279．80±1．0215．37±2．1862．90±8．90458．58±91．87Model8．63±1．61?10．76±1．17?17．43±2．40?75．17±8．84?504．10±85．06?Positivedrug8．43±0．70△10．18±0．98△15．94±3．04△67．20±9．79△476．64±93．02△S1 Highdose8．67±0．7210．41±1．4717．87±2．4174．49±8．57497．68±85．31 Lowdose8．79±2．6410．21±3．6317．88±7．4574．45±8．53500．82±85．94S2 Highdose8．78±1．7410．52±2．2417．7±3．5574．12±9．83499．49±76．72 Lowdose8．74±1．1310．72±1．7617．93±4．0674．15±7．62496．32±68．78S3 Highdose8．51±2．42△10．33±0．50△16．54±6．66△70．40±9．89△479．44±130．24△ Lowdose8．69±1．7910．73±1．1217．22±5．3375．31±7．50491．41±91．58S4 Highdose8．49±2．58△10．47±0．46△16．87±4．59△72．43±7．72△488．46±65．91△ Lowdose8．65±2．5110．96±1．6117．15±5．3574．14±7．86500．93±85．31S5 Highdose8．46±0．68△10．31±0．78△16．69±2．07△69．21±8．51△484．09±65．03△ Lowdose8．59±0．8710．61±1．3017．46±2．7274．43±8．41502．45±72．93S6 Highdose8．50±1．91△10．39±1．14△17．09±6．14△72．78±9．61△480．26±54．90△ Lowdose8．66±1．7310．69±2．2217．85±4．6875．58±9．19503．96±61．76

*P<0. 05 compared with normal control group;△P<0. 05 compared with model group.

2.3 粗毛纖孔菌成分對寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響的譜效關(guān)系分析

利用1.5.2中的色譜條件對6個不同來源樣品(S1～S6)的成分進(jìn)行色譜分析，應(yīng)用灰色系統(tǒng)理論建模軟件(GSTAV 7.0) 對其中32個特征峰的量化峰面積和對寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見表5。不同來源粗毛纖孔菌色譜峰差異情況見圖1。在本研究的色譜條件下，32個特征峰為S1、S2、S3、S4、S5、S6樣品共有峰，通過觀察發(fā)現(xiàn)S1樣品中的主要色譜峰集中在100～133 min，S2樣品中的主要色譜峰集中在100～120 min，S3、S4、S5、S6樣品中的主要色譜峰分布較分散，通過對特征峰的量化峰面積和對寒凝血瘀證大鼠血液流變學(xué)影響進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析得出，保留時間為73、75、79、81、90、94、98、100、146、161和167 min的各峰與血漿黏度變化有明顯相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均>0.8，樣品S1和S2的主要色譜峰保留時間為101、105、109、115、118、125和129 min，相關(guān)系數(shù)均<0.5，灰色系統(tǒng)理論建模軟件中規(guī)定相關(guān)系數(shù)小于0.8被定義為不具有相關(guān)性，因此樣品S1和S2中保留時間在100～120 min的主要色譜峰對活血化瘀作用所起的作用不大，而起活血化瘀作用的色譜峰分布在53～100 min和140～160 min，樣品S3、S4、S5、S6中主要色譜峰均分布在這2個時間區(qū)間，經(jīng)過保留時間對比，確定保留時間為73、75、79和81 min的色譜峰分別為phellibauminA、phelligridinD、phelligridinC(反式)和3′4′-dihydroxy-5-[(11-hydroxyphenyl)-6,7-vinyl]-3,5-dioxa-fluoren-5-one。

表5 各特征峰與藥效的相關(guān)性

S1：Black (Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S2： Black (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica);S3： Yellow(Parasitize in Fraxinus mandschurica Rupr);S4： Yellow(Parasitize in Morus alba L.)；S5：Yellow (Parasitize in Populus L)；S6：Yellow (Parasitize in Ulmus macrocarpa var. mongolica).

3 討 論

“桑黃”是目前國際公認(rèn)的具有良好的抗癌及提高人體免疫力活性的藥用真菌，但是不同的國家、不同的地區(qū)對“桑黃”的認(rèn)識有差異[16]。目前盡管有許多學(xué)者致力于“桑黃”的正本清源，但是藥材品種上仍然存在混亂現(xiàn)象，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，與古代文獻(xiàn)的記載不符。古代文獻(xiàn)對“桑黃”的藥效記載：“黑者，主女子漏下赤白汁，血病，癥瘕積聚，腹痛，陰陽寒熱無子。療止久泄，益氣不饑。其金色者，療痹飲，積聚，腹病，金瘡”。而這些疾病與現(xiàn)代的很多體內(nèi)腫瘤或癌性胸腹水、免疫功能低下等癥相當(dāng)?，F(xiàn)代研究[17-22]表明：粗毛纖孔菌有很好的抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、抑菌和增強免疫作用。由此看來，“桑黃”在古書中記載功效與粗毛纖孔菌的藥理作用有相同之處。為進(jìn)一步證明粗毛纖孔菌即為“桑黃”，針對《藥性論》中“桑黃，性甘辛，無毒，治女子崩中帶下，月閉血凝，產(chǎn)后血凝”這一記載，本研究選擇寒凝血瘀模型大鼠對粗毛纖孔菌的活血化瘀作用進(jìn)行考察，結(jié)果表明：寄生于不同樹種的粗毛纖孔菌黃褐色子實體具有活血化瘀的功效，與《藥性論》《大觀本草》中“桑黃”的功效記載相符；寄生于不同樹種的散落于地面的粗毛纖孔菌黑色子實體雖然也具有一定活血化瘀功效，但未能改變寒凝血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)。譜效關(guān)系研究表明:S1和S2樣品的主要色譜峰保留時間為100～130 min，該區(qū)間的色譜峰所代表化學(xué)成分與粗毛纖孔菌活血化瘀活性不具有相關(guān)性；S3、S4、S5和S6主要色譜峰保留時間在53～100 min和140～160 min，該區(qū)域間的色譜峰所代表化學(xué)成分與粗毛纖孔菌活血化瘀活性密切相關(guān)。分析表明該區(qū)域色譜峰主要為酚酸類化合物，初步證明粗毛纖孔菌中具有活血化瘀作用的成分為酚酸類物質(zhì)，不同樹種間粗毛纖孔菌活性比較無明顯差異，同一樹種自然成熟仍長在樹干的子實體與脫落至地面變黑的子實體間活性有明顯差異，脫落至地面的子實體可能為非正常成熟脫落地面至黑或隨正常成熟但脫落地面后經(jīng)雨淋等因素引起其中成分變化，導(dǎo)致活血化瘀作用減弱。

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