王興麗 汪開(kāi)毓 王二龍 王 濤 楊 倩 陳德芳 耿 毅

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 成都 611130; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 成都 611130)

海豚鏈球菌(Streptococcus iniae, 曾用名Streptococcus shiloi), 隸屬于鏈球菌科(Streptococcaceae),鏈球菌屬(Streptococcus)。自1976年P(guān)ier和Madin[1]從亞馬遜河河豚皮膚中初次分離出海豚鏈球菌后,該菌便在北美洲、中東、亞太地區(qū)以及歐洲蔓延開(kāi)來(lái), 主要感染淡水和海水魚(yú)[2—5]。曾經(jīng)的海豚鏈球菌被認(rèn)為對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲙不敏感, 但是最近幾年,海豚鏈球菌從斑點(diǎn)叉尾鲙上頻頻被分離出來(lái), 且在中國(guó)多地出現(xiàn)暴發(fā)性流行, 對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲙的健康養(yǎng)殖存在一定的威脅[6]。研究表明, 海豚鏈球菌可引起斑點(diǎn)叉尾鲙異常游動(dòng), 體色變深, 鰭條出血, 腹部膨大; 剖解可見(jiàn)內(nèi)臟腫大、充血, 積滿腹水, 腸炎等[7]。

海豚鏈球菌絲氨酸富集蛋白(Srr)是鏈球菌中一種重要的蛋白(GenBank登錄號(hào): CP005941.1, 對(duì)應(yīng)蛋白登錄號(hào)AGM97982.1), 具有一個(gè)3618 bp的開(kāi)放閱讀框, 預(yù)計(jì)編碼蛋白125 kD, 且在C-端的第251—405個(gè)氨基酸殘基之間含有一個(gè)碳端細(xì)菌纖維蛋白原結(jié)合黏附素超家族(SdeG_C_C_supperfamily)的保守結(jié)構(gòu)域[8]。研究表明, Srr可能通過(guò)調(diào)控一些重要因子來(lái)影響細(xì)菌致病過(guò)程中的黏附、定殖以及在宿主體內(nèi)存活等活動(dòng), 從而使細(xì)菌達(dá)到在宿主體內(nèi)生存、繁殖和致病的目的[9,10]。由此可見(jiàn)Srr相關(guān)蛋白在鏈球菌對(duì)宿主的感染中起著相當(dāng)重要的作用, 但目前關(guān)于海豚鏈球菌Srr蛋白疫苗的研究相對(duì)較少, 其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前世界多數(shù)漁用疫苗是通過(guò)注射進(jìn)行免疫,該方式不僅存在工作量大, 且易對(duì)魚(yú)體造成應(yīng)激等缺點(diǎn); 相對(duì)于注射免疫, 口服免疫不僅操作方便, 且對(duì)魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)小, 成為魚(yú)類免疫最有前景的免疫方式之一, 而口服疫苗預(yù)防海豚鏈球菌病的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用海藻酸鈉和殼聚糖2種天然高分子聚合物作為海豚鏈球菌Srr蛋白的包被載體, 對(duì)微球制備后的包封率、載藥率以及包被蛋白的抗原性進(jìn)行了檢測(cè), 并通過(guò)微球拌飼投喂方式免疫斑點(diǎn)叉尾鲙, 利用免疫后的血清對(duì)其免疫指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定, 最后通過(guò)相對(duì)保護(hù)率的測(cè)定綜合判斷該疫苗有望成為斑點(diǎn)叉尾鲙預(yù)防海豚鏈球菌病的候選疫苗, 且為海豚鏈球菌口服疫苗的研制及應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑點(diǎn)叉尾鲙源海豚鏈球菌(DGX07, 登錄號(hào):FJ951434)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心分離保存。海豚鏈球菌Srr蛋白由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心進(jìn)行生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)、純化并保存(70 kD左右)。海藻酸鈉、殼聚糖購(gòu)自上海生物工程有限公司, 食品級(jí)液體石蠟、Span-80、氯化鈣和乙酸鈉等均購(gòu)自成都科龍?jiān)噭S。健康斑點(diǎn)叉尾鲙購(gòu)自四川成都某斑點(diǎn)叉尾鲙養(yǎng)殖基地, 體重(50±5) g。HRP goat anti-rabbit IgG購(gòu)自百奇生物科技有限公司; 兔抗斑點(diǎn)叉尾鲙IgM血清由本實(shí)驗(yàn)室提供; 可溶型單組分TMB底物溶液購(gòu)自北京天根生化科技有限公司; 總蛋白檢測(cè)試劑盒、溶菌酶檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司。

1.2 海藻酸鈉-殼聚糖-海豚鏈球菌Srr蛋白微球疫苗以及空微球的制備

1.5 %濃度海藻酸鈉溶液與2 mg/mL的Srr蛋白(空微球的制備是將Srr蛋白替換為PBS)充分混合,將混合溶液按4鯰6緩慢滴加到食品級(jí)液體石蠟(含乳化劑Span-80和硬脂酸鎂)中, 1800 r/min攪拌, 待充分乳化后, 將8%濃度(M/V)CaCl2溶液加入乳化好的海藻酸鈉蛋白中鈣化形成微球, 8000 r/min離心5min收集沉淀, 用0.01 mol/L的乙酸鈉(pH=4.0)洗滌液清洗3次, 再與0.8%濃度的殼聚糖(pH=5的乙酸鈉配制)1800 r/min混勻10min, 8000 r/min離心5min收集沉淀, 同上洗滌3次后相同緩沖液重懸, 加入等體積的2%的甘露醇攪拌均勻, 凍干保存。

1.3 微球粒徑、包封率、載藥率以及抗原性檢測(cè)

微球粒徑參考陽(yáng)磊等[11]的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算微球粒徑。

包封率及載藥率將收集到的一定量的微球重懸, 取3 mL微球懸液離心, 將得到的微球加入到適量PBS溶液中超聲破碎, 充分溶解。再將溶液10000 r/min離心10min, 將所收集的上清液用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度, 按照公式計(jì)算包封效率和載藥率:

包封效率(%)=(實(shí)際微球中的蛋白質(zhì)量/理論微球中蛋白質(zhì)量)×100%

載藥率(%)=(實(shí)際微球中的蛋白質(zhì)量/最后測(cè)得總質(zhì)量)×100%

抗原性取一部分上清液利用兔抗組氨酸標(biāo)簽抗體(1鯰200稀釋)和兔抗海豚鏈球菌抗體進(jìn)行Western-Blot, 室驗(yàn)操作參考Jiang等[12]的方法。

1.4 分組及免疫

實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)剖檢5尾斑點(diǎn)叉尾鲙檢查其健康情況, 隨后將健康斑點(diǎn)叉尾鲙240尾隨機(jī)分為4組, 具體分組見(jiàn)表 1, 以下各組簡(jiǎn)稱為Srr組、Srr微球組、空微球組以及對(duì)照組。各組實(shí)驗(yàn)前均馴養(yǎng)14d, 馴養(yǎng)后的魚(yú)能每日進(jìn)料情況良好。14d后, 將制備的微球疫苗定量與粉碎后的飼料粉末混合后再成型、干燥, 按照魚(yú)體重的2%進(jìn)行投喂, 各組均連續(xù)投喂14d。

1.5 樣品采集與處理

免疫后第1—8周每周定時(shí)在每組隨機(jī)選取5尾通過(guò)靜脈采血0.2 mL, 血液室溫靜置2h后移入4℃冰箱過(guò)夜, 次日4000 r/min離心10min, 收集上清,-20℃保存。于免疫后第4周每組隨機(jī)選取15尾斑點(diǎn)叉尾鲙進(jìn)行S. iniae攻毒, 攻毒后24h和48h每組隨機(jī)選取6尾魚(yú)分別取其頭腎和脾臟, 液氮研磨提取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)

方法參照任燕等[13]的方法通過(guò)間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。

表 1 免疫程序Tab. 1 Immunization program

1.7 非特異性指標(biāo)的檢測(cè)與分析

血清總蛋白、T-SOD以及溶菌酶的測(cè)定參照南京建成生物有限公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 并按說(shuō)明書(shū)公式進(jìn)行計(jì)算, 所得結(jié)果利用SPSS18.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 比較各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的顯著性差異, 其中P＞0.05 為差異不顯著, 0.01＜P＜0.05為差異顯著,P＜0.0l為差異極顯著。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

參照Yang等[14]的引物設(shè)計(jì)合成斑點(diǎn)叉尾鲙EF-1α、IFN-γ、TNF-α、CD4L-2、MHC-IIβ的引物, 以EF-1α因子為內(nèi)參基因, 采用熒光定量PCR測(cè)定斑點(diǎn)叉尾鲙IFN-γ、TNF-α、CD4L-2、MHCIIβ的表達(dá)影響。參照ABI公司SYBR@Green PCR Supermix染料說(shuō)明書(shū)配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)后進(jìn)行PCR產(chǎn)物溶解曲線分析, 鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)樣品有3個(gè)重復(fù)(n=3), 結(jié)果取其循環(huán)閾值(Ct)的平均值, 利用公式RQ=2-ΔΔCt計(jì)算斑點(diǎn)叉尾鲙頭腎和脾臟中IFN-γ、TNF-α、CD4L和MHC-Ⅱ基因的相對(duì)表達(dá)量。其中ΔCt=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值, ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。所得結(jié)果利用SPSS18.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Mean±SD表示, 各不同組織ΔCt值釆用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＞0.05為差異不顯著, 0.01＜P＜0.05 為差異顯著,P＜0.0l為差異極顯著。

1.9 攻毒實(shí)驗(yàn)及相對(duì)保護(hù)率的測(cè)定

在免疫后第4周, 利用S.iniae(6×107cfu/mL)[7]對(duì)各組斑點(diǎn)叉尾鲙進(jìn)行攻毒, 每組隨機(jī)選取20尾,腹腔注射0.2 mL/尾, 記錄攻毒后14d內(nèi)各組魚(yú)的發(fā)病及死亡情況, 另取瀕死魚(yú)的肝、腎進(jìn)行接菌培養(yǎng),確定病原菌種類。并計(jì)算相對(duì)保護(hù)率(Relative Percent Survival, RPS), 按下列公式計(jì)算:

RPS(%)=[(對(duì)照組死亡率-免疫組死亡率)/對(duì)照組死亡率]×100%

2 結(jié)果

2.1 微球疫苗包封率、載藥率以及抗原性檢測(cè)

利用顯微鏡對(duì)制備微球進(jìn)行觀察, 制得的微球形態(tài)呈圓形或橢圓形(圖1), 粒徑較為均-[(4.26±1.13) μm]。通過(guò)超聲破碎后測(cè)得Srr蛋白微球疫苗的包封率為92.38%, 載藥率為19.41%。Westernblot結(jié)果表明Srr蛋白微球與兔抗海豚鏈球菌抗體/兔抗組氨酸標(biāo)簽抗體均能結(jié)合, 在70 kD大小處有明顯的條帶, 表明微球中的蛋白具有較好的抗原性。

2.2 血清抗體水平

本實(shí)驗(yàn)采用了間接ELISA方法測(cè)定了Srr組、Srr微球組、空微球組以及對(duì)照組免疫后第1—8周的抗體消長(zhǎng)規(guī)律(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn), 實(shí)驗(yàn)組可在第2周檢測(cè)到抗體效價(jià), 但是檢測(cè)值較低, 隨后開(kāi)始增加, Srr組和Srr微球組均在第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組均達(dá)到峰值, 分別為0.85和0.99。從第5周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)下降峰, 而對(duì)照組始終無(wú)特異性檢出。雖然空微球組也有抗體效價(jià)的檢出, 但是其持續(xù)時(shí)間較短。

圖1 微球的形態(tài)以及Western-blot結(jié)果Fig. 1 The shape of alginate microparticles and result of Western-blotting analysis

2.3 血清總蛋白檢測(cè)結(jié)果

如圖3所示, 在免疫后的前3周, Srr組和Srr微球組血清總蛋白含量均極顯著升高(P＜0.01), 而空微球組和對(duì)照組均無(wú)明顯差異。在實(shí)驗(yàn)的第4周, 所有實(shí)驗(yàn)組血清總蛋白含量極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組, 其中Srr微球組血清總蛋白含量最高。第5周后出現(xiàn)所有實(shí)驗(yàn)組均有所下降, 且均在第6周以后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,Srr微球組血清蛋白含量一直高于其他組。

圖2 斑點(diǎn)叉尾鲙血清中的抗體水平Fig. 2 The antibody level in the serum of Ictalurus punctatus

圖3 斑點(diǎn)叉尾鲙血清總蛋白含量變化Fig. 3 Changes of total protein content in serum of Ictalurus punctatus

2.4 血清T-SOD活力檢測(cè)結(jié)果

如圖4所示, 免疫后各實(shí)驗(yàn)組T-SOD活力均呈上升趨勢(shì), 在第3、4周時(shí)Srr組和Srr微球組的酶活力均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01), 且Srr微球組在第3周出現(xiàn)峰值, Srr組在第4周出現(xiàn)峰值。峰值后各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)下降峰, 但在第5周后便基本維持穩(wěn)定。空微球組僅在第5周與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。

2.5 血清溶菌酶活力檢測(cè)結(jié)果

如圖5所示, Srr微球組血清溶菌酶活力從免疫后第1—8周均極顯著(P＜0.01)高于對(duì)照組, 且在第2周達(dá)到峰值。Srr組在第4周達(dá)到峰值, 除了第2周,其余實(shí)驗(yàn)期間均顯著或極顯著高于對(duì)照組?？瘴⑶虬唤M在第6、7、8周顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于對(duì)照組, 但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間皆低于Srr組和Srr微球組。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間, 對(duì)照組血清溶菌酶活力相對(duì)穩(wěn)定在105—120 U/mL。

圖4 斑點(diǎn)叉尾鲙血清總超氧化物歧化酶活力變化Fig. 4 Changes of T-SOD activity in serum of Ictalurus punctatus

圖5 斑點(diǎn)叉尾鲙血清溶菌酶活力變化Fig. 5 Changes of lysozyme activity in serum of Ictalurus punctatus

2.6 微球疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲖頭腎和脾臟免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

海豚鏈球菌攻毒后24h(圖6A), Srr微球組的的IFN-γ基因表現(xiàn)出極大的上調(diào), 顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組, 而Srr組和空微球組雖也有上調(diào), 但與對(duì)照組不存在顯著性關(guān)系(P＞0.05); Srr微球組的TNF-α基因的表達(dá)量顯著(P＜0.05)或者極顯著(P＜0.01)的高于其他實(shí)驗(yàn)組; 所有實(shí)驗(yàn)組的CD4L-2基因和MHC-Ⅱβ基因的表達(dá)量不存在顯著性關(guān)系(P＞0.05), 但是均略高于對(duì)照組有上調(diào)趨勢(shì)。攻毒后48h的脾臟(圖6B), Srr組和Srr微球組IFN-γ基因的表達(dá)量均顯著(P＜0.05)高于空微球組和對(duì)照組;TNF-α的表達(dá)均較低, 但是Srr組和Srr微球組均顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于空微球組和對(duì)照組; Srr微球組CD4L-2基因的表達(dá)顯著(P＜0.05)高于空微球組和對(duì)照組; Srr微球組MHC-Ⅱβ基因極顯著(P＜0.01)高于Srr組、空微球組以及對(duì)照組, Srr組與空微球組和對(duì)照組之間存在顯著差異(P＜0.05)。

海豚鏈球菌攻毒后24h的頭腎(圖6C), Srr微球組的IFN-γ、CD4L-2和MHC-Ⅱβ基因表達(dá)量皆顯著(P＜0.05)高于對(duì)照組,TNF-α基因表達(dá)量極顯著(P＜0.05)高于其他實(shí)驗(yàn)組,CD4L-2基因的表達(dá)量顯著(P＜0.05)高于空微球和對(duì)照組,MHC-Ⅱβ的表達(dá)量顯著(P＜0.05)高于空微球組。攻毒后48h的頭腎(圖6D), 斑點(diǎn)叉尾鲙頭腎中IFN-γ、TNF-α和MHC-Ⅱβ基因的表達(dá)在Srr微球組極顯著(P＜0.01)高于空微球組和對(duì)照組,CD4L-2的表達(dá)顯著高于空微球組和對(duì)照組,IFN-γ的表達(dá)與Srr組存在顯著(P＜0.05)差異,TNF-α的表達(dá)與Srr組存在極顯著(P＜0.01)差異,MHC-Ⅱβ基因的表達(dá)顯著(P＜0.05)高于Srr組。

圖6 海豚鏈球菌攻毒后24h/48h斑點(diǎn)叉尾鲙脾臟/頭腎中免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression level of immune genes in spleen /kidney of vaccinated I. punctatus at 24h/48h post-challenge by S. iniae

2.7 微球疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲖的保護(hù)效果

斑點(diǎn)叉尾鲙實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)剖解檢測(cè), 均為正常健康斑點(diǎn)叉尾鲙。免疫后第4周進(jìn)行攻毒, 對(duì)瀕死的斑點(diǎn)叉尾鲙接菌檢測(cè), 確定致病菌為海豚鏈球菌;海豚鏈球菌攻毒14d后, Srr組和Srr微球組分別獲得抗海豚鏈球菌相對(duì)免疫保護(hù)率為35%和60%, 而空微球組和對(duì)照組在攻毒后14d內(nèi)全部死亡(圖7)。

3 討論

海藻酸鈉是一種聚陰離子多聚物, 殼聚糖是一種聚陽(yáng)離子聚合物, 兩者接觸后發(fā)生靜電反應(yīng), 可在海藻酸鈉表面形成一層聚電解質(zhì)膜, 從而緊密包裹蛋白, 使微球的穩(wěn)定性和載藥量都得到顯著提高[15]。本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉和殼聚糖兩種天然高分子聚合物為載體包被海豚鏈球菌Srr蛋白, 利用乳化法制備海藻酸鈉-殼聚糖-海豚鏈球Srr蛋白微球口服疫苗, 獲得了較高的包封率和載藥率; 通過(guò)Western-blot對(duì)微球釋放蛋白的抗原性進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果表現(xiàn)出較好的抗原性, 由此可見(jiàn)該制備方法較為溫和, 可以保證包裹抗原的完整性。

圖7 攻毒后的存活率Fig. 7 Survival rate after chanllenge

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)自1971年被Engvall和Perlmann創(chuàng)建以來(lái), 該方法以操作簡(jiǎn)單, 檢測(cè)樣本量大, 敏感度較高以及特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)逐步成為血清抗體效價(jià)檢測(cè)的重要方法[16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)間接ELISA檢測(cè)了斑點(diǎn)叉尾鲙在免疫后的血清抗體水平。Srr組和Srr微球組在實(shí)驗(yàn)中均能檢測(cè)到特異性抗體, 且峰值均出現(xiàn)在了第4周, 分別為0.85和0.99, 由此說(shuō)明微球疫苗Srr組和Srr微球組均能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答; 空微球雖然也能檢測(cè)到特異性抗體, 但是抗體效價(jià)相對(duì)較低, 推測(cè)可能是殼聚糖和海藻酸鈉本身可作為免疫增強(qiáng)劑的原因[17,18]; 而對(duì)照組始終沒(méi)有檢測(cè)出特異性抗體。最后通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)保護(hù)率,Srr組和Srr微球組分別為35%和60%, 由此可見(jiàn)Srr蛋白對(duì)機(jī)體具有一定的保護(hù)效果, 且Srr微球組的保護(hù)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Srr直接拌飼投喂組, 推測(cè)是海藻酸鈉-殼聚糖的包裹作用通過(guò)酸堿反應(yīng)控制藥物的釋放速度, 減少了Srr蛋白在機(jī)體胃腸酸堿環(huán)境中的損失, 使蛋白更有效地被腸道吸收發(fā)揮作用。

非特異性免疫在作為低等脊椎動(dòng)物的魚(yú)類疫系統(tǒng)中起著重要的作用。血清總蛋白的成分和含量與魚(yú)體的健康狀況緊密相連[19]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲙免疫包被的口服微球疫苗后, 實(shí)驗(yàn)組血清總蛋白含量均顯著升高, 且Srr組和Srr微球組在第4周達(dá)到最高值, 說(shuō)明Srr蛋白對(duì)機(jī)體增強(qiáng)免疫能力具有一定的積極意義。超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的重要抗氧化酶, 對(duì)平衡機(jī)體氧化作用和抗氧化作用中必不可少, 且在清除O2-自由基, 增強(qiáng)機(jī)體防御能力中起到了重要的作用[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, SOD的活力與機(jī)體免疫水平具有緊密的關(guān)系, Srr微球組免疫后SOD活力逐步增強(qiáng), 并在第3周和第4周極顯著高于對(duì)照組, 隨后出現(xiàn)下降,魚(yú)體免疫力相應(yīng)有所下降。由此推測(cè)疫苗免疫斑點(diǎn)叉尾鲙后能夠刺激魚(yú)體識(shí)別抗原, 促使SOD分泌, 維持機(jī)體氧化物和抗氧化物的平衡, 達(dá)到保護(hù)魚(yú)體的目的。溶菌酶(LSZ)是魚(yú)類抵御外來(lái)病原感染的重要非特異性免疫防御因子之一, 主要存在魚(yú)類的黏液、血清以及巨噬細(xì)胞中, 能夠病原微生物,保護(hù)魚(yú)體[21]。在本實(shí)驗(yàn)中, 免疫后各實(shí)驗(yàn)組的溶菌酶活性均有提高, 且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間, Srr微球組的溶菌酶活性一直顯著(P＜0.05)或者極顯著(P＜0.01)的高于對(duì)照組。由此可推測(cè)溶菌酶的高活性能夠提高魚(yú)體抵御病原微生物的能力。

本實(shí)驗(yàn)利用Real-time RCP方法探究了Srr蛋白疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲙免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響。TNF-α、IFN-γ、MHC-Ⅱβ和CD4L-2基因在機(jī)體脾臟和頭腎的表達(dá)情況是疫苗效果評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中Srr微球組免疫攻毒后的脾臟和頭腎中TNF-α、IFN-γ、CD4L-2和MHC-Ⅱβ因子的表達(dá)均明顯高于Srr組、空微球組以及對(duì)照組, 由此可推測(cè)Srr蛋白刺激了TNF-α因子調(diào)節(jié)趨化因子的產(chǎn)生,對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo), 并遷移到病原菌入侵部位發(fā)揮免疫功能[22,23], 同時(shí),IFN-γ因子的上調(diào)可能刺激了機(jī)體巨噬細(xì)胞對(duì)病原微生物的殺傷能力, 從而起到增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的作用[24], 推測(cè)Srr包被疫苗在增強(qiáng)魚(yú)體抵抗病原能力以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力起到了一定的作用。研究表明, 不僅海藻酸鈉和殼聚糖能發(fā)生靜電反應(yīng), 其微球進(jìn)入體內(nèi)后外膜殼聚糖上游離的氨基能與黏膜上皮細(xì)胞上帶負(fù)電的糖蛋白或細(xì)胞間緊密結(jié)合部分固有的負(fù)電荷也能發(fā)生靜電作用, 從而打開(kāi)了上皮細(xì)胞之間緊密連接, 促進(jìn)了藥物的吸收[25—27], 且釋放的藥物可通過(guò)跨細(xì)胞途徑或者細(xì)胞旁路途徑穿過(guò)上皮細(xì)胞, 提高免疫效果[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Srr蛋白對(duì)斑點(diǎn)叉尾鲙海豚鏈球菌病具有一定的防御作用, 同時(shí)Srr組和Srr微球組的免疫效果差異不僅體現(xiàn)了海藻酸鈉-殼聚糖對(duì)蛋白藥物的保護(hù)作用, 也體現(xiàn)了這兩種高分子載體對(duì)蛋白藥物的促進(jìn)吸收作用。

[1]Pier G B, Madin S H.Streptococcus iniaesp. nov., a beta-hemolyticStreptococcusisolated from an Amazon Freshwater Dolphin,Inia geoffrensis[J].International Journal of Systematic Bacteriology, 1976, 26(4): 545—553

[2]Agnew W, Barnes A C.Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination [J].Veterinary Microbiology, 2007, 122(1-2): 1—15

[3]Cheng S, Hu Y H, Jiao X D,et al. Identification and immunoprotective analysis of aStreptococcus iniaesubunit vaccine candidate [J].Vaccine, 2010, 28(14): 2636—2641

[4]Elaamri F. First report ofStreptococcus iniaein red porgy(Pagrus pagrus,L.) [J].Journal of Fish Diseases, 2010,33(11): 901—905

[5]Prettogiordano L G, Scarpassa J A, Barbosa A R,et al.Streptococcus iniae: an unusual important pathogen fish in Brazil [J].Journal of Aquaculture Research & Development, 2015, 6(9): 363

[6]Yu X L, Chen M, Li C,et al. Channel catfishIctalurus punctatusoutbreak infected by bacteriumStreptococcus iniae[J].Journal of Dalian Fisheries University, 2008,23(3): 185—191 [余曉麗, 陳明, 李超, 等. 斑點(diǎn)叉尾鲙暴發(fā)性海豚鏈球菌病的研究. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,23(3): 185—191]

[7]Chen D F, Wang K Y, Geng Y,et al.Streptococcus iniaeisolated from channel catfish (Ictalurus punctatus) in China [J].The Israeli Journal of Aquaculture. Bamidgeh,2011, 63(1): 63—70

[8]Fischetti V A, Pancholi V, Schneewind O. Conservation of a hexapeptide sequence in the anchor region of surface proteins from Gram-positive cocci [J].Molecular Microbiology, 1990, 4(9): 1603—1605

[9]Seifert K N, Adderson E E, Whiting A A,et al. A unique serine-rich repeat protein (Srr-2) and novel surface antigen (epsilon) associated with a virulent lineage of serotype IIIStreptococcus agalactiae[J].Microbiology, 2006,152(4): 1029—1040

[10]Zhou M, Zhang H, Zhu F,et al. Canonical SecA associates with an accessory secretory protein complex involved in biogenesis of a streptococcal serine-rich repeat glycoprotein [J].Journal of Bacteriology, 2011, 193(23):6560—6566

[11]Yang L, Wang K Y, Zhou Y,et al. The characteristics and immune efficacy of an oral microspheres vaccine ofYersinia ruckeri[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015,39(6): 1142—1149 [陽(yáng)磊, 汪開(kāi)毓, 周燕, 等. 魯氏耶爾森氏菌口服微球疫苗特性分析及免疫效果研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(6): 1142—1149]

[12]Jiang J, Zheng Z, Wang K,et al. Adjuvant immune enhancement of subunit vaccine encoding pSCPI ofStreptococcus iniaein channel catfish (Ictalurus punctatus) [J].International Journal of Molecular Sciences, 2015,16(12): 28001

[13]Ren Y, Zhang X J, Tao J F,et al. Preparation and immune effect of chitosan-alginate microcapsules containingVibrio harveyiantigen OmpK in orange-spotted groupers [J].Chinese Journal of Biologicals, 2015, 28(2):110—114 [任燕, 張小江, 陶家發(fā), 等. 殼聚糖-海藻酸鹽復(fù)合微囊疫苗的制備及其對(duì)斜帶石斑魚(yú)的口服免疫效果. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2015, 28(2): 110—114]

[14]Yang Q, Pan Y L, Wang K Y,et al. OmpN, outer membrane proteins ofEdwardsiella ictaluriare potential vaccine candidates for channel catfish (Ictalurus punctatus)[J].Molecular Immunology, 2016, 78: 1—8

[15]Morteza H, Kafshgari M, Khorram,et al. Reinforcement of chitosan nanoparticles obtained by an ionic cross-linking process [J].Iranian Polymer Journal, 2011, 20(5):445—456

[16]Li W M. Development and application of enzyme linked immuno sorbent assay technology [J].Journal of Hubei Vocational-Technical College, 2003, 6(4): 65—69 [李文敏. 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用. 湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 6(4): 65—69]

[17]Tan X D, Li Y, Zhang H Y,et al. Effects of sodium alginate on the immune response and the disease resistance ability of Chinese mitten crabEriocheir sinensis[J].Feed Industry, 2008, 29(6): 24—27 [譚夕東, 李義, 張紅英,等. 海藻酸鈉對(duì)中華絨螯蟹免疫功能及抗病力的影響.飼料工業(yè), 2008, 29(6): 24—27]

[18]Xiao Y Y, Xia Y T, Liu T F,et al. Effects of chitosan on growth performance and immunity of juvenile Russian sturgeon (Acipenser gueldenstardti) [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2017, 41(1): 114—120 [肖艷翼, 夏永濤, 劉騰飛, 等. 殼聚糖對(duì)俄羅斯鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)性能及免疫功能的影響. 水生生物學(xué)報(bào), 2017, 41(1): 114—120]

[19]Wu X J, Wang K Y, Yang L,et al. The immune effect of an oral microspheres vaccine againstEdwardsiella ictalurion channel catfish (Ictalurus punctatus) [J].Journal of Fisheries of China, 2016, 40(3): 404—413 [吳學(xué)婧, 汪開(kāi)毓, 陽(yáng)磊, 等. 鲙愛(ài)德華菌口服疫苗對(duì)斑點(diǎn)鲙的免疫效果. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2016, 40(3): 404—413]

[20]Chun-Xiang A I, Chen L Q, Gao L J,et al. Effect of vitamin C on SOD, ALP and ACP activities of Chinese mitten-handed crab,Eriocheir sinensis[J].Journal of Oceanography in Taiwan Strait, 2002, 21(4): 431—438

[21]Yang X L. Advance on fish immunology research [J].Journal of Fisheries of China, 1989, 13(3): 271—284 [楊先樂(lè). 魚(yú)類免疫學(xué)研究的進(jìn)展. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1989, 13(3):271—284]

[22]Park K C, Osborne J A, Tsoi S C,et al. Expressed sequence tags analysis of Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) liver, kidney and spleen tissues following vaccination againstVibrio anguillarumandAeromonas salmonicida[J].Fish & Shellfish Immunology, 2005,18(5): 393—415

[23]Wei Y C, Pan T S, Chang M X,et al. Cloning and expression of Toll-like receptors 1 and 2 from a teleost fish, the orange-spotted grouperEpinephelus coioides[J].Veterinary Immunology & Immunopathology, 2011, 141(3—4):173

[24]Milevmilovanovic I, Long S, Wilson M,et al. Identification and expression analysis of interferon gamma genes in channel catfish [J].Immunogenetics, 2006, 58(1): 70—80

[25]Sonia T A, Rekha M R, Sharma C P. Bioadhesive hydrophobic chitosan microparticles for oral delivery of insulin:In vitro characterization and in vivo uptake studies [J].Journal of Applied Polymer Science, 2011, 119(5): 2902—2910

[26]Sonaje K, Lin K J, Wang J J,et al. Self-assembled phsensitive nanoparticles: a platform for oral delivery of protein drugs [J].Advanced Functional Materials, 2010,20(21): 3695—3700

[27]Sarmento B, Ribeiro A, Veiga F,et al. Alginate/chitosan nanoparticles are effective for oral insulin delivery [J].Pharmaceutical Research, 2007, 24(12): 2198—2206

[28]Wang C, Wang L W, Shi X Y,et al. Advances in applications of chitosan-sodium alginate microsphere to drug carriers for microparticulated systems [J].Progress in Modern Biomedicine, 2014, 14(16): 3174—3176 [汪程,汪令偉, 史曉宇, 等. 海藻酸鈉殼聚糖微球作為藥物載體的研究進(jìn)展. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 14(16): 3174—3176]