衛(wèi) 晴 鄭凌凌 盧 哲 胡麗麗 宋立榮

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微藻是一類單細胞或簡單多細胞光合自養(yǎng)型生物, 其數(shù)量多、分布廣、生長快、繁殖周期短,因而能高效固定CO2并釋放氧氣, 平均1 kg藻細胞干重可固定1.8 kg CO2。微藻不僅是高效固定CO2的“工廠”, 藻體還可作為生物能源、食物、飼料、生物活性提取物等原料為人類所用[1]。隨著能源危機和環(huán)境惡化, 利用微藻減排已成為國際CO2減排和新能源開發(fā)領(lǐng)域的前沿研究熱點和高技術(shù)競爭點[2]。工業(yè)排放廢氣中CO2濃度往往高達10%—15%(v/v)[3], 因此, 篩選能夠有效利用高濃度CO2的優(yōu)良藻種是實現(xiàn)微藻減排的關(guān)鍵。在微藻培養(yǎng)過程中, CO2供給濃度會影響培養(yǎng)液中無機碳的組成, 從而影響藻株對無機碳利用的機制和生長情況。研究表明, 不同藻種對CO2的適應(yīng)性不同, 如:小球藻Chlorellasp.和微擬球藻Nannochloropsis oculata在高于5% CO2(v/v)條件下生長受到抑制[4]。相反地, 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii在5%CO2(v/v)條件下的最大比生長速率是空氣組的2倍[5]。

在自然環(huán)境下, CO2在水中的擴散速度慢, 僅有空氣中的萬分之一[6]。此時, 藻類為適應(yīng)水體中的低濃度CO2環(huán)境并保持較高的光合作用速率, 形成一種CO2濃縮機制(CO2Concentrating Mechanisms,CCM)。一般而言, 微藻在低碳條件下開啟CCM,表現(xiàn)為K0.5(DIC)顯著降低[7]。CA是CCM的重要組成之一, 根據(jù)其位置分布可分為胞外和胞內(nèi)CA。真核藻類可能存在胞外CA, 其催化介質(zhì)中與CO2之間的快速轉(zhuǎn)化, 從而保證CO2/向胞內(nèi)高效運輸。嗜酸衣藻Chlamydomonas acidophila能夠檢測到胞外CA活性, 且在低碳條件下胞外CA活性顯著增高[8]。但胞外CA并不是絕對必需的, 主要與藻種相關(guān), 如: 小球藻Chlorella vulgaris細胞無法檢測到胞外CA活性[9]。微藻的胞內(nèi)CA主要催化胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為CO2, 從而為Rubisco供應(yīng)充足的CO2, 藻細胞胞內(nèi)CA活性降低后, 盡管胞內(nèi)無機碳仍有大量積累, 但是光合作用顯著下降[10]。

藻細胞吸收無機碳后, 通過Calvin-Benson循環(huán)(卡爾文循環(huán))固定CO2, 最終轉(zhuǎn)化為有機物儲存。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(D-ribulose 1,5-biphosphate carboxylase, 簡寫為Rubisco, EC 4.1.1.39)是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶, 它催化1分子二磷酸核酮糖(RuBp)與1分子CO2結(jié)合產(chǎn)生2分子3-磷酸甘油酸(PGA)。該反應(yīng)是光合固碳的限速步驟, 決定著光合作用產(chǎn)物的積累。與一般的酶相比, Rubisco具有2個顯著特征: 一是非專一性, 即Rubisco能同時催化羧化反應(yīng)和加氧反應(yīng); 二是低效性[11], 這也是藻株誘導(dǎo)CCM的另一個重要原因。CO2不僅是Rubisco催化的底物, 還是Rubisco的活化劑和活性調(diào)節(jié)因子[12]。大量報道表明, CO2濃度會影響Rubisco的特性及其蛋白的合成[13—15], 了解CO2供給濃度對微藻Rubisco的影響, 有助于更好把握微藻的生長特性。

本研究以篩選用于耦合煙道氣CO2減排的戶外規(guī)模培養(yǎng)的潛在優(yōu)良藻種為出發(fā)點, 比較小球藻FACHB-1580和柵藻FACHB-1618在不同CO2供給條件下的生長和生理響應(yīng)。試圖闡述與無機碳利用相關(guān)生理參數(shù)和微藻利用CO2能力的關(guān)系, 并探索有效表征微藻固定CO2能力的生理指標, 從而為高效固碳優(yōu)良藻種的篩選和評價提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)條件

實驗用到的柵藻(Scendesmussp. FACHB-1618)和小球藻(Chlorellasp. FACHB-1580)均來自中國科學(xué)院淡水藻種庫(FACHB-Collection, Wuhan,China)。

培養(yǎng)裝置為內(nèi)徑5 cm, 有效體積750 mL的柱狀光生物反應(yīng)器, 培養(yǎng)條件為: BG11無碳培養(yǎng)基[16](去除Na2CO3, 以同等摩爾Na+濃度的NaCl代替), 初始光照強度約為50 μmol/(m2·s), 依據(jù)藻細胞密度進行調(diào)節(jié), 持續(xù)光照, 溫度(25±2)℃。

通氣條件為0.04%、5%和20% CO2(v/v)三組,每組3個平行, 氣體流量為200 mL/min, 連續(xù)通氣。不同濃度CO2由空氣和純CO2混合而成, 用CO2測定儀(MS400, Eranntex, Shenzhen, China)測定CO2濃度。藻液初始接種濃度為A680=0.3±0.1, 培養(yǎng)周期17d。

1.2 生物量測定

生物量以藻細胞干重(Dry Weight, DW)表示,接種后每2—3d取5 mL藻液, 用玻璃纖維濾膜(1.2 μm,Whatman GF/C, GE Healthcare, Chicago, IL, USA)過濾。過濾前后, 濾膜在105℃, 2h烘干至恒重, 稱重并記錄重量依次為W0(g),Wt(g)。相關(guān)計算公式如下:

其中,X1和X2分別是生長對數(shù)期的藻株在t1和t2時間下的干重,CC表示微藻細胞的平均含碳量[1],P表示生物量產(chǎn)率,和MC分別表示CO2分子和C元素的分子量。

1.3 表觀無機碳親和力常數(shù)K0.5(DIC)的測定

收集對數(shù)生長期藻細胞, 去上清, 重懸于預(yù)備的無碳緩沖液BG11-BTP(pH 8.0)[17]中, 用該緩沖液清洗細胞3次。清洗后的細胞液取出一部分測定葉綠素; 另外取出2 mL置于液相氧電極(Chlorlab2,Hansatech Instruments Ltd., Norfolk, UK)反應(yīng)槽內(nèi),在飽和光強500 μmol/(m2·s)下, 利用藻細胞光合固碳作用使胞內(nèi)無機碳枯竭, 當藻細胞光合放氧速率幾乎為零時, 通過微量進樣器從加樣孔加入不同量的NaHCO3溶液, 測定藻細胞光合放氧速率。藻株對無機碳的親和力用無機碳半飽和常數(shù)K0.5(DIC)(即光合作用速率達到一半時的無機碳濃度)來表征, 并通過方程V=Vmax[DIC]/(K0.5+[DIC])對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合后求得[18]。

1.4 Rubisco活性測定

收集對數(shù)期藻液(干重約20 mg), 5000 r/min,25℃離心5min, 去上清后用pH 7.5 Tris-HCl清洗兩遍。在4℃條件下, 加900 μL提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 1 mmol/L EDTA pH 8.0, 10 mmol/L MgCl2, 12% (v/v) Glycerol, 1% (w/v) PVP 40, 2.5 mmol/L DTT), 將細胞轉(zhuǎn)移到2 mL凍存管中, 并加入0.5 g玻璃珠/鋯珠(直徑0.5 mm); 利用低溫細胞破碎儀(Gene Ready, Bioeer, Beijing, China)破碎細胞后,12000 r/min, 4℃離心10min, 上清即Rubisco粗提液。粗提液一部分直接用于初始Rubisco活性的測定, 一部分需用活化液(33 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,0.67 mmol/L EDTA, 33 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L NaHCO3)活化后測定總的Rubisco活性[19]。Rubisco的活化度為初始Rubisco活性與總的Rubisco活性的比值。

利用分光光度計法測定Rubisco活性[20], 并根據(jù)催化反應(yīng)過程中所消耗的NADH的量來計算該酶活性[21], 測定溫度均為30℃。具體方法是: 取5 μL粗提液/活化酶液加入187 μL反應(yīng)液(50 mmol/L HEPES-KOH pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0, 20 mmol/L MgCl2, 2.5 mmol/L DTT, 10 mmol/L NaHCO3,5 mmol/L ATP, 5 mmol/L Phosphocreatine, 0.2 mmol/L NADH, 10 U/mL PGK, 10 U/mL GADPH, 10 U/mL PCK)中, 最后加入8 μL 50 mmol/L RuBp, 使其終濃度達到2 mmol/L。立即測定A340的變化, 每30s測一次, 連續(xù)10min, 計算A340的變化率。采用氨基黑方法[22]測定粗提液中蛋白質(zhì)含量。

酶比活力: U=10×ΔA340/6.22/2 (mg pro)

1.5 CA活性測定

收集對數(shù)期的藻細胞(干重約20 mg), 用20 mmol/L巴比妥鈉(CAS:144-02-5)緩沖液(pH 8.3)清洗藻細胞兩遍并重懸; 重懸液直接用于胞外CA活性測定,總的CA活性用低溫細胞破碎儀(Gene Ready, Bioeer, Beijing, China)破碎細胞后測定, 胞內(nèi)CA活性即總的CA與胞外CA活性的差值。

采用量電法[23]測定CA活性。取緩沖液清洗過的細胞液測定葉綠素含量, 利用甲醇加熱法[24]提取葉綠素a。計算方法如下:

CA酶活性: EU=10×(T0/T-1)/(μg Chl.a)

T0: 不含CA的巴比妥鈉緩沖液pH從8.30降到7.30的時間(對照組);

T: 含有CA的巴比妥鈉緩沖液pH從8.30降到7.30的時間(實驗組)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示, 利用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異, 顯著水平為P＜0.05, 極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下生長的比較

兩株綠藻均在5% CO2(v/v)條件下獲得最大生物量積累、最大比生長速率和最大CO2固定速率。

經(jīng)通氣培養(yǎng)17d后, 小球藻FACHB-1580和柵藻FACHB-1618最大生物量達到3.5和5.4 g/L(圖1), 分別是空氣組的1.41和1.46倍。兩株綠藻最大固碳速率和最大比生長速率分別是563.7和660.9 mg/(L·d),0.78和0.57/d(表 1)。同時, 兩株綠藻均能適應(yīng)20%CO2(v/v)條件, 該條件下的比生長速率與0.04%CO2(v/v)組相比分別增加83%和22%, 且該條件下小球藻FACHB-1580的生物量顯著高于0.04% CO2(v/v)組(P＜0.05)。

圖1 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)下的生物量積累(平均值±標準差)Fig. 1 Biomass of two strains under different CO2 concentrations(Mean±SD)

表 1 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下的生長參數(shù)(平均值±標準差)Tab. 1 Growth parameters of two strains under different CO2 concentrations (Mean±SD)

2.2 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下無機碳親和力的比較

圖2表示兩株綠藻在飽和光強500 μmol/(m2·s)條件下的無機碳吸收曲線, 吸收曲線反應(yīng)它們在不同濃度CO2培養(yǎng)條件下最大光合放氧速率變化不大。但它們的表觀無機碳親和力常數(shù)K0.5(DIC)均隨著CO2濃度增加而增高(圖3)。小球藻FACHB-1580的K0.5(DIC)分別為50.6、174.6和344.8 μmol/L,20% CO2(v/v)組的K0.5(DIC)是0.04% CO2(v/v)組的6.8倍; 柵藻FACHB-1618的K0.5(DIC)分別為190.6、443.9和498.1 μmol/L, 20% CO2(v/v)組的K0.5(DIC)是0.04% CO2(v/v)組的2.6倍(表 2)。另外,在同等條件下, 小球藻FACHB-1580的K0.5(DIC)值均低于柵藻FACHB-1618, 即在同等條件下小球藻FACHB-1580的無機碳親和力高于柵FACHB-1618。

2.3 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下CA活性的比較

小球藻FACHB-1580存在胞外CA, 其活性隨CO2濃度增加顯著降低; 而柵藻FACHB-1618胞外CA活性極低(≤ 3.6 EU/mg Chl.a), 5%和20% CO2(v/v)條件下幾乎為零(圖4)。另外, 小球藻FACHB-1580的胞內(nèi)CA活性較高, 且隨CO2濃度增加其活性顯著降低(P＜0.01)。其中在0.04% CO2(v/v)條件下胞內(nèi)CA活性為540.0 EU/(mg Chl.a), 是20% CO2(v/v)組的5.4倍。小球藻FACHB-1580高活性的胞內(nèi)CA為Rubisco提供了充足的CO2來源。相比而言,柵藻FACHB-1618胞內(nèi)CA活性較低, 隨著CO2濃度的變化, 其活性變化不明顯。

圖2 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下的P-C曲線圖Fig. 2 P-C curve of two strains under different CO2 concentration A. Chlorella sp. FACHB-1580; B. Scenedesmus sp. FACHB-1618

2.4 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下Rubisco活性的比較

隨著CO2濃度的增加, 兩株綠藻初始Rubisco活性和Rubisco活化度均有下降趨勢(圖5、圖6), 而總的Rubisco活性無明顯變化。在0.04%、5%和20% CO2(v/v)下, 小球藻FACHB-1580的初始Rubisco活性分別為0.56、0.4和0.27 μmol CO2/(mg pro·min), 對應(yīng)Rubisco活化度分別為43%、22%和20%; 柵藻FACHB-1618的初始Rubisco活性分別為0.68、0.58和0.49 μmol CO2/(mg pro·min), 對應(yīng)Rubisco活化度分別為31%、30%和19%。20% CO2(v/v)條件下, 兩株綠藻初始Rubisco活性及Rubisco活化度與0.04% CO2(v/v)組相比均顯著降低(P＜0.05)。

圖3 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下的K0.5 (DIC)比較(平均值±標準差)Fig. 3 K0.5 (DIC) of two strains of algae under different CO2 concentrations (Mean±SD)

表 2 兩株綠藻在不同濃度CO2培養(yǎng)條件下無機碳親和力常數(shù)K0.5 (DIC)、最大光合放氧速率Vmax的比較(平均值±標準差)Tab. 2 K0.5(DIC) and the maximum photosynthesis rate of two strains under different CO2 concentrations (Mean±SD)

3 討論

大量研究表明, 和空氣條件相比, CO2供給濃度的增加, 往往能夠促進藻細胞快速生長[26,27]。然而,持續(xù)高濃度CO2的通入會迅速降低溶液pH, 可能抑制相關(guān)酶活性[27]。大多數(shù)藻株適宜生長的CO2濃度范圍是0.038%—10%(v/v)[28]。小球藻(Chlorellasp.)只能在低于2% CO2(v/v)條件下生長[4]。少數(shù)藻種, 如: 微擬球藻(Nannochloropsissp.)在15% CO2(v/v)條件下比生長速率為0.52/d, 相比空氣條件提高58%[26]。在本文研究中, 小球藻FACHB-1580和柵藻FACHB-1618均在5% CO2(v/v)條件下有最大生物量積累、最大比生長速率, 及最大CO2固定速率。在20% CO2(v/v)條件下, 它們的比生長速率與0.04% CO2(v/v)組相比分別增加83%和22%, 表明實驗所用兩株綠藻均能適應(yīng)體積比高達20%的CO2供給條件并高效固定CO2用于生物量積累。盡管柵藻FACHB-1618的生物量高于小球藻FACHB-1580, 但從比生長速率來看, 小球藻FACHB-1580對20% CO2(v/v)條件的適應(yīng)性更強。

不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下藻株的生長與其對培養(yǎng)液中無機碳的利用機制緊密相關(guān)。已有研究表明, 微藻通常在低碳條件下開啟CCM, 高碳條件下CCM受抑制[29], 表現(xiàn)為表觀無機碳親和力常數(shù)增加, 即無機碳親和力顯著下降[30,31]。聚球藻Synechococcussp.在2% CO2(v/v)條件下K0.5(DIC)與0.35% CO2條件相比升高了20倍[32]; 集胞藻Synechocystissp.在2% CO2(v/v)條件下的K0.5(DIC)是0.02% CO2條件的5.4倍[33]。在本實驗中, 兩株綠藻的K0.5(DIC)值均隨CO2供給濃度的增加而升高(圖4), 該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

圖4 兩株綠藻在不同CO2條件下胞外(CAext), 胞內(nèi)(CAint)CA活性(平均值±標準差)Fig. 4 CA activity of algae under different CO2 concentration(Mean±SD)

圖5 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下Rubisco活性(平均值±標準差)Fig. 5 Rubisco activity of two strains under different CO2 concentration (Mean±SD)

圖6 兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下Rubisco活化度(平均值±標準差)Fig. 6 Rubisco activation rate of two strains under different CO2 concentration (Mean±SD)

真核藻類葉綠體的存在使細胞內(nèi)的分室增加,因而CCM的運行機制比藍藻更為復(fù)雜。不同藻種的CCM運行機制不同, 主要體現(xiàn)在無機碳泵的種類和位置, CO2濃度提高的部位和機制以及CA的分布這3個方面[34]。在本研究中, 小球藻FACHB-1580存在胞外CA活性, 而柵藻FACHB-1618胞外CA活性極低。研究表明, 只有胞內(nèi)CA活性的藻株, 主要吸收CO2; 而胞外CA活性較高的藻株, 能夠同時吸收和CO2[35]。由此推測: 柵藻FACHB-1618主要吸收介質(zhì)中的CO2, 而小球藻FACHB-1580能同時吸收和CO2。隨著CO2供給濃度的增加,小球藻FACHB-1580胞外和胞內(nèi)CA活性均顯著降低(P＜0.01)。Swarnalatha等[36]分離的3株淡水藻種也有相似結(jié)果, 通CO2條件下測得的胞外CA活性相比空氣條件下降77%—96%。威氏海鏈藻Thalassiosira weissflogii和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum的胞外和胞內(nèi)CA活性同樣在高濃度CO2條件下降低[37]。大量研究表明CO2濃度升高對CA活性有明顯抑制作用[38,39], 這是因為CA在微藻利用過程中具有重要作用[40]。由此進一步證明小球藻FACHB-1580能同時利用和CO2; 并且隨著CO2濃度的增加, 藻株對的利用能力降低, 對CO2的利用能力逐漸增強。

綜上, 本研究較全面地探討了兩株綠藻在不同濃度CO2通氣培養(yǎng)條件下的生長和生理特性的響應(yīng), 對今后藻種的篩選和評價具有一定指導(dǎo)意義。同時, 本研究的兩株藻種均能夠高效利用CO2, 有望成為耦合煙道氣減排的戶外規(guī)模培養(yǎng)的潛在優(yōu)良藻株。但是, 本研究結(jié)果還不足以形成有效地指征藻株對CO2利用能力的評價體系。為此, 我們需要結(jié)合煙道氣的特點, 進一步探討藻株對煙道氣中有毒氣體(SOx/NOx)、粉塵等因素的耐受能力。并將實驗室所選藻株在室外進行擴大培養(yǎng), 得到更多藻株戶外大規(guī)模培養(yǎng)的生長、生理參數(shù)等。

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